农科院考博分子生物学复习题1

分子生物参考答案L1

Nucleic acid is the genetic material (to explain via four examples)

⑴肺炎球菌转化实验有毒性的肺炎球菌为S型，表面光滑具有荚膜多糖；S型菌属可产生无荚膜多糖的变异体，这些变异体没有毒性，具有粗糙的（rough）表面，称为R型。分别将加热至死S型和活R型细菌注入小鼠体内，均不能引起小鼠中毒死亡，但两者同时感染时却能与活的S型菌感染一样，有效地杀死老鼠。并能够从致死的小鼠体内分离得到S型菌。试验中死S型菌是III型的，而活的R型菌是来自II型的，提取出来的是III型S型菌，故本实验说明了S型菌中含有某种物质使R型菌发生转换，1944年证明该物质是DNA。

⑵噬菌体感染实验将T2噬菌体的DNA组分用32P标记，蛋白质组分用35S标记，感染大肠杆菌。分离子代噬菌体后可得，子代噬菌体中含有30%的32P标记和不到1%的35S

标记，此实验再次强化了DNA是遗传物质的结论。

⑶DNA转染实验将纯化的DNA加入到培养生长的单一真核生物细胞群体中，核酸进入细胞，DNA整合到细胞中可以产生特殊的蛋白质。如：没有TK 基因的细胞不能产生胸腺嘧啶激酶并且在缺乏胸腺嘧啶时会死亡，当将外源TK基因转染到真核生物细胞中，转染细胞能够在不含胸腺嘧啶激酶的培养基中生存。即外加DNA转染的结果使真核生物细胞获得新的表型。

2. 3'—，5'—

DNA是由脱氧核糖核苷单磷酸通过3 ，5 磷酸二酯键连接而成的高聚物，从同一个磷酸基的3'酯键到5'酯键的方向定为链的方向。在大多数天然DNA分子长链的两端，总是有一个核糖带有自由的5'—磷酸，而另一端的核糖带有自由的3'—羟基，前者称为5'—端，后者称为3'—端。DNA链的方向就是从5'端到3'端。

3. A、C、T、G 、U、D、I

4. Denaturation:变性,是描述DNA或RNA从双链转变为单链的状态，链分开的过程经常伴随着加热过程。

Melting temperature熔解温度即通过加热由双链变为单链的这一系列温度范围的中点。Renaturation(annealing)：DNA双螺旋分子变性后的互补单链再结合成双链的过程。Hybridization：RNA和DNA链互补配对形成RNA-DNA杂合链的过程称为杂交。

5. Spontaneous mutations ：细胞与环境的随机作用使所有生物存在一定数目的突变，称为自发突变，其产生原因是由于DNA复制发生错误或是由于环境的损伤。

Hotspot：突变热点是突变发生频率高或重组频率高的那些位点。

Transition，Transversion

转换是一种突变，即指一种嘧啶被另一种嘧啶代替，一种嘌呤被另一种嘌呤代替，G-C

对被A-T对替换，或者相反。颠换是一种突变，即嘌呤被嘧啶代替或者相反，因此A-T 对变成了T-A或C-G。

Modified bases

修饰碱基是除了那些在DNA(T、C、A、G)、RNA(U、C、A、G) 合成时的四种通用碱基之外的一些碱基，由核酸合成后修饰产生

6 PLoS：（Public Library of Science）公共科学图书馆，一个有科学家和医生组成的非营利机构，致力于把世界上科学和医学的文献作为免费资源向公众开放。

L2

(1)Viroid：类病毒是没有蛋白外壳的小的核酸感染因子，它们是非常小的RNA环状分子，

能引起高等植物疾病。

(2)PSTV：土豆纺锤体管状病毒 (potato spindle tuber virus,PSTV) 。PSTV是类病毒的一种，其RNA是环状分子，形成广泛的双链结构，它被一些内部环中断。

(3) Prion：['pri:?n]朊病毒是一种蛋白质样感染因子，虽然不含核酸但表现出可遗传的特

性，会引起哺乳动物的神经系统疾病，例如PrPSC，羊骚痒病和牛海绵体脑病。Scrapie (羊瘙痒病)

PrP C- 阮病毒相关蛋白，正常脑组织中产物，并可被蛋白酶完全水解。

PrP SC-阮病毒相关蛋白，被羊瘙痒病病毒感染脑组织中的产物，不能被蛋白酶水解。

(4) Gain-of-function mutation：功能获得型突变，表示突变使蛋白质获得新的活性(或功能)，这种性质是显性的。

Loss-of-function mutation：功能丧失型突变表示使某一基因失活，这种性质是隐性的。Null mutation：无效突变表示基因的活性完全消失，因为该基因已被删除。

Leaky mutants：遗漏突变表示突变后基因仍存在部分功能，因为突变后的蛋白质存在部分活性(错义突变)，或者因为产生了少量的野生型蛋白质(无义突变)。(此突变不影响表型，功能并不是必需的)。

allele：等位基因，是指位于染色体同一位置分别控制两种不同性状的基因。translocation：染色体片段位置的改变称为易位。它伴有基因位置的改变。

(5) How to assign mutations to genes via the cis/trans test (give an example)?

蛋白质呈反式作用，而DNA上的位点呈顺式作用.所有的基因产物（RNA或蛋白质）都是反式作用的，它们可以作用于细胞内基因的任意拷贝上。顺式突变可以鉴定出反式作用因子识别靶位点的DNA序列，它们不表达RNA或蛋白质，而只影响相邻的DNA序列。DNA中的控制位点为蛋白质提供结合位点;而编码区经RNA的合成而表达。顺式作用位点控制邻近的DNA，但不影响其他的等位基因，蛋白质结合到靶序列的所有拷贝上，蛋白质中的反式作用突变影响其所控制的基因及其等位基因。

(6) Each allele has a different phenotype, why (illustrate by example)?

同一个基因的不同变化称为复等位基因(Multiple alleles)。等位基因的存在使突

变子间能够形成杂合子。在最简单的情况下，野生型基因编码有活性的蛋白质，

而突变型基因编码无活性的蛋白质。通常一系列的等位基因往往有不同的表现

型，比如：果蝇中white 位点的存在对红眼的形成是必要的。这个位点是根据

无义突变命名的，该突变使果蝇在突变杂合子中具有白色的眼睛。表述野生型和

突变型基因时，通常在野生基因型基因后加上+号。W+相对其他基因来说是显性的。

一般有很多种不同的等位基因。尽管一些突变基因并未产生眼睛颜色，但是一些基因产生了

颜色。w基因座上有一系列的等位基因，其表型从野生型(红眼)到无色)

(7) The specificity determines the blood group for human (illustrate by example) .基因座会有一条以上的野生型等位基因，当等位基因存在时，一个动物可能是携带两种突变基因的杂合子。这种杂合子的表型依赖于每一个突变所遗留下的活性。从本质上讲，两个突变基因间的关系与野生型和突变型间没有区别：一个突变可能是显性的，可能是部分显性，也可能都是显性的。在任何一个遗传位点上并非一定要有一个野生型基因。人类血型系统的比较就提供了一个例子。缺失功能由空白型表示，即O型。但是功能性的A型和B型是共显性的，并且对O型表现出显性。A或B都不能被认为是野生型。因为它们代表可互换的作用，而不是功能的获得或缺失。即一个群体中存在多条功能性等位基因被称为多态性。ABO血型基因座编码半乳糖基转移酶，其特异性决定了血型的差

别。

L3 李超整理

(1)DMD：杜兴氏肌营养不良症，存在于X染色体中伴性遗传的遗传性肌肉萎缩病，因基因突变导致肌肉细胞不能产生Dystrophin蛋白，缺少该蛋白导致钙离子渗入，全身肌肉无力。

(2) DHFR：二氢叶酸还原酶利用NADPH将二氢叶酸还原为四氢叶酸的氧化还原酶，参与核酸的合成。

(3)Conservation of exons and its application：外显子和内含子的突变概率一致，但外显子的突变可因不利自然选择被有效除去，所以相对而言，外显子具保守性，该性质可以做为鉴定编码区的基础，即通过确认那些在许多生物体中都存在的序列片段，来确定编码区域。

(4) exon trapping and its application：外显子捕获技术，是对基因组片段迅速扫描从而得知外显子的存在的技术。外显子捕捉技术要求一个带有强启动子的载体，且在两个外显子之间只有一个内含子。内含子中有限制克隆位点，用来插入被分析的片段。当插入片段无外显子，这个重组载体转染到细胞后，转录产生只含有两个外显子序列的RNA。当插入片段存在外显子，外显子序列被插入载体的两个外显子序列的RNA中，通过反转录成cDNA，PCR扩增检测出来。此技术用了一种特殊的载体。如果基因组片段中含有一个外显子，那么它的序列可以在细胞质RNA中被发现；但如果基因组片段中只由内含子中的序列组成，那么剪接就不会发生，且mRNA也不会运输到细胞质中。

(5)Chromosome walking and its application：使用该技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列，并用来测定DNA大分子中各个基因的相对位置。步骤：a根据起点克隆中最靠近目标基因的分子标记（如RFLP）或者基因，分离出一个片段作为探针，从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠的序列和染色体上的其他序列。b从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆。c如此重复，每得到相邻的一个片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移。

染色体步移技术主要有以下几方面的应用：

①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；

②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；

③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；

④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；

⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

(6) shot-gun approach：鸟枪法。利用限制酶消化给体基因组DNA，消化产物不经过凝胶电泳分部分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法，叫做鸟枪法。

L4

(3) 衔接物：衔接物是一种用人工方法合成的DNA短片段，具有一个或数个在其要连接的受体DNA上并不存在的限制酶识别位点。

(4) TdT：末端转移酶（Terminal transferase）是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。

(5) Saccharomyces cerevisiae：酿酒酵母又称麫包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm。其繁殖的方法为出芽生殖。

(6)C. elegans：线虫。有五对常染色体(autosome)和一对性染色体(sex chromsome)。是一个染色体数很少的二倍体。

①细胞学特征

C. elegans做为一种典范生物(model organism)被大量应用于现代发育生物学，遗传学，基因组学的研究中。C. elegans在研究细胞分化(cellular differentiation)方面特别有贡献，而且是第一个基因组(genome)完全被定序(sequencing)的多细胞生物。其基因组很小，仅有8×107bp，为人类基因组的3%，约有13,500个基因。且C.elegans与原核相似，有25%左右的基因产生多顺反子mRNA（PolycistronicmRNA），此和它们通过反式剪接使下游基因的到表达有关。C. elegans大部分是XX型的雌雄同体个体（hermaphrodites）大约每500个蠕虫有1个是XO 型的雄体，此是染色体不分离的结果。

②C. elegans的优势在于为一种多细胞(multicellular)真核生物(eukaryote)。雌雄同体成虫有959个体细胞；雄成虫有1031个。且每一个体细胞(somatic cell)()的发育情况都研究得较为清楚。这个细胞世系(cell lineage)的规律在各个个体之间是几乎不变的。两种性别的个体，都有许多多出的细胞(雌雄同体131个，大部分原本会成为神经元)将经由细胞凋亡(apoptosis)的过程被除去。

(7) 非互补粘性末端DNA分子间的连接方法。

一，如果要连接的是具有非互补的粘性末端的载体分子和外源DNA片段，可先用Sl核酸酶（专门作用于单链）形成平末端，用T4连接酶有效连接。二：或者分别给它们加上相同的一段衔接物，随后再用只在衔接物中具有的唯一识别位点的限制酶切割，结果就会产生出能够彼此互补的粘性末端，再用T4 DNA连接酶将它们连接起来。三，应用附加街头或同聚物加尾技术。

(8)How to prevent the formation of circular molecule for linear vector？

阻止经限制酶切割后的线性载体分子自身的再环化作用，以提高DNA片段的插入效率。目前通用的有三种办法：第一，用碱性磷酸酶处理由限制酶消化产生的线性载体分子。第二，使用同聚物加尾连接技术。第三，应用柯斯质粒

(9) gene amplification：基因的扩增，是指带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，导入适当的寄主细胞进行繁殖，从而获得大量的单一的重组体DNA分子的过程。(10) transformation：转化一词严格地说是指，感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；而转染（transfection）一词，则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。但从本质上讲，两者并没有什么根本的差别。无论转化还是转染，其关键的因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易地进入细胞内部。

(11) How to clone the gene via complementation?

如果被克隆的DNA片段，同重组体DNA分子的寄主细胞的染色体DNA是同源的，那么使用互补作用进行基因克隆，将是一种十分有效的方法。它的一种最简单的方式是，将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，即一组含有大肠杆菌基因组全部DNA序列结构的重组体DNA 分子的异源群体，导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株（auxotrophic strain）的受体细胞。然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的底物的基本培养基上。因此，只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落。

举例阐述互补作用基因克隆。

如α-互补实验，现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在有生色底物X-Gal存在的培养基中产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。

(12) How to produce cDNA library?

（i）构建cDNA文库的第一步是分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的分部。一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷酸组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]，能够同惰性物质如纤维素（或琼脂糖）结合。当细胞总RNA制剂通过已用oligo（dT）处理过的纤维素柱时，mRNA分子的pol（A）尾巴便会同oligo（dT）序列杂交而粘附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子则流出柱子。经过处理，可从纤维素柱子中洗脱下了纯净的mRNA分子（图7）。

（ii）构建cDNA文库第二步是合成第一链cDNA。其中一种方法叫做oligo（dT）引导的cDNA合成法。另外一种叫做随机引物引导的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis ）。此法的基本原理是，根据许多可能的序列，合成出6～10个核苷酸长的寡核昔酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在这种情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生。

（iii）构建cDNA文库第三步是将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。可采用自我引导合成法或置换合成。

（iv）构建cDNA文库的第四步是将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。

重组的方式是先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或者更常用的是将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，尔后再同经适当处理而具有相应末端的载体分子连接。将如此构成的重组体分子导入大肠杆菌寄主细胞进行扩增，于是便得到了所需的cDNA 文库。

(13) How to clone gene for genome?

基因组DNA克隆与cDNA克隆不同，它的出发材料是基因组DNA。由于cDNA分子比较小，可以在质粒载体上克隆。高等真核生物染色体基因组DNA的基因文库，通常是用λ噬菌体或柯斯质粒作载体构建的。

（1）应用λ噬菌体载体构建基因组文库

构建基因组文库的第一步是，从给体生物制备基因组DNA，并用限制酶消化法产生出适于克隆的DNA片段。然后，在体外将这些DNA片段同适当的λ噬菌体连接成重组体分子，并转化到大肠杆菌的受体细胞中去。最后，从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的克隆。下面举例说明基因文库的建立。

1)采用HaeⅢ-AluⅠ双酶消化法，选用两种识别序列毫不相关的核酸内切限制酶HaeⅢ（5′… GG↓ CC… 3′）和AluI5′…AG ↓CT… 3′）对真核基因组DNA作局部混合酶切消化，收集到大小为20kb左右的随机的DNA片段群体。由于这两种酶切的结果形成的都是平末端的DNA片段分子，所以需要加用适宜的衔接物(EcoRI) 。为了保护克隆DNA片段中可能存在的EcoRI序列不被切割，使之甲基化。然后再与EcoRI衔接物作平末端连接。形成的重组分子经EcoRI限制酶切割之后，便会产生出相应的粘性末端。这样的外源DNA 片段，与同样经过EcoRI核酸内切限制酶消化处理的取代型的λ噬菌体载体，就会通过粘性末端间的互补发生有效的重组作用。经DNA连接酶连接和体外包装之后，便可有效地导入大肠杆菌寄主细胞，产生出所需的基因组文库（图9）。

2)采用一种识别序列亦为4个核苷酸的核酸内切限制酶Sau3A进行局部消化，基本程序如图10所示。首先，Sau3A将真核基因组DNA作局部消化，分部收集分子量为15～20kb 范围的DNA片段。与此同时，选用限制性核酸内切酶Bam HI切割λ噬菌体载体DN A，取纯化的两臂分子，用T4DNA连接酶与分部收集的基因组DNA片段连接，所形成的多连体分子，经体外包装形成重组体的噬菌体感染大肠杆菌细胞，经过生长扩增之后，产生出的溶菌产物，组成了一个重组体克隆库，此即是基因组文库。

（2）应用柯斯质粒载体构建基因组文库

为了使真核基因组DNA克隆到柯斯质粒载体上，需用核酸内切限制酶Sau3 A局部消化基因组DN A。然后分离收集分子量为35～45kb的片段群体，并同线性化处理的柯斯质粒载体DNA连接重组。经体外包装之后，感染给大肠杆菌寄主细胞。在细胞内，柯斯质粒载体按质粒特性进行复制扩增，形成基因组文库。

L5 孙艳整理

1. Plasmid：质粒，细菌细胞内稳定地独立存在于染色体外，能自我复制并传递到子代的环状双链DNA分子，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。

λPhage：λ噬菌体，一种温和的诱导性噬菌体，其基因组除在5'端有12个可互补的碱基外均为线性双链DNA，感染时DNA形成环状。λ噬菌体作为外源基因克隆载体可以携带较长的外源DNA片段。

Cosmid：cos site-carrying plasmid , 也称粘粒、柯斯载体。柯斯质粒是人工建造的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。是一类用于克隆大片段DNA 的载体，带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。

3. 利用cDNA克隆某基因(举例)。

cDNA克隆的基本过程是通过一系列的酶催作用，使总poly（A）mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库

（i）构建cDNA文库的第一步是分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的分

部。一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷酸组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]，能够同惰性物质如纤维素（或琼脂糖）结合。当细胞总RNA制剂通过已用oligo（dT）处理过的纤维素柱时，mRNA分子的pol（A）尾巴便会同oligo（dT）序列杂交而粘附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子则流出柱子。经过处理，可从纤维素柱子中洗脱下了纯净的mRNA分子（图7）。（ii）构建cDNA文库第二步是合成第一链cDNA。其中一种方法叫做oligo（dT）引导的cDNA合成法。另外一种叫做随机引物引导的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis ）。此法的基本原理是，根据许多可能的序列，合成出6～10个核苷酸长的寡核昔酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在这种情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生。

（iii）构建cDNA文库第三步是将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。

（iv）构建cDNA文库的第四步是将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。

重组的方式是先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或者更常用的是将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，尔后再同经适当处理而具有相应末端的载体分子连接。将如此构成的重组体分子导入大肠杆菌寄主细胞进行扩增，于是便得到了所需的cDNA 文库。

4. TdT：末端转移酶（Terminaltransferase,TdT）是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。

5. GATC：同尾酶，一类识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同黏性末端的限制性内切酶

6. 举例说明基因定位克隆的使用。

7. genome：基因组，指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。是有机体内一组完整的基因，是一种生物体具有的所有遗传信息的总和，它最终由DNA 的全序列决定。

8. genetic map（linkage map ）：遗传图谱（genetic map ）或连锁图谱（linkage map ）是根据重组频率来确定突变位点之间的距离。这种方法需要依靠对表型有影响的突变体的产生，故其应用非常有限，而且由于重组频率并不能准确反映位点之间的物理距离，所以它不能确切反映遗传物质的物理距离。

9. genetic polymorphism：遗传多态性，我们把在一个基因座上有多条等位基因的现象称作遗传多态性

10.SNP：single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性，当比较等位基因时，其单个核苷酸的改变被称为单核苷酸多态性，从SNP 的角度来看，每一个人的基因组都是独一无二的。

12. 蛋白组学研究中所用的方法及原理。

（1）蛋白质组学研究中以前最常用的方法是二维电泳（2DE，or 2-D Electrophorensis），二维电泳的第一维过程中，蛋白质依其等电点的不同被分离开来，第二维的过程是用SDS-PAGE将蛋白质依分子量的不同加以分离，电泳结束后可将胶片以银染或Coomassie Blue的方式染色，让蛋白质显现出来。

（2）目前基于色谱分离与质谱的大规模蛋白质鉴定技术已成为蛋白质组学研究的中心。这种技术可以大规模地对蛋白质进行分析，通过质谱仪把蛋白质或肽段的组成信息以一级图谱与二级图谱的形式表现出来，最后把这些图谱与蛋白质或肽段产生的理论图谱相比较确定相似性（也即搜库），并最终确定样品中包含那些肽段，并通过肽段与蛋白质的对应关系，最终推断样品中包含的蛋白质。

（3）定量蛋白质组学（比较蛋白质组学），是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复

杂的混合体系内所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。其实验技术有蛋白质组学非标记定量技术、SILAC、ICAT。Label-free 蛋白质组学非标记定量技术。

原理：DeCyder MSTM软件对液相色谱串联质谱数据非标记定量分析是将质谱数据由谱峰形式转化为直观的类似双向凝胶的图谱，谱图上每一个点代表一个肽段，而不是蛋白质；再比较不同的样本上相应肽段的强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。13. 试说明每个等位基因具有不同的表型(举例)。

机体存在着多条等位基因，每一条等位基因都会对表型产生不同的影响。我们把一个基因座上有多条等位基因的现象称作遗传多态性，当多条等位基因在一个种群中稳定存在时，这些等位基因所在的位置被认为是多态性的。突变等位基因多态性的基础是它们产生了影响蛋白质功能的突变体，因此会在表型上产生一些变化，比较这些等位基因，它们各自的限制图谱或者DNA序列是互不相同的。

14.限制性位点能否体现孟德尔遗传的特性。

限制位点多态性的遗传规律符合孟德尔定律。下图中显示了一个祖孙三代的限制性多态家谱，从图谱中可以看到在所有可能的配对重组中，某个限制标记的4 条等位基因都能找到，并且它们在每一代中独立地分离，表明了DNA分子标记片段的孟德尔遗传定律。

15.RFLP可以作为一种遗传标记。

所谓RFLP，即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。由于核酸内切限制酶是以一种序列特异的方式切割DNA分子，来自一个完整的纯合子个体（所有的基因及DNA序列）的每一种同源的DNA分子，都会在同样的位点被准确地切割。

从不同的生态型（ecotype）或不同的地理隔离群（geographical isolate）植株分离的总DNA中，同源DNA分子通常会表现出序列的趋异性（divergence），形成RFLP（图

12 ）。这些RFLP是由于DNA序列上的特定变化（突变）引起的，因此它们也能够像其他任何遗传标记一样进行定位，成为一种十分有用的分子标记。

他检测的不是一些特征性表型而是通过检测限制图谱来直接揭示基因型。由于限制标记不限于那些对表型有影响的基因组的变化，因此它们成为分子水平上测定遗传基因座的有力工具。

限制标记可以提供检测疾病的诊断程序，可以对基因的分离提供参考

16.genetic markers：遗传标记，研究遗传性状时所找的参照物。

17.目前遗传研究中所使用用的四类遗传标记。

（1）Morphological markers(形态学标记) (Plant height, leave color and shape)

（2）Cytological markers (细胞学标记) (Nuclear type, triplet)

（3）Biochemical markers (生化标记) (Soluble protein, isozyme)

（4）Molecular markers (DNA, RNA, rRNA) (分子标记)

18. SSR:Simple Sequence Repeat 简单重复顺序即微卫星DNA标记

RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA 随机扩增多态性DNA

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

扩增的限制性内切酶片段长度多态性

Satellite:卫星DNA （重复单位为几百-几千碱基对）

MS: Microsatellite:微卫星DNA (重复单位为2-5碱基对）

19.人类基因组的数目、人类蛋白质组的成员，为什么后者大大多于前者。

人类基因数目约为2.5万个；蛋白质组是指组织或细胞中所有的蛋白质；蛋白质组的内容大于基因组，特别是在真核生物中，可想而知，蛋白质的数量大于基因的数量是由于RNA 在进行转译时有剪接(Splicing)的作用，在后转译修饰时蛋白质特殊部位会有磷酸化或糖基化的作用。

L6 李慧霞整理

1. PLoS：公共科学图书馆（Public Library of Science，简称PLoS）是一个由科学家和医生组成的非营利机构，致力于把世界上科学和医学的文献作为免费资源向公众放。

2. Null mutation：无效突变，表示基因的活性完全消失，因为该基因已被删除.

3. Redundancy：冗余描述若两个或更多个基因行使着同样的功能，那么这些基因中没有一个基因是必需的.

4. RNA saturation hybridization (RNA-driven hybridization)：RNA饱和杂交试验，将少量非重复序列DNA变性后与过量mRNA混合，使每个与mRNA互补的DNA 序列都能有机会和mRNA形成双链杂合体。这种杂交又叫RNA—驱动的杂交(RNA-driven hybridization)。

5. Rot：指RNA饱和杂交试验中的所用RNA浓度和反应时间的乘积。该试验中杂交程度受该值的制约。Rot越大，杂交就越彻底，直到趋于饱和。

6. abundance：丰度，指在每一个细胞中，每一种mRNA 的平均数量。

7.biochip：生物芯片，是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。

8. SAGE：基因表达系列分析(基因表达连续分析法)是一种新的基因表达分析方法，它能

对特定细胞或组织中的大量转录本同时进行定量分析。

9. DD法：即mRNA差别显示（differential display of RNA by PCR），是一种新的研究基因差异表达的有力工具。这个方法的主要程序是将细胞内的mRNA抽提出来，反转录成cDNA，再经PCR随机扩增，通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因，并回收这些DNA片段，经扩增后作为探针，在cDNA或基因组DNA库中扫描找到相关基因。

10.EST：（expressed sequence tag，EST）表达序列标签: 是指短的、单次（测序）阅读的cDNA 5’ 或3’ 端序列。也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。一般是来自不同组织来源的cDNA序列，长度在300-500bp左右。

11.HDA：high-density oligonucleotide array (高密度寡聚核苷酸阵列)

12.RACE: 又称为cDNA末端的快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE) 是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知序列为起点、扩增基因转录本未知区域、从而获得mRNA（cDNA）完整序列的方法。

13. mtDNA：线粒体DNA，是独立于基因组之外的DNA，环状、并位于线粒体之中。ctDNA：叶绿体DNA也是独立于基因组之外的(通常是环形的) 存在于植物叶绿体之中。

14.人类线粒体基因组与酿酒酵母的线粒体基因组间的异同。

相同: 都是具有独特序列的单链环状DNA分子；都含有编码蛋白质，rRNA和tRNA的基因。

不同：人类线粒体DNA排列非常紧凑，它没有内含子，部分基因实

是重叠的，几乎每个碱基对都是基因的一部分。除了D 环，一个与DNA 的复制起始有关的区域外，在人类线粒体基因组16 569 个碱基中，位于顺反子之间的碱基数目不超过87 个。有22 条tRNA 基因、2条rRNA 基因和13 条蛋白质编码基因。15条中的14 条蛋白质编码基因或者rRNA 编码基因转录的方向相同。14 条tRNA 基因是顺时针方向表达的，8 条是逆时针方向。

酿酒酵母的线粒体基因组由于有较长的内含子，所以它比动物细胞的mtDNA 长5 倍。包含蛋白质编码基因、rRNA 基因和tRNA 基因（既有连续的也有断裂的）

L7 李云霞整理

1、gene family: 即基因家族，真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为基因家族，它的成员可以成簇（cluster ）排列在一起或散布在不同染色体上（或兼而有之）。基因组分析显示很多基因属于基因家族。基因簇（gene cluster ）为我们对基因组中大区域而不是单条基因的进化动力的研究提供了机遇。

2、根据DNA复性动力学的研究，DNA序列可以分为四种类型：单一序列又称非重复序列、轻度重复序列、中度重复序列、高度重复序列

其中，中度重复序列10～几百个拷贝，平均长度大约300个bp，每一种平均重复数百次，它们在一起构成了序列家族。中度重复序列一般是不编码的序列，据认为在基因调控中起重要的作用，包括开启或关闭基因的活性，促进或终止转录，DNA复制的起始，其转录产物参与hnRNA的处理等。

人类的中度重复序列即Alu序列家族(Alu family) ，Alu族序列成员众多，大约有300,000个，(平均每6kb DNA就有一个)。每个长度约300bp，在其第170位置附近都有AGCT 这样的序列，可被限制性内切酶AluⅠ所切割(AG↓CT)，故此得名。无论从Alu族序列的长度还是从其重复频率上来看，Alu族序列都更像高度重复序列；然而它们不同于高度重复序列的串联集中分布，而是广泛散布在非重复序列之间。

3、Satellite DNA:卫星DNA,在高度重复序列中，常有一些A·T段浮力密度较小，因而在将DNA切断成数百个碱基对的片断进行超离心时，常会在主要的DNA带上有一个次要的DNA带相伴随，这就是所谓卫星DNA

Microsatellite：微卫星序列，其中的重复序列单位长度小于10 bp(一般是1-6，最多是6个) 的序列称为微卫星（microsatellite ）序列。

Minisatellite：重复序列单位长度在10-100bp 之间的序列，称之为小卫星（minisatellite ）序列

但Microsatellite和Minisatellite的应用并不是严格的，两种序列也称为数目可变的串联重复序列( variable number tandem repeat , VNTR ）或短串联重复序列（short tandem repeat , STR）

4、globin：珠蛋白，是具有携带氧能力的蛋白质。

在脊椎动物体内有两种类型：即存在于血液中的血红蛋白和肌肉中的肌红蛋白。目前在神经系统又发现了第三种珠蛋白，主要存在于大脑中，因此被称之为“神经珠蛋白”。胞红蛋白(CGB)是新发现的第四种携氧珠蛋白,广泛分布于多种组织和器官.在不同种类细胞中其亚细胞定位并不相同,在结缔组织中主要定位于细胞质,而在神经组织胞核和胞质中均有分布.

5、To illustrate the developmental control via example. (via globin)

发育控制：即随着连续的不同基因的开关，在不同时期，不同的基因产物会执行相同的功能。

在成体细胞中，珠蛋白四聚体由两条相同的α链和β链构成，而胚胎血细胞包含的珠蛋白四聚体与成体中的形式不同，其每个四聚体包含两条相同的类α和类β珠蛋白链，每一条都与成体中的肽链相关，并在稍后被其取代。

6、Unequal crossing-over can result in what results?

基因簇中发生不等交换可造成量和质两种结果，

（1）不等交换可以改变基因数目：如果一条染色体上的基因1与另一条染色体上的基因2 配对，则其他基因拷贝就无法配对。错配基因间的重组就产生了一条有单一(重组）基因拷贝的染色体和一条有三份基因拷贝（包括两条来自亲本的和一条来自重组的）的染色体

（2）不等交换还会有质的改变：如果交换发生在基因内部而不是基因间，其结果将决定于发生交换的基因序列完全相同还是只是相近。如果非等位基因的拷贝1和拷贝2序列相同，怎形成两条基因序列没有改变。但是相邻基因序列比较相近时，也可以发生不等交换（只不过频率比两条基因序列完全相同时低），这时形成的两条重组基因与任一条亲本基因都不相同。

7、Buoyant density:浮力密度，浮力密度通常用DNA 氯化艳（Cscl ）密度梯度离心法测定，离心中DNA 可以在与其密度相对应的位置上形成条带。当序列之间G-C 含量差异超过5 ％时，就能够用密度梯度离心分离出来。

8、Cryptic satellite DNA：隐性卫星DNA，通常基因组中的绝大部分高度重复DNA 都能以卫星DNA 形式被分离出来。即使不以卫星DNA 的形式分离出来，它们的特性也通常与卫星DNA 相似。也就是说，它们是由许多具有特殊离心行为的串联重复序列构成，以这种形式分离出来的组分有时称为隐性卫星DNA ( cryptic satellite DNA)

9、DNA fingerprinting ：DNA指纹分析技术，即使用限制性内切酶切割每个个体的、含有短重复序列的区域后所产生的片段，通过分析这些片段的异同而得到个体间的遗传关系。因为这些片段对于每个个体都是唯一的，任何两个个体之间所存在的这样的特殊片段可以用来定义他们之间的遗传关系(如父亲-孩子之间的遗传关系。

L8 殷倩倩整理

1. The “adapter”is transfer RNA (tRNA)，why.

mRNA 中的每个核苷酸三联体代表一个氨基酸。由于核苷酸三联体与氨基酸的结构不同，“适配器”使每个三联体密码子是与特定的氨基酸相对应的。其中的“适配器”是tRNA , 它有两个关键性质:1.它代表唯一的氨基酸，并与其共价相连 2.它包含了一个三核苷酸序列，即反密码子( anticodon ) ，它与代表氨基酸的密码子是互补的。反密码子使tRNA 能够通过碱基互补配对原则识别密码子。

1. 比较三种RNA的结构及功能。

种类结构功能

mRNA 由氨基酸编码区和非编码区组成，真核生物mRNA 含有5 ’末端帽子结构和3’末端的多

聚A尾结构。原核生物mRNA起始密码子上游

存在SD序列合成蛋白质的

模板

tRNA 由74 - 95个碱基组成，形成带有4 个恒定臂

的三叶草二级结构（在更长的tRNA 中另有一

个侧臂）

转运氨基酸

rRNA 主要的rRNA具有广泛的二级结构并且和蛋白质结合形成核糖体，长度介于1500-1900(小

rRNA)或者2900-4700(大rRNA)个碱基之间核糖体的组成部分

3.How to produce the cap and the poly(A) for eukaryotic mRNA.

真核生物细胞mRNA是在转录时或转录后的短时间内在细胞核中被修饰的，包括5 ’端甲基化的加帽和在3 ’端加入一条多聚腺苷酸序列。

RNA聚合酶Ⅱ催化合成新生RNA长度达25~30个核苷酸时，其5 ’末端的核苷酸就与7-甲基鸟嘌呤核苷通过5 ’，5 ’-三磷酸连接键连接。在加帽过程中，加帽酶与RNA聚合酶Ⅱ的CTD结合在一起，加帽酶的一个亚基的作用是去除新生RNA的5 ’端核苷酸的γ-磷酸，加帽酶的另一个亚基的作用是将一个GTP分子的GMP部分和新生的RNA的5 ’端结合，形成5 ’-5 ’-三磷酸结构；然后有S-腺苷甲硫氨酸先后提供亚基，使加上去的GMP中的鸟嘌呤的N7 和原新生RNA的5 ’端核苷酸的核糖2 ’-O甲基化。

加poly( A) 的反应由poly( A) 聚合酶[poly( A) polymerase]所催化，它在mRNA的游离3 ’-OH上加上200个腺苷酸。在前体mRNA分子断裂之前，多聚腺苷酸聚合酶加入到多蛋白复合体中，前体mRNA在断裂点断裂后，立即在断裂产生的游离3 ’-OH进行多聚核苷酸化。在加入大约前12个腺苷酸时，速度较慢，随后快速加入腺苷酸，完成多聚腺苷酸化。

4. cistron：顺反子，即结构基因，为决定一条多肽链合成的功能单位，约1000bp。（百度百科）

5. tRNA f Met：在细菌和真核生物细胞器中，tRNA 起始子（initiator ）携带一个氨基基团被甲酰化的甲硫氨酸，称为氨甲酰甲硫氨酰-tRNA ( N-formyl methionyl-tRNA）。这种tRNA 称为tRNAf Met

蛋白质翻译高度精确性的机制

1.mRNA携带信息的精确性，mRNA转录，剪接，加工，修饰都是一系列严格调控的过程。保证DNA 存储的遗传信息准确无误的传递到RNA。真核生物mRNA前体经过5端加帽，3端加尾，内含子切除等等复杂的加工过程后成为成熟的mRNA，这也是受多因子调控的复杂的酶促过程。

2.核糖体结构与机能的精确性。在翻译过程中，核糖体大小亚基，tRNA以及各种酶类都参与翻译过程，SD 序列与16SrRNA 的3`端反向互补将mRNA置于核糖体适当位置，使翻译正确起始。各种氨基酸对应的氨酰tRNA合成酶具有的特异性识别氨基酸和携带有密码子的tRNA，tRNA通过反密码子与mRNA密码子准确配对，也是严格调控机制。

2.增强子：enhancer增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。

3.锌指zinc finger

一些蛋白质中的模体，主要存在于作为转录因子的DNA结合结构域模体中，通常由约20多个氨基酸残基组成，可形成指形的环，其中有2个半胱氨酸和2个组氨酸(或4个半胱氨酸)残基螯合锌离子。

4 核小体nucleosome 真核生物染色质的基本组成单位，呈珠状结构，由160~200bp的DNA链缠绕在组蛋白八聚体分子的一个核心上。核小体通过DNA连接形成染色质的一级结构。

5.内含子（introns）在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。术语内含子也指

编码相应RNA内含子的DNA中的区域。

6 端粒酶的作用及其复制过程

端粒酶（Telomerase），在中细胞负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。

7.RNA干扰的原理以及操作过程是什么

短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。首先外源导入的dsRNA被切割为19~23nt的小分子干扰RNA（siRNA）。Dicer作为特异性RNA酶家族的一个成员，切割dsRNA为19~23nt siRNA，这是一个依赖ATP的耗能过程. 切割后的siRNA具有3’两个核苷酸TT突出末端。然后siRNA结合到RNA酶复合物上形成RNA 诱导的基因沉默复合体（RISC，RNA-induced silencing complex）。该复合体依赖ATP释能而解siRNA双链成单链以激活RISC。活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录本，最终导致基因沉默效应。

8怎样克隆真核生物的启动子

如果基因组测序已经完成的话，直接可以看出来，如1L说的，设计引物，PCR就可以；

如果是基因组没有完成测序，要去克隆一个已知基因的启动子：

首先，你需要自己做一个genomic walking的模板（基本原理为：抽提该物种的DNA，DNA的质量必须保证无杂质，纯度、浓度高；根据物种的不同，分别用3-5种限制性内切酶酶切DNA，酶切过后加相应的接头，平末端链接，这样一套模板就算完成，理论上该模板时一段段被切开的DNA 序列，并且两端带有了特定的接头-clontech公司试剂盒）；

设计引物，在目的基因的5‘UTR设计一对往上游扩增的槽式引物（GC含量、Tm值尽量高，66度往上）；

PCR克隆，根据自己合成的槽式引物和genomic walking的模板末端加上的接头序列，PCR（一般都是用Touch DownPCR，根据槽式引物，扩增两轮，第二轮是以第一轮的PCR产物为模板）；点样检测，挖胶回收特异的条带；

TA克隆，选择阳性克隆测序。

一般启动子的长度超过1K就可以了。一次长度不够，可以根据测出来的序列再次设计引物往上游扩增。

9 克隆一个已知目标基因有几种方法，请叙述操作过程

目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。

常用的植物目的基因克隆技术

1、通过已知基因产物的分析和鉴定

这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt 基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。

2、通过遗传表型分析

（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些

突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。

（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』 虮嗦氲氖芴逯 浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担 圆≡ し⒆拥鞍孜 咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』 颍 绶 延胛薅净 騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。

3、以图谱为基础的定位克隆技术

以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE 将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。

10举例说明翻译调控

描述噬菌体图谱，说明噬菌体溶原态和裂解态之间的转化