微生物药物合成生物学研究进展_武临专

微生物药物合成生物学研究进展

武临专, 洪斌*

(中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 卫生部抗生素生物工程重点实验室, 北京 100050)

摘要: 微生物次级代谢产物结构复杂多样, 具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等多种生物活

性, 是微生物药物开发的源泉。当前, 微生物药物研究面临一些挑战: 快速发现结构新颖、生物活性突出的化合

物; 理性化提高产生菌的发酵效价; 以及以微生物为新宿主, 实现一些重要天然药物的工业生产。合成生物学是

在系统生物学和代谢工程等基础上发展起来的一门学科。本文对合成生物学在发现微生物新次级代谢产物、提

高现有微生物药物合成水平和创制微生物次级代谢产物方面的研究进展进行了阐述。

关键词: 微生物药物; 合成生物学; 次级代谢产物; 生物合成

中图分类号: Q939.9; Q81; R914.5 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2013) 02-0155-06

Synthetic biology toward microbial secondary

metabolites and pharmaceuticals

WU Lin-zhuan, HONG Bin*

(Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics of Ministry of Health, Institute of Medicinal Biotechnology, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China)

Abstract: Microbial secondary metabolites are one of the major sources of anti-bacterial, anti-fungal, anti- tumor, anti-virus and immunosuppressive agents for clinical use. Present challenges in microbial pharmaceutical development are the discovery of novel secondary metabolites with significant biological activities, improving

the fermentation titers of industrial microbial strains, and production of natural product drugs by re-establishing

their biosynthetic pathways in suitable microbial hosts. Synthetic biology, which is developed from systematic biology and metabolic engineering, provides a significant driving force for microbial pharmaceutical development.

The review describes the major applications of synthetic biology in novel microbial secondary metabolite discovery, improved production of known secondary metabolites and the production of some natural drugs in genetically modified or reconstructed model microorganisms.

Key words: microbial pharmaceuticals; synthetic biology; secondary metabolites; biosynthesis

来源于微生物的药物称为微生物药物 (microbial medicine, microbial pharmaceuticals), 主要包括来源于微生物(特别是放线菌和真菌) 次级代谢产物的药物。

收稿日期: 2012-09-25; 修回日期: 2012-11-01.

基金项目: 国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目(2012ZX09301002-001-016); 国家自然科学基金资助项目

(31170042, 81172964).

*通讯作者 Tel: 86-10-63028003,

E-mail: binhong69@https://www.360docs.net/doc/6a14208762.html,, hongbin@https://www.360docs.net/doc/6a14208762.html,

微生物药物例如抗生素, 在控制感染、免疫调节和治疗癌症等方面发挥了重要作用。目前, 已经从放线菌和真菌中发现了2万多种具有生物活性的次级代谢产物, 其中百余种成为微生物药物。随着对放线菌和真菌的持续开发利用, 直接从放线菌和真菌研制微生物新药难度越来越大, 主要原因在于: ①化合物排重难度很大(从微生物已经发现了25 000多种化合物); ②新微生物资源的分离培养工作没有突破性进展, 获得大量的、具有产生新次级代谢产物能

·专题报道·

力的新菌种(株) 是一项比较困难的工作[1]。

随着DNA序列分析技术的快速发展, 对微生物基因组DNA进行全序列分析逐渐成为实验室常规工作。已经完成的多种放线菌、真菌基因组DNA序列分析结果表明: 在这些菌株的基因组DNA中通常含有数十个编码不同结构类型的次级代谢产物生物合成基因簇, 其数量为化学证实菌株产生的次级代谢产物数量的5～10倍[2, 3], 这说明我们以前远远低估了微生物的次级代谢产物生物合成潜能, 也提示我们对次级代谢产物的化学分析与鉴别能力需要不断加强, 以早日实现微量、快速和准确之目标。宏基因组 (metagenome) DNA序列分析, 也同样发现了大量来自于未培养和难培养微生物的与次级代谢生物合成相关的基因簇序列[4]。如何将这些与次级代谢产物生物合成相关的基因簇“翻译”(转化) 为对应的次级代谢产物, 既是创新微生物药物研发中面临的一个挑战, 也是一个机遇。

在微生物药物研究中遇到的另外一个挑战是提高次级代谢产物的生物合成水平。对于已临床应用的微生物药物, 通过提高工业菌株的发酵效价, 实现增加产量、降低成本的目的。野生微生物菌株的次级代谢产物生物合成能力通常在毫克每升水平(或更低), 微生物药物工业菌株的发酵水平要求在克每升水平(或更高), 二者之间存在巨大差距。部分微生物药物如青霉素的工业菌株经过几十年随机与定向诱变育种, 实现了较高的发酵水平 (70 g·L?1); 但是, 还有许多微生物药物例如免疫抑制剂雷帕霉素 (rapamycin) 工业菌株的发酵水平需要显著提高。此外, 部分微生物药物产品需要减少杂质组分或实现单一活性组分, 以改善和提高药物的品质, 这也要求从生产菌种、发酵工艺、提取流程等方面进行深入研究。因此, 需要建立更加理性化的分子育种方法与策略。

作为微生物药物生产载体的微生物, 其分子生物学、遗传学研究已经比较深入, 有望承担新的重任: 由于自然资源限制, 一部分天然药物特别是植物药, 将来很可能需要转到微生物中生产, 以实现环境保护与药物可持续生产的双重目标。例如, 来源于植物青蒿的青蒿素是公认的治疗疟疾的最好药物, 但青蒿资源有限, 其中的青蒿素含量低, 从青蒿中提取青蒿素满足不了医疗需求, 且青蒿素结构复杂, 化学全合成成本高。美国加州大学Keasling[5]通过合成生物学 (synthetic biology) 技术在大肠杆菌和酵母中成功重构了青蒿酸(青蒿素的一种重要生物合成前体, 可通过两步化学反应转化为青蒿素) 的生物合成途径, 有望实现青蒿酸的微生物发酵生产。届时, 青蒿素将从“植物药”转变为非天然的“微生物药”。

1 合成生物学为微生物药物发展提供新契机

合成生物学是近年来发展起来的一门新兴学科, 它是在系统生物学基础上引入工程学中模块化和系统设计理论, 以人工合成DNA为基础, 设计创建元件 (parts)、模块 (modules), 或者从头合成具有预定功能的人工生物体系, 从而突破自然体系的限制, 实现人工生物体系在药物制造等领域中的应用, 同时加深人类对生命本质的认识。合成生物学本质上属于工程科学, 通过创造或改造基因组, 建立人工生物体系, 让其表现出预期的行为或完成预定的工作。我国科学家已从不同方面对合成生物学及其应用进行了论述[6?8], 认为合成生物学将对医药、能源、化学品和环境等应用与生产领域产生深远影响, 加快对人类赖以生存的若干化学品从高度依赖化石资源制造向可再生生物资源制造的变革。

合成生物学中的元件是指具有特定结构或功能的DNA片段(如基因), 模块是指不同元件的组合以完成预定的生物学功能。微生物次级代谢产物的结构比较复杂, 其生物合成基因通常成簇存在, 由多个甚至几十个模块构成。相对于人工生命系统(细胞) 的全合成, 操作这些基因簇、有目的地获得微生物次级代谢产物相对比较容易实现, 同时也不存在伦理问题。

早在1985年, Hopwood等[9]通过将放线紫红素(actinorhodin, 一种异色满醌类抗生素, isochromane-quinone) 生物合成基因簇中的不同DNA片段导入到其他异色满醌类抗生素 (medermycin, granaticin) 产生菌中, 获得了一组新的异色满醌类抗生素, 开创了采用基因工程技术研制杂合抗生素(hybrid antibiotics) 的新领域。随着放线菌分子遗传学研究的深入, 20世纪90年代提出了“组合生物合成 (combinatorial biosynthesis) ”概念, 是指在了解微生物次级代谢产物的生物合成途径并且克隆了与生物合成与调节相关的基因(簇) 基础上, 在体外对不同来源的基因(簇) 进行删除、添加、取代和重组, 然后导入到适当的微生物宿主中以定向合成一系列“非天然”的天然化合物, 例如新抗生素或其他生理活性物质[10]。从今天的视角看, 这些研究都带有采用合成生物学概念创制微生物新次级代谢产物的色彩。

合成生物学应用于微生物药物研发, 就是以微生物和植物来源的次级代谢产物等为主要研究对象的合成生物学, 它与组合生物合成、代谢工程

武临专等: 微生物药物合成生物学研究进展?157?

(metabolic engineering) 等在研究内容方面有一定重叠[11], 但是它更突出人工生物系统设计以及次级代谢途径重构, 因而目的性更强。

微生物药物在人类的医疗健康方面发挥了极其重要的作用, 青霉素称得上是人类生物学研究成果中皇冠上的明珠。微生物药物往往结构复杂, 完全依靠化学全合成困难或不经济, 有时还会严重污染环境, 对人类社会的可持续发展带来威胁。合成生物学为解决这些问题提供了一种现实的选择, 将它应用于微生物药物研发将大有作为。本文主要聚焦合成生物学在这方面的一些研究进展。

2 合成生物学在微生物新次级代谢产物发现中发挥作用

随着DNA测序技术的发展, 结合生物信息学分析结果, 人们发现在微生物基因组中存在大量与次级代谢产物生物合成有关的沉默 (silent) 或隐性(cryptic) 基因簇, 其中包含了多种结构类型的微生物次级代谢产物编码信息, 是天然的微生物次级代谢通路, 但在常规培养条件下这些通路处于关闭状态或其产物尚未被发现。这些基因簇提供了丰富的合成生物学天然元件或模块, 为未来设计和构建新的微生物次级代谢产物生物合成途径提供了丰富的物质基础。

采用合成生物学技术手段在恰当的宿主细胞中表达(或激活) 沉默(或隐性) 的次级代谢通路中的生物合成酶, 有可能获得(或发现) 用于微生物药物研发的新次级代谢产物。沉默基因簇中含有的正、负调节基因是次级代谢产物生物合成的开关, 对其中的正调节基因进行组成型表达 (constitutive expression) 或对负调节基因进行敲除, 可激活沉默基因簇, 获得微生物新次级代谢产物[12]。激活沉默基因簇有时还需要宿主细胞提供合适的环境因素, 因此对宿主细胞进行遗传修饰改造也是必要的, 例如对一些模式微生物的基因组DNA进行规模化删减, 获得适用于合成生物学等研究的、含最小基因组 (minimized genome) 或缩减基因组 (genome-reduced) 的宿主细胞。

放线菌的基因组在原核生物中是比较大的 (8～10 Mb), 其线性基因组两端的末端臂 (1～2 Mb) 往往编码菌株生长繁殖的非必需基因(簇), 将末端臂通过基因组工程等方法予以删除, 所构建的基因组缩减菌株, 一般具有以下优点: 代谢效率提高、生长速度快、菌株更加稳定等。基因组缩减菌株不仅可以用于提高特定次级代谢产物的生物合成水平, 而且可以为与次级代谢相关的沉默基因(簇) 的表达提供条件[13]。

此外, 大肠杆菌生长迅速、遗传背景清楚、操作简便, 是分子生物学最常用的异源表达宿主之一。对大肠杆菌进行改造后, 已经获得能够用于生物合成聚酮类微生物次级代谢产物如红霉素的宿主细胞[14, 15]。模式链霉菌天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor), 以及若干链霉菌工业菌株如委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae) 和白色链霉菌(Streptomyces albus), 也可作为微生物次级代谢产物生物合成基因簇异源表达与产物合成的宿主。

生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens ATCC 23877) 是螺旋霉素产生菌, 对其线性基因组DNA序列分析显示在右侧末端臂有一个编码I型组件式聚酮合酶 (type I modular polyketide synthase) 的沉默基因簇, 长度达150 kb, 其中含有一个不转录表达的途径特异性正调节基因, 编码属于LAL家族 (large ATP binding regulators of the LuxR family) 的一个蛋白质。在该菌株中对这个正调节基因实施组成型表达后, 激活了此沉默基因簇, 得到了预期的新次级代谢产物stambomycins (图1), 它具有细胞毒和抗革兰氏阳性细菌活性, 有望成为抗肿瘤药物开发的先导化合物[16]。

在对构巢曲霉(Aspergillus nidulans) 的基因组DNA分析时, 发现了一个比较少见的编码聚酮合酶和非核糖体肽合酶的沉默基因apdA, 其上游是编码氧化还原酶的几个基因, 下游是编码转运蛋白基因和途径特异性正调节蛋白基因(apdR)。在该菌株中对apdR实施诱导表达后, 获得了具有细胞毒活性的新次级代谢产物aspyridones (图1)[17]。采用类似策略, 从构巢曲霉中获得了聚酮化合物asperfuranone (图1)[18]。

除虫链霉菌的基因组DNA中含有4个萜类合酶 (terpene synthase), 其中的sav76功能未知。将sav76进行密码子优化后在大肠杆菌中表达并纯化, 体外实验表明它可环化法尼基二磷酸酯 (farnesyl diphosphate), 生成三环倍半萜醇avermitilol (图1)。在除虫链霉菌原株中检测不到该化合物; 将sav76导入到基因组缩减的除虫链霉菌SUKA17变株(缺失1 Mb基因组DNA, 包括了该菌株的主要次级代谢生物合成基因簇) 中, 检测到了avermitilol生物合成[19]。

Feng等[20?22]对宏基因组DNA粘粒文库进行筛选, 将含有II型PKS片段的重组粘粒经改造后接合转移导入到白色链霉菌(Streptomyces albus) 中进行

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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 155?160

图1 采用合成生物学策略发现的微生物新次级代谢产物

异源表达, 对发酵产物分析后得到了数个新芳香聚酮化合物 (图1, 化合物1～4), 有的化合物具有抗耐甲氧西林金葡菌和耐万古霉素粪肠球菌活性。 3 合成生物学在提高现有微生物药物生物合成水平与品质中发挥作用

在微生物细胞中存在许多次级代谢途径, 同一条代谢途径还可能有分支现象, 一种微生物次级代谢产物常以一组结构类似物的形式出现, 致使目前临床应用的一些微生物药物属于多组分混合物。采用合成生物学技术, 对次级代谢通路中的酶 (系) 活性进行有针对性的精细调节, 可以理性化实现微生物药物产生菌的发酵效价提高及产品品质改善。

红霉素是一种重要的14元环大环内酯类抗生素, 其中红霉素A 组分是有效组分, 红霉素B 和C 作为红霉素A 的生物合成中间产物, 属于杂质组分。通过调整红色糖多孢菌 (Saccharopolyspora erythraea ) 中参与红霉素生物合成的PKS 后修饰酶EryK (P450羟基化酶) 和EryG (依赖S -腺苷甲硫氨酸的O -甲基转移酶) 的生物合成量, 实现了红色糖多孢菌发酵过程中红霉素A 组分绝对产量和相对比例的提高[23]。

通过对次级代谢产物生物合成基因簇中调节基因进行操作, 可以有目的地提高目标产物的生物合成水平。这方面的例子很多, 例如力达霉素 (C-1027) 是球孢链霉菌 (Streptomyces globisporus ) 产生的烯二炔类抗生素, 是一种重要的抗肿瘤药物开发先导化合物, 通过对力达霉素生物合成基因簇中的多个

调节基因进行操作, 获得了力达霉素产量显著提高的球孢链霉菌菌株[24?26]。

多拉菌素 (doramectin) 是一种比阿维菌素更好的微生物农药, 由基因工程改造后的除虫链霉菌生产, 其工业菌株被国外垄断。我国科研人员通过删除阿维菌素生物合成基因簇中的支链酮酸脱氢酶基因bkdF 和寡霉素生物合成基因簇中的起始基因olmA1等, 构建了具有自主知识产权的多拉菌素工业菌株[27]。 4 合成生物学在创造微生物次级代谢产物中发挥作用

通过在微生物细胞内重构目标产物的生物合成途径, 使合成生物学用于创造微生物次级代谢产物。既可以利用微生物细胞内已有的次级代谢途径, 也可以将不同的次级代谢途径重新设计组合优化得到一条新的次级代谢产物生物合成途径。所产生的次级代谢产物, 可以是已知化合物 (但生产方式发生了根本变化), 也可以是新化合物。

博来霉素 (bleomycin) 是一种糖肽类的广谱抗肿瘤药物, 通过对博来霉素和与博来霉素结构类似的糖肽类抗生素tallysomycin 及zorbamycin 的生物合成基因簇进行分子操作、组合以及异源表达, 获得了新的杂合糖肽类抗生素, 其中的6'-脱氧博来霉素Z 的切割DNA 活性显著优于目前临床应用的博来霉素A2[28]。

荷兰DSM 公司研究人员将产黄头孢霉中的扩环酶和假单胞菌中的酰基转移酶编码基因导入到青霉

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素产生菌黄青霉中, 在含有己二酸前体的培养基中培养, 实现黄青霉生物合成己二酰化7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸 (adipoyl-7-ADCA); 由于黄青霉工业菌株的青霉素发酵水平非常高, 所以该生物发酵法可以大量地获得adipoyl-7-ADCA (一种重要的头孢菌素化学半合成前体); 所获得的adipoyl-7-ADCA 再经两步酶法即可得到头孢氨苄 (cephalexin)。如果以青霉素G为原料化学半合成头孢氨苄, 需要多步复杂化学反应, 也不环保[29]。

螺旋霉素属于十六元大环内酯类抗生素, 构效关系研究表明对螺旋霉素分子中碳霉糖部分进行4''-酰化可增加分子的亲脂性, 提高其组织浓度从而增加抗菌效应。将来自耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans) 碳霉素生物合成基因簇中的异戊酰基转移酶基因导入并整合到螺旋霉素产生菌(Strep-tomyces spiramyceticus) 中, 延伸了螺旋霉素的生物合成途径, 获得了产生4''-异戊酰螺旋霉素的重组菌株[30], 并进行了产业化和新药开发研究。

5 微生物药物合成生物学面临的问题与挑战

目前, 人类对生物体系的认识有限, 对合成生物学设计的代谢途径(通路) 并不能保证发挥预期功能, 甚至对构建代谢途径所用组件的特性也不完全了解[31]。因此, 对微生物药物合成生物学涉及的一些基础学科(图2) 还需要不断深入研究, 透彻理解自然界特别是微生物的初级与次级代谢的关系及其调控机制[32]。在将合成生物学用于微生物药物研究时, 需要将理性与非理性研究策略相结合, 通过反复替换、测试与筛选, 才有可能实现预期目的与设想。当前, 合成生物学在微生物药物研究领域充满了希望与挑战。例如, 为了在微生物中重构青蒿酸的生物合成途径, Keasling课题组花费了大约150人年时间和数千万美元研究经费来寻找合适基因及将这些基因

图2 微生物药物合成生物学涉及的一些基础学科组织起来并协调它们的表达[5]。

我国一些重点科研机构和大学已开展微生物药

物合成生物学研究, 中国科学院上海生命科学研究

院于2008年成立了合成生物学重点实验室。在微生

物药物合成生物学研究方面, 我国科研人员构建了

优良的红霉素、阿维菌素、多拉菌素等工业菌株, 研

制了必特螺旋霉素(已作为一类化学新药进行了开发) 等。目前国家的多项重大科技计划如973、863

和重大新药创制等资助了与微生物药物合成生物学

相关的项目或课题, 预计未来我国在微生物药物合

成生物学方面将取得更多的成果和技术突破。

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