激光共聚焦显微镜样品制备方法(一)

第２期余礼厚：激光共聚焦显微镜样＾＾制备疗法（～）——细胞培养样品１８７

图１激光共聚焦显微镜样品的扫描结果。ｕ２０ｓ细胞中表达绿色荧光融合的Ｐａｘｉｌｌｊｎ蛋白（ＧＦＰ．Ｐａｘｉｌｌｉｎ），经过免疫荧光抗体标记制备样品后，在ＬｅｉｃａｓＰ２激光共聚焦显微镜卜进行亍１描。使用鼠源的ＶｉｎｃｕＩｉｎ抗体标记细胞内的粘着斑（ｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎ，ＦＡ），并用抗鼠源的Ａｌｅｘａ击４７标｝己的二抗染色，以及ＤＡＰｌ和Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ—ＴＲＩＴｃ分别标记细胞核和Ｆ—ａｃｔｉｎ。ａ—ｄ：使用激光共聚焦显微镜扫描样品得列的结果。并分别用绿色、

红色、蓝色和白色来显示结果；ｅ：扫描图片的叠加。Ｂａｒ＝２０“ｍ

Ｆｉｇ．１Ｃｏｎｆｏｃａｌｉｍａｇｅｓｏｆｓａｍｐｌｅ．ＣｕｌｔｕｒｅｄＵ２０ＳｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＧＦＰ—Ｐａｘｉｌｌｉｎａｎｄｗｅｒｅｆｉｘｅｄ．

ＴｈｉｓｓａｍｐｌｅｗａｓｓｃａｎｎｅｄｏｎＬｅｉｃａＳｌ’２ｃｏｎｆｏｃａｌｍｊｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｖｉｎｃｕｌｉｎｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎｉｎ

ｃｅＵｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ?ＶｉｎｃｕｌｉｎｍＡｂｗｉｔｈｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｗｉｔｈＡｌｅｘａ一６４７．Ａｎｄｎｕｃｌｅｕｓ

ａｎｄＦ?ａｃｔｉｎｗｅｒｅｄｅｃｏｒａｔｅｄｗｉｔｈＤＡＰＩａｎｄＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ?ＴＲＩＴＣ，ｒｅｓｐｅｃ“ｖｅｌｙ．ａ～ｄ：Ｉｍａｇｅｓｗｅｒｅｓｃａｎｎｅｄｂｙ

ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｇｒａｙｓｃａｌｅｉｍａｇｅｓｗｅｒｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄｔｏｐ８ｅｕｄｏｃｏｌｏｒｗｉｔｈｇｒｅｅｎ，ｒｅｄ，ｂＩｕｅａｎｄｗｈｉｔｅ；

ｅ：Ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｉｍａｇｅｓ．Ｂａｒ＝２０仙ｍ

５４６、Ａｌｅｘａ－５６１、Ｃｙ３、ＴＲＩＴＣ和Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ等染料；６３３ｎｍ激光器可观察Ａｌｅｘａ一６４７和ｃｙ５等染料。当研究者需要使用Ｅ述染料进行多重标记时，要考虑各种抗体的来源，需要使用不同种属来源的抗体进行染色。例如，可使用如下的组合进行细胞标记：ＤＡＰｌ标记细胞核、ＧＦＰ融合蛋白标记日的蛋白、Ａｌｅ柚．５６１标记抗鼠源抗体和Ａｌｅｘａ＿６３３标记抗兔源抗体。此外除了使Ｊ｝｛抗体标记细胞外，还可以使用荧光染料标记的化合物标记细胞内的一些细胞结构和细胞器，如Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ标记Ｆ—ａｃｔｉｎ；ＥＲ—ｔｒａｃｋｅｒ标记内质网；Ｍｉｔｏ—ｔｒａｃｋｅｒ标记线粒体；Ｌｙｓｏ—ｔｒａｃｋｅｒ标记溶酶体等，这些荧光染料染色同抗体一起组合使用，可使得多重标记变得更容易（图１）。

总之，由于生物体内的蛋白存在多样性，在制备免疫荧光样品的过程中应根据蛋白的具体特征，不同的蛋白选择合适的方法，这样才能准确地观察到蛋白质在细胞内的功能和动态变化。

参考文献：

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激光共聚焦显微镜样品制备方法(一)——细胞培养样品

作者：余礼厚， YU Li-hou

作者单位：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海,200031

刊名：

电子显微学报

英文刊名：JOURNAL OF CHINESE ELECTRON MICROSCOPY SOCIETY

年，卷(期)：2010,29(2)

被引用次数：1次

参考文献(4条)

1.单永立.李艳.朱学良绿色荧光蛋白--照亮生命科学的一盏明灯 2008(6)

2.奥斯伯F M.金斯顿R E.赛德曼J G.等著.马学军.舒跃龙精编分子生物学实验指南(第Ⅳ版中译版) 2005

3.莎姆布鲁克J.黄培堂分子克隆实验指南 2002

4.Snapp E Design and use of fluorescent fusion proteins in cell biology 2005

引证文献(1条)

1.边玮激光共聚焦显微镜样品制备方法(二)——组织切片样品[期刊论文]-电子显微学报 2010(4)

本文链接：https://www.360docs.net/doc/658818292.html,/Periodical_dzxwxb201002015.aspx