DNA分子标记研究进展_黄映萍
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原
桃分子标记研究进展
桃分子标记研究进展 Peach molecular mark research development XXX 园艺学院 摘要桃在我国已有几千年的栽培历史，在我国水果市场中占有非常重要的地位。但由于其耐贮性差，一直以来都是育种工作者进行品种改良的重要目标。但其常规杂交后代单株占地面积大, 播种后3～4 a 才能开花结果, 养护费用高, 育种周期长、效率低。 本文从桃的基因定位、遗传图谱的构建进行总结探索，将对其育种改良工作有推动和指导作用。 关键词桃分子标记基因定位遗传图谱问题及展望 Abstract th e peach has been planted for a long history in our country.It is very important in the fruit-market in our country . But because not able to bear a longtime store,It has been an important target for the breeder to improve the peach cultivar for a long time.But the conventional hybrid generation takes up a large field,blossoms three to four years after breeded,needs a high cost care.It takes a long time breeding cycle but with a low efficiency.This article summarises from the construction of the peach’s genetic mapping and explores it. That Will have impetus and instruction function to the breeding improvement work of peach. Keyword peach, molecular mark, genetic mapping construction ,problems and forecast 桃属于蔷薇科( Rasaceae) 桃属( Prunus) ,是我国最古老的果树树种,栽培历史悠久,分布十分广泛,是我国重要的果树种类。桃是自花授粉果树, 许多重要的经济性状属于单基因控制的质量性状,它的染色体数目少(2n = 16) ,基因组小,含有0. 30 ±0. 02PgDNA ,大约有3. 0 ×108bp。只有拟南芥基因组的两倍,是最适合进行遗传学研究的多年生果树之一。 分子标记是近年发展起来的一种较理想的遗传标记形式。如限制性片段长度多态性( R FL P) 、随机扩增多态性(RAPD) 、扩增片段长度多态性(AFLP) 、简单重复序列(SSR) 、测定序列标签位点( STS) 、序列特异性扩增区域(SCAR) 、表达序列标签( EST) 、简单序列长度多态性(SSL P) 、微卫星DNA(MS) 、数量可变串联重复(VNTR) 等,已广泛应用于制作遗传连锁图谱、基因标记定位和克隆、种质鉴定、分子标记辅助选择、遗传多样性分析等多种研究领域。 1 分子标记技术在桃种质资源研究上的应用 目前,国家非常重视种质资源的收集、保存和利用工作。随着现代分子生物学发展,分子标记为种质资源的亲缘演化、分类、种质保存等研究工作提供了有力的依据,使其能更有效的保护、利用果树种质资源。 1. 1 桃属种的系统发育和分类 桃品种依果实特性分为普通桃、油桃、蟠桃，依用途可分为鲜食桃、加工桃及观赏桃，依果肉色泽分白肉桃、黄肉桃，依成熟期早晚可分为极早熟、早熟、中熟、晚熟和极晚熟桃（果实发育期分别为80天以下、80~100d、100~120d、120~150d、150d以上）[ 1 ]。有些学者将桃属分为6 个种,即普通桃、新疆桃、甘肃桃、光核桃、山毛桃、陕甘山桃,其中蟠桃、油桃、寿星桃是普通桃的变种。随着分子标记在种质资源研究中的大量应用,对桃种质资源的分类有了新的认识。杨英军对普通桃、新疆桃、山桃、甘肃桃及部分品种、变种进行多态性分析,新疆桃被归入普通桃中,推测它起源于普通桃。程中平等[ 2 ]也发现新疆桃是普通桃
DNA分子标记技术及其应用
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
分子标记技术综述
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
分子标记在番茄抗性育种研究进展
分子标记在番茄抗性育种中研究进展 摘要：本文综述了近年来RFLP RAPD SSA AFLP CAPS和SNP分子标记技术在番茄抗性育种上的应用，分析了目前的研究进展，对今后研究的重点进行了讨论。 关键词：分子标记；番茄；抗性；进展。 Molecular marker in tomato resistance breeding research progress in Abstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breeding, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed. Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress. 番茄既是蔬菜也是水果, 其中含有丰富的维生素C对心血管有良好的保护作用；番茄红素具有良好的抗氧化作用,能清除体内废物,增加免疫力。它也是营养师大力提倡的减肥食品。它早已成为人们日常生活中的不可缺少的食物。 随着遗传学的发展,遗传标记的种类和数量也在不断增加。形态标记、细胞学标记、生化标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限
分子标记技术
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
杨树分子标记研究进展
第22卷 第6期2000年11月 北 京 林 业 大 学 学 报 JO UR NAL OF BEI JI NG F OREST R Y U N IV ERSIT Y Vol.22,N o.6Nov.,2000 2000 07 10收稿 http://w w https://www.360docs.net/doc/5418775703.html,/periodi cal/bjlydxxb/ * 九五 国家攻关课题(96 011 02 04 02)的部分内容 杨树分子标记研究进展* 张德强 张志毅 (北京林业大学毛白杨研究所,100083,北京;第一作者男,26岁,博士生) 杨 凯 (中国农业科学院作物品种资源研究所,100081,北京) 摘要 该文介绍了在杨树育种中常用的三种分子标记:RF LP,RAP D 和A FL P,并综述了其在杨树指纹图谱、遗传图谱构建和数量性状基因定位等方面的研究进展. 关键词 杨树,分子标记,指纹图谱,遗传图谱,数量性状基因定位中图分类号 S792.11 Zhang Deqiang ;Zhang Zhiyi;Yang Kai.Advances of molecular marker researches in poplar.Jour nal of Beij ing For estry Univer sity (2000)22(6)79~84[Ch,33ref.]Institute of Pop ulus tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China. RFLP(restriction fragment length polymorphism ),RAPD(random amplified poly morphic DNAs)and AFLP (amplified frag ment length polymorphism)are introduced and their applications to finger prints,genetic linkage maps constructing and QT Ls mapping in poplar are review ed in this paper.Key words poplar,molecular marker,fingerprints,genetic maps,QT Ls mapping 杨树属杨柳科(Salicaceae )、杨属(Pop ulus L.),约有100多种,广泛分布于欧洲、北美和亚洲,是防护林、水土保持林、四旁绿化及人工用材林的重要树种.很多年来,虽然林木育种学家对其生理生化、解剖构造等基础性研究较深入,对于杨树的遗传改良产生了巨大的推动作用,但对于常规育种中抗病、抗虫性状、性别决定及林木早期选择育种等问题仍无法从根本上解决[1~6].因此,对杨树进行分子生物学研究迫在眉睫. 杨树种间杂交和无性繁殖容易,杨属所有种的染色体数均为2n=38,核基因组相对较小(2c= 1.1~1.2pg),便于遗传操作,并已建立较完善的遗传转化体系,获得了转基因植株.因此,杨树是公认的林木生物学基础研究中的模式树种.由于杨树种间杂交容易,在F 1代有很强的杂种优势(材积生长量),杂种的F 2代在许多性状方面可发生广泛的分离,所以大量的分离群体在F 1代或F 2代很易建成[7~ 10] .十几年来,前人利用分子标记技术对杨树 基因组进行了指纹图谱绘制、遗传图谱构建及数量 性状基因定位. 在杨树中,常用的分子标记为RFLP,RAPD 和 AFLP,它们是继形态标记(M orpholog ical markers)、细胞学标记(Cytological m arkers)和生化标记(Bio chemical markers)之后发展起来的一种以DNA 多态性为基础的新一代遗传标记.与形态标记和生化标记相比,分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的,基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的,在植物发育的不同阶段,不同组织的DNA 都可用于标记分析;分子标记不受环境影响,其变异只源于等位基因DNA 序列的差异,与不良性状无必然的连锁,不需专门创造特殊的遗传材料 [7~20] .基于上述这些优点,分子标记技术可为 杨树生产提供准确、可靠的遗传标记. 1 分子标记概述 分子标记是分子生物学发展的产物.80年代初,发展了RFLP,随后其发展极为迅速,产生了多种分子标记技术,用于杨树遗传育种的主要有以下3种. (1)RFLP RFLP(Restriction Frag ment Length Polymorphisms)指限制性片段长度多态性,是杨树遗传育种中使用较多的一种分子标记[21~ 25] .
DNA分子标记及其优缺点
DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要： 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams
SSR分子标记的开发技术研究进展
文章编号:1001-4829(2002)04-0106-04 收稿日期:2002-09-23 作者简介:唐荣华(1965-),男,广西人,副研究员,在职博士生。主要从事生物工程及经济作物研究。 SSR 分子标记的开发技术研究进展 唐荣华1,张君诚2,吴为人2 (11广西农业科学院经济作物研究所,广西南宁 530007;21福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002) 摘 要:综述简单重复序列标记(SSR )的特点及在作物遗传图谱构建、品种鉴定及分子标记辅助育种等方面的应用价值。重点描述开发SSR 标记的两种方法的基本原理和主要步骤,一种是通过克隆酶切片段和大量测序寻找SSR 标记的传统方法,一种是应用 SA GE 原理不需要克隆的STMP 技术。介绍这两种方法在创建小麦或大豆SSR 标记中的应用。它们都能有效地开发可扩增出特 定位点SSR 的PCR 引物。关键词:SSR ;分子标记;引物开发中图分类号:S188 文献标识码:A Progress in the w ay to develop SSR molecular marker TAN G Rong 2hua 1,ZHAN G J un 2cheng 2,WU Wei 2ren 2 (1.Research Institute of Cash Crops ,Guangxi Academy of Agricultural Sciences ,Nanning Guangxi 530007,China ;2.College of Crop Science ,Fujian Agriculture &Forestry University ,Fuzhou Fujian 350102,China ) Abstract :The characteristics of simple sequence repeats (SSR )and its importance in genetic mapping ,variety identifying and molecular marker 2assistant breeding ,etc ,are discussed in this article.And two ways which can develop SSR molecular markers with their basic princi 2ples and main steps are also shown in this article.One is the traditional way which needs a great number of cloning of enzyme 2cut DNA fragments and a great deal of sequencing ,the another is a new way which can eliminate the cloning step and can reduce much more work of sequencing by the basic principle of serial analysis of gene expression (SA GE ).The utility of these two ways in the development of bread wheat or soybean SSR is shown.The results showed that they were effective in the designing of PCR primers to amplify locus 2specific SSR. K ey w ords :SSR ;molecular marker ;primer development 所有真核基因组中均含有一类DNA 碱基序 列,被称为微卫星(L ITT and L U T Y1989)[1]或简单重复序列(SSRs )(TAU TZ et al.1986)[2],它们均由1～6个碱基组成的基本序列串连而成,不同等位基 因间的重复数存在丰富的差异,因而是许多真核基 因组中普遍存在的遗传标记来源(WAN G et al.1994)[3]。微卫星分析的主要技术是聚合酶链式反应(PCR ),比之限制性片段长度多态性(RFL P )分析容易得多,而且易于分析自动化。在植物当中,微卫星已被证明在很多物种中是高信息量的,并且是位点特异的分子标记(C ONDIT and HUBBE LL 1991,PROV AN et al.1996,SMULDERS et al.1997)[4～6]。由于 微卫星可在多个等位基因间显示差异,因而在作物的遗传图谱构建,遗传多样性发析,亲缘关系鉴定,DNA 指纹图谱构建,品种鉴定,Q TL 分析及分子辅助育种中均具有公认的优越性及应用前景。这一分子标记的特殊性及重要性在于其有以下特征:①均匀,随机,广泛地分布于水稻、大麦、小麦、大豆等多种作物基因组中。②SSR 序列的两侧顺序常较保守,在等位基因间多相同。③多数SSR 无功能作用,增加或减少几个重复序列的重复数不影响生物的正常生长发育,因而在品种间具广泛位点变异,比RFL P 及RAPD 分子标记更具多态性,尤其对花生、六倍体小麦等用常见分子标记技术检测不出很多DNA 片段多态性的作物品种来说,具有更大的研究价值和应用前景。④呈孟德尔式遗传,共显性,因而对个体鉴定具特殊意义。⑤仅需微量组织,即便DNA 降解,也能有效地分析鉴定。⑥虽然开始筛选 601西 南 农 业 学 报 Southwest China Journal of Agricultural Sciences 2002年15卷4期 Vol 115 No 14
SRAP和ISSR分子标记研究进展
SRAP与ISSR分子标记的研究进展 摘要：SRAP与ISSR等分子标记技术已广泛应用到科研工作中。本文简单的介绍SRAP与ISSR的原理、功能、应用以及对使用分子标记技术揭示生物菌的作用机理进行了展望。 DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它能直接反映基因组DNA间的差异，是继形态学标记、细胞学标记及生化标记之后，近年来广泛应用的一种新的遗传标记。近年来,随着DNA 标记技术的研究日渐成熟,其应用也日益广泛。目前,各种分子遗传标记技术在科研中的应用已深入开展，为种质资源的鉴定、基因的定位与克隆、数量性状位点的遗传分析、遗传多样性评估、物种起源和分子标记辅助育种等遗传研究提供了有价值的工具。目前常用的分子标记有RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR 、SRAP等。 1 SRAP分子标记的发展与应用 1.1 SRAP分子标记的发展 SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)即相关序列扩增多态性是一种基于PCR 的新型标记，由美国加州大学作物系Li和Quiros博士提出的序列相关扩增多态性(sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP)。SRAP 技术是与RAPD 技术相似的一种标记技术，即SRAP 可用一对引物，但所用的引物是在SSR 的基础上设计的。SRAP 标记原理是利用基因外显子里G、C 含量丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框架进行扩增。SRAP 技术是一种无需任何序列信息即可直接PCR 扩增的新型分子标记技术。 SRAP分子标记技术具有重复性强、简便、易于分离条带和测序、中等产量高、高共显性、便于克隆测序目标片段等特点,目前SRAP 标记已在植物遗传多样性检测、遗传图谱构建、重要基因定位、品种鉴定和种子纯度检测上得到了广泛应用，而在真菌界的应用相对较少。 2.2 SRAP 分子标记的应用
综述-分子标记
分子标记 遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。 一、分子标记的概念 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。 二、分子标记的特点 理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。 目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。 三、分子标记的分类 分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。基于PCR技术的分子标记技术又可分为基于随机引物的PCR分子标记技术（或叫非特异PCR分子标记技术）和基于特异引物的PCR分子标记技术（或叫特异PCR分子标记技术）。随着分子标记技术的不断发展，许多新兴分子标记技术的出现，人们又根据分子标记的基因组来源将分子标记技术分为随机DNA分子标记（Random DNA Markers，RDM）、目的基因分子标记（Gene Targeted Markers，GTM）和功能性分子标记(Functional Markers，FM)。 1、限制性片段长度多态性标记 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）由Grodzicker等人于1974年基于DNA被限制性内切酶酶切后形成特定大小的片段。其优点在于：1、广泛存在；2、共显性，可区分纯合与杂合；3、结果稳定可靠，重复性好。正是有了这些优点，RFLP作为最早出现的分子标记方式，曾被广泛应用。但由于其在使用时需要用放射性同位素标记、酶切时对DNA质量要求高、标记的多态性变异程度偏低等原因，使得RFLP很快就被新的分子标记所替代。 2、随机扩增多态性DNA标记 随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以基因组DNA 为模板，以人工合成的随机引物，通过PCR 扩增反映扩增片段的DNA片段导入、缺失以及引物结合位点上的碱基突变。RAPD只需合成一套引物，就可可用于不同生物基因组的分析；RAPD技术简便易行，省力省时，并且检测灵敏方便；RAPD分析所需样品DNA量极
分子标记技术的种类Word版
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来