HCV 结构的介绍

Questions 1

对HCV的初步理解

1、其基因结构：HCV是正链RNA 病毒，传播的途径为血液传播。基因全长为

9.6kb包括5'-NCR、一个长的开放阅读框（0RF），编码组成约3000个氨基酸的多

蛋白前体，和3'-NCR.

2、目前hcv研究的现状：患者多，治疗方法不彻底，再感染几率大，潜伏期长，大部分患

者会造成慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病。研究其感染机制，病毒与宿主细胞的相互作用，一方面能够为制出特异性药物提供思路，另一方面是研发有效疫苗的必经之路。

目前病毒性肝炎的治疗多以聚二乙醇干扰素和利巴韦林，蛋白酶抑制剂联合用药，但是机体对干扰素应答的副作用大，再感染几率高。在研究方面HCV感染后血清中病毒含量极低，同时目前缺乏有效的体外培养系统及合适的动物模型繁殖病毒，无法获得大量的天然病毒抗原，目前只能通过合成肽或基因重组的方法，获得HCV包膜蛋白抗原。同时还缺乏有效的疫苗。

3、感染后缺乏有效的免疫的可能原因（1）HCV高度变异，逃避机体的免疫清除；（2）HCV

在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱；（3）病毒颗粒与低密度脂蛋白或免疫球蛋白紧密联接，导致抗原决定簇被掩盖；（4）外周血淋巴细胞可能有HCV储存库的作用。

4、研究点：对于以上问题决定我们研究HCV的方向为编码蛋白和宿主因子在HCV复制、组

装过程中相互作用，治病机制、疫苗的开发等。

Questions 2

该病毒蛋白的结构和功能（功能机构，与宿主细胞相互作用，引发疾病）

1、HCV的RNA及其翻译加工

HCV含有9.6 kb的正链RNA基因组5'-NCR，一个长的开放阅读框，编码组成约3000个氨基

酸的多蛋白前体，和3'-NCR..5'-NCR高度保守，有1-4个域，域一不是IERS起始必须的，但是域一和二是RNA复制所必须的。每一个HCV都有一个IERS序列，是翻译起始必须的序列。

3'-NCR由一个80个核苷酸序列组成的多聚U的可变区和一个由98个核苷酸组成的X-尾巴的不变区组成。3'-NCR是一个顺势作用原件，编码NS5B蛋白。在细胞培养和体内时3'-NCR.

和5'-NCR都是必须的。

5'-NCR的域二，三，四和核心基因的20-40个核苷酸构成IRES序列。

RNA的翻译起始：IERS序列和40S核糖体结合形成一个48S的二元复合物，然后在真核生物起始因子eLF3的帮助下与RNA上的AUG序列结合，形成eIF2?Met-tRNAi?GTP三元复合物，最后的限速步骤是依赖于GTP的与60S核糖体结合成80S的复合物。

HCV的ORF翻译产生了蛋白前体是共翻译后通过细胞和病毒蛋白酶处理为成熟的结构与非结构蛋白。结构蛋白和p7多肽是由内质网处理（ER）信号肽酶处理而非结构蛋白由两种病毒NS2-3蛋白酶和NS3-4A丝氨酸蛋白酶处理。

2、核心蛋白core

HCV的ORF翻译的第一个蛋白，其由功能区转入内质网腔的信号在内质网膜上C与E1之间。信号序列被信号肽酶裂解。最终成为分子量为21道尔顿的核心蛋白.其N端是高比例的碱性氨基酸，称为D1，可以使两个同源RNA聚合在一起。核心蛋白发现与内质网膜上的脂滴中，为高度螺旋蛋白。脂滴是一个相对疏水的环境，这不仅确保蛋白质的折叠还有利于病毒蛋白的复制，形态发生。核心蛋白与脂滴可能相互作用影响脂质代谢，促进肝脏的脂肪变性，这是经常出现在C型肝炎，特别是患者感染基因型3。

3、包膜糖蛋白E1和E2。

包膜蛋白E1和E2是糖基化形成的非共价复合物，给病毒形成一个保护囊。丙型肝炎病毒糖蛋白的成熟和折叠是一个复杂的过程，涉及ER机械伴侣和取决于二硫键形成以及糖基化。

跨膜结构域E1和E2，位于其C末端的异源二聚体并具有ER滞留性能。都由两个可延伸的疏水性氨基酸通过短极性键连接。第二疏水片段为E2下游和p7中内部信号肽蛋白质。内信号序列断裂前，E1和E2的跨膜结构以发夹结构与易位子相连。信号肽裂解之后，信号序列被重新定位，偏向胞质溶胶，最终形成单一的跨膜通道。E1和E2的三维结构的测定将是为阐明由这些蛋白质介导受体结合和融合过程的关键。

4、P7。

P7是一个63个氨基酸的多肽与E2常不完全切割。它的两个跨膜通过一个的胞质环连接，并且N端和C端被定向向ER内腔。在体外，HCVRNA复制中p7不需要，但在体内生产性感染中必不可少。据报道，根据其低聚物和阳离子通道活性，这表明它属于的体内蛋白质家族，并在病毒颗粒的成熟和释放中有重要的作用。因此可用于对抗病毒药物干预。

5、NS2-3蛋白酶。

NS2-3蛋白酶也被称为该autoprotease，是丙型肝炎病毒难以研究的蛋白质之一。对于HCV 在体RNA复制是可有可无的，但无论在体外还是体内其对复制的周期所必需的。NS2-3蛋白酶催化活性在NS2的C-末端半和NS3N端三分之一处。定点诱变表明，氨基酸His143，Glu163和Cys184是蛋白水解活性所必须的。NS2是与细胞膜有关的蛋白。其N-末端域包含至少一个（可能是三个）跨膜段，缺乏该域重组蛋白名保留该酶的活性。NS2的蛋白酶晶体结构域的结构（氨基酸残基94-217，NS2pro）得以解剖。NS2pro形成的二聚体具有两个复合活性中心。每个活性中心都是由两种残基单体组成，一种单体是残基His143和Glu163，另一种单体是Cys184残基。

这种结构改变了HCV的蛋白加工的看法，如以前认为NS2-3裂解发生在顺单分子反应（因此指定autoprotease）。但是，对于二聚化以形成活性NS 2-3蛋白酶要求表明NS2-3裂解和络合物形成可以由NS2的浓度来调节。了解N末端膜结构可能会NS2额外的功能如最近发

现的生产感染病毒必需影响病毒生命周期的一步。有趣的是，高效的HCV嵌合体的融合位点在NS2构建。

6、NS3-4A复合物。

NS3是一种多功能蛋白，位于N-末端的三分之一处是一种丝氨酸蛋白酶位于C末端三分之二的蛋白质具有RNA解旋酶/ NTPase活性。这两种酶的活性已经充分表征，以及高分辨率结构具有已经得到。该NS4A多肽的NS3丝氨酸蛋白酶用作辅因子。其中心部分被合并为一个整体组分掺入酶核心，和其N-末端部分与膜形成NS3-4A 复合物。

该NS3-4A丝氨酸蛋白酶已经成为制定特定抑制剂作为抗病毒药物的对象。其催化中心为His57，Asp81形Ser139。底物特异性的决定因素包括：酸性氨基酸残基在P6处的位置，到P1半胱氨酸（包括反式切割位点）或苏氨酸（ciscleavageNS3和NS4A）和氨基酸之间用小侧链连接的残余物，即，丙氨酸或丝氨酸，在P1'位置（一致切割序列D / EXXXXC / T↓S / AXXX）。NS34A丝氨酸蛋白酶有一个不同寻常的浅底物结合的口袋里，因此需要长期的与表面底物互动。最近已经表明在先天性免疫中，NS3-4A丝氨酸蛋白酶切割两个无活性的重要接头蛋白，即Trif77（也称为TICAM-1）和Cardif（也称为MAVS79，IPS-1和VISA）。Cardif蛋白是线粒体外膜上蛋白，以前观察到一个NS3-4A的小部分定位于线粒体上。这些发现对于HCV发病原理的研究将产生极大的影响。

NS3解旋酶是2DExH/ D盒解旋酶家族的成员。它结合双链RNA使其解螺旋，或结合单链RNA 具有广泛的二级结构的区域，利用对ATP水解螺旋。

7、NS4-B。

NS4B是相对分子质量为27-kDa的蛋白质。其功能之一是诱导形成膜状结构，所述特异性膜改变在HCV复制复合物中作为支架。它被预测含有4个跨膜片段和最近一直报道两个C端半胱氨酸被棕榈酰化残基且以形成低聚物。但是，详细膜拓扑和低聚中的作NS4B功能仍有待澄清。8、NS5-A。

NS5-A是磷酸化蛋白质，发现有底部磷酸化56KDa的和过磷酸化58KDa的蛋白质。最近的生化和功能研究表明，α-同种型蛋白激酶CKI的可负责NS5A 的过磷酸化。NS5A的磷酸化是丙型肝炎病毒属和瘟病毒中的保守特征，并且还发现，在黄病毒NS5蛋白，认为它在HCV生命周期中发挥重要作用。细胞培养适应性突变往往会影响位于中心的丝氨酸所需要的超磷酸残基，这表明这NS5A磷酸化状态调制HCV RNA复制的效率。根据一种模式，NS5A的过度磷酸化减少与人小泡相关膜蛋白相关蛋白A（HVAP-A）的相互作用。此囊泡分拣蛋白包括在脂滴中非结构蛋白和参与病毒RNA复制的相关蛋白。NS5A是通过N端的两亲性α螺旋嵌入膜双层的胞质小叶锚定于膜一个蛋白。这个螺旋具有被嵌入在胞质膜界面的疏水性，富色氨酸面，而极性，带电面暴露于胞质溶胶和可能是参与特定蛋白质- 蛋白质相互作用，这对功能性的HCV的形成复制至关重要

对重组NS5A进行序列分析和同时比较三个蛋白质水解域（翻译可能错误）该晶体的保守结构域一的结构膜- 锚定α螺旋透出二聚结构和限定的表面特性可能涉及与病毒RNA和细胞膜蛋白的相互作用事实上，

假设背向从该膜产生'爪状“二聚体槽，可以容纳任单链或双链RNA。深，高碱性凹槽部分可以用有利于接触RNA，'延伸出来的部分酸性强，有助于防止RNA的退出槽。

NS5A的RNA结合性质已被生物化学证实。根据一种假说，多个NS5A二聚体可以形成对细胞内的膜的二维阵列，从而产生一个“基本铁路'将允许RNA的滑动。NS5A的其他区域将保护其免受细胞RNA酶降解，或从识别由双链RNA诱导的抗病毒防御机制。根据这个模型，NS5A 将系绳病毒RNA到细胞内膜和协调其不同。根据一种假说，多个NS5A二聚体可以在细胞膜形成二维阵列，从而产生一个“基本通道'允许RNA的滑动。NS5A的其他区域将保护其免受细胞RNA酶降解，或识别由双链RNA诱导的抗病毒防御机制。根据这个模型，NS5A将病毒RNA束

缚在细胞内膜并协调不同丙型肝炎病毒复制过程中的命运。在受感染的细胞中，许多核心蛋白分子需要以基因组RNA复制产生掺入大量过量非结构蛋白。这些非结构蛋白在膜上的形成的格或列可能有其他的功能。在HCV复制中只有一小部分的非结构蛋白参与RNA的复制。如上所述，过量的非结构蛋白的积累也可能是用于启动RNA复制之前拮抗宿主细胞的重要先天抗病毒途径。

9、NS5B。

HCV是正链RNA病毒。无论是利用病毒RNA作为模板，利用宿主细胞的复制系统复制出负链RNA或者随后形成的正链RNA的复制都依赖NS5B RDNP酶。该酶被广泛的描述，NS5B 也成为研制抗病毒药物的对象。HCV NS5B蛋白中含有所有RdRps基序，包括标志GDD内基序、C序列，并基于所述相似性酶结构的右手的形状的，经典的手指，手掌和拇指子域。丙型肝炎病毒的RdRp的一个特点是，广泛手指和拇指子域之间的相互作用导致一个完全封闭活性位点。此功能和其他RdRps酶相同。类似的脊髓灰质炎病毒的RdRp，已报道HCV NS5B 的低聚为RNA合成的活性重要条件。丙肝病毒RdRp是所谓的“尾锚定蛋白”。膜联系是由C末端21个氨基酸残基，在体外这是可有可无的聚合酶，但在细胞内是RNA复制不可缺少的。膜定位发生由翻译后机制并造成NS5B的完整的膜关联。

10、ARFP /F蛋白

另一种阅读框（ARF）在HCV核心编码区被确定的是，作为在基因型1a -2 / + 1核糖体移码的结果，有的电位，以高达160个氨基酸的蛋白质进行编码，指定ARFP（替代阅读框蛋白）或F（移）蛋白质（见参考文献109）。氨基酸测序表明，移码可能发生在，或接近，核心蛋白序列的11密码子。然而，多个，并且部分分离物依赖性的，移码的事件，以及内部翻译起始，也有报道。检测抗体的和T细胞所特有的ARFP / F中的蛋白质丙型肝炎患者表明，这些蛋白质是丙型肝炎病毒感染期间表达。然而，ARFP /F蛋白不需要用于体外HCV RNA复制或体内最近的证据表明，一个或多个保守和功能的重要元素RNA存在于核心基因/ ARF。然而，这些功能，如果有的话，ARFP的/在生命周期?F蛋白质和丙型肝炎病毒的发病机制仍有待澄清

Questions 3

病毒复制复合物

病毒复制复合物包括病毒蛋白，复制RNA和改变细胞膜组成的相关复合物，到目前为止

的文献综述以上是所有正性的标志链RNA病毒复制复合物。根据病毒，复制可能发生在从派生改变膜ER，高尔基体，线粒体或溶酶体连。膜在病毒RNA合成的作用还不是很清楚。它可能包括：实物支持和组织的RNA复制复合物;条块分割和病毒产品的局部浓度;退绕时的病毒RNA的束缚;提供脂质成分的复制很重要的;和从双链RNA介导宿主防御或RNA干扰保护病毒RNA的膜质网是一种特别的膜改变，在Huh-7细胞含有HCV复制亚基因组是RNA复制的部位膜状纤维网的形成是诱导由NS4B单独和非常相似的“海绵状夹杂物“用电子显微镜观察以前在HCV感染的黑猩猩的肝。它是目前推测膜质幅源自ER膜。正在进行的研究旨在表征的宿主因素与涉及细胞过程形成HCV复制复合物。

最近的研究显示HCV RNA复制和细胞脂质代谢，推测通过交换和病毒及宿主蛋白质与细胞内膜的关联之间的复杂的相互作用。在细胞培养物中，HCV RNA复制是由饱和的和单不饱和脂肪酸的刺激，以及由多不饱和脂肪酸或抑制脂肪酸合成抑制。这些结果表明，膜的流动性是在复制复合物的功能是重要的。此外，我们发现的一种或多种宿主蛋白质的那前期所需的HCV RNA复制。一种这样的蛋白质是FBL-2，其包含一个F-box基序，并可能参与靶蛋白降解，虽然自然底物是目前未知。这样的观察表明，药理操纵脂质代谢可能具有治疗潜力的丙型肝炎感染。

最近的研究已经确定参与HCV RNA复制的其他宿主因素。利用敏感的环孢素A（CSA）在体外观察抑制HCV RNA复制，亲环素B的确定为环孢素A的靶细胞。结果表明，亲环b 与NS5B相互作用，从而刺激其RNA结合活性。亲环B是肽基- 脯氨酰cistrans异构酶。这种酶的活性具有AS-yetundefined丙型肝炎病毒RNA复制的作用。基于这些发现，非免疫抑制性环孢素A类似物目前正在更多最近开发作为对丙型肝炎的抗病毒药物，它表明，FKBP8（的FK506结合蛋白家族的一个成员）和Hsp90的形成具有NS5A一个复杂的，并有一个重要的角色HCV RNA复制。然而，FK506（他克莫司）不结合FKBP8和不抑制丙型肝炎病毒RNA复制

包装，组装，粒子释放

关于病毒生命周期的步骤是鲜为人知的，近期才开始进行研究。NS2和可能的其它非结构蛋白，如以及尚未将要定义的RNA的结构，涉及在生命周期过程中。病毒颗粒大概是由出芽形成进入内质网，或ER衍生的隔室，并退出该细胞通过分泌途径。一个可能的链接

脂蛋白代谢和病毒装配和之间释放已提议。、

影响药物开发

原则上，所述HCV生命周期（图1）的各步骤是用于抗病毒干预的靶。生物化学和结构上良好表征NS3-4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RdRp进行的特异性抑制剂目前正在开发作为抗病毒剂，以及第一方案已经在临床试验中进行了评估。丝氨酸蛋白酶抑制剂似乎特别有前途，因为它们不仅阻断病毒蛋白加工，但也可能是由丙型肝炎病毒反向先天免疫传感的抑制。此外，新的目标已经被发现上面强调了最近的研究，包括除其他外，HCV 5'-NCR，病毒进入和融合，在P7的离子通道，NS2-3蛋白酶和NS5A。此外，影响宿主因素药物参与HCV复制正在探索作为抗病毒剂。在这个早期阶段就已经是明显的是，HCV遗传变异性，这有利于抗病毒抗性的快速发展，是一个重大的挑战，以特定抑制剂的临床发展及的是，在共同与HIV感染的联合治疗将是必要的治疗成功。..

Questions 4

侵入宿主细胞时，与宿主细胞的联系（切断联系可研制抗病毒药物）

1、GAG。

葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)GAGs是由氨基己糖和糖醛酸两种己糖衍生物组成的直链高分子化合物，广泛存在于细胞表面，并可作为多种病毒的结合位点，包括黄病

毒属的登革病毒j。GAGs有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸类肝素、肝磷脂和透明质烷几种类型，但只有高度硫酸化的GAGs，如硫化肝素(HS)参与多种病毒的结合和内化，同样也观测到HCV和GAGs的结合引。通过对sE2、HCVpp、HCVcc以及患者血清中分离出的HCV的研究表明，GAGs中肝磷脂(HS类似物)和肝素酶(可降解细胞表面的HS)抑制了HCV与靶细胞的结合，糖苷酶处理HCV敏感细胞后，对HCV易感性降低。病毒附着到Hs可能在HCV感染的早期起到重要作用，但是其在HCV的入胞机制中作用尚不明确。sE2在细胞内对肝磷脂有高度的亲和力，但是通过对HCVpp的研究(表面有E1E2异二聚体)并没有类似效应，提示HS的结合位点在功能性E1E2异二聚体不容易获得或真实的HCV吸附到细胞表面的GAGs是病毒颗粒与脂蛋白结合。而最近的研究表明，脂蛋白脂酶介导的病毒黏附作用在一定程度上促进了HCV人胞

2、DC—SIGN、L—SIGN和ASGPR

DC—SIGN、L—SIGN和ASGPR均为3型钙依赖性植物凝集素，胞外区C-末端包含一个糖结合位点，可通过钙离子依赖方式与病毒糖基结合。DC．SIGN表达于枯否细胞、树突状细胞和淋巴细胞，L—SIGN表达于肝窦内皮细胞。DC—SIGN和L—SIGN通过高甘露糖寡糖对sE 有高度亲和力，同样也可和HCVpp以及患者血清中分离出的HCV病毒颗粒结合。由于DC —SIGN和L．SIGN均不在肝细胞上表达，而两者表达的细胞均与肝细胞相邻，推测在HCV

的感染过程中两者作为捕获和转移人肝细胞的受体。ASGPR则直接存在于肝细胞的表面，能同昆虫细胞中产生的El、E2蛋白结合，HCV类似颗粒(HCV—LPs)能通过ASGPR内化入肝细胞。但关于ASGPR的资料不多，有待于进一步研究。

3、CD81

CD81是分子量为26 kD的非糖基化膜蛋白，属于四跨膜(tetraspanin)蛋白超家族，广泛分布于多种组织和细胞表面，以非共价结合方式与多种分子形成复合物，参与细胞的黏附、激活、信号转导，增殖和分化等多种功能。CD81有四个跨膜区、一大一小两个细胞外环(small extracellular loop，SEL和large extracellular loop，LEL)和2个胞质内的N一末端及C一末端。1998年Pileri等首先发现sE2可以与细胞表面蛋白CD81 LEL相结合，从而推断CD81可能是HCV入胞的受体而这种结合具有种属特异性，sE2不与鼠细胞表面的CD81结合。此后多个实验证实CD81参与HCV感染，抗CD81单克隆抗体以及可溶型CD81一LEL均可抑制HCVcc 和HCVpp在体外及体内感染。。不表达CD81的肝癌细胞株HepG2和HH29，通过转染易位表达CD81后，获得对HCVcc和HCVpp的易感性舭。而通过siRNA下调CD81的表达或CD81的特异性抗体则可抑制患者血清中分离出的HCV的感染。一些研究提示CD81是在HCV与细胞的黏附之后发挥作用的．1 J。HCV仅感染表达CD81的肝细胞，但是在非肝细胞株的易位CD81表达并不能表现易感性，这提示HCV入胞尚需要其他分子。另外，EWI-2wintCD81的分子伴侣可抑制HCV人胞，而这种天然抑制物在肝细胞表面的表达缺失可能是导致HCV嗜肝性的另一因素。

4、SR—B I

SR．B I是一个由509个氨基酸组成的细胞表面糖蛋白，属于清道夫受体家族，由2个短的胞质区、2个跨膜区和1个大的细胞外环结构组成。SR．B I可在大部分哺乳动物细胞中表达，但在肝细胞和类固醇生成组织中的表达水平明显高于其他细胞。与CD81类似，SR—B I可与sE2相互作用，推测SR—B I是HCV入胞的假定受体J，而通过HCVpp和HCVcc的研究表明，SR．B I

参与HCV入胞驯。用抗SR．B I多克隆抗体预培养Huh-'／细胞能够降低HCVpp的感染。而采

用siRNA的方法使SR B I的表达下调至5％时，HCVpp的人胞减少90％。SR．B I的主要天然配体是高密度脂蛋白(HDL)，SR—B I的主要生物学功能是介导HDL的胆固醇脂的选择性吸收，研究发现HDL并非是HCV人胞的竞争者，而是能促进HCVpp和HCVee的入胞川。但这一作用与SR—B I的表达有极大的关系，因为当通过RNA干扰引起靶细胞不表达SR—B I时，这一效应大大降低。HDL可以易化HCV人胞是通过激活sR-B I或HDL与脂质细胞膜相互作用。血清淀粉样

蛋白A(semi amyloidA，SAA)是肝脏发生感染、损伤、炎症后生成的一种急性相蛋白，SR．B I可以结合并内化SAA，研究表明SAA可抑制HCV的入胞，而HDL可以降低SAA的抗病毒作用，HDL和SAA之间可能为竞争关系。具体机制需要进一步研究。SR．B在HCV人胞中的作用尚不明确，可能是通过病毒颗粒直接与SR—B I作用C29,34]，但是也有研究提示HCV通过SR—BI相关的脂蛋白作用。抗SR-B I抗体的动力学抑制研究表明HCV入胞需要CD81和SR—B I同时表达?。最近研究IFN的抗病毒作用与降低细胞表面SR—B I的表达有关，这些研究表明SR—B I在HCV入胞中的作用。

5、紧密连接整合蛋白CLDN1和Occludin

紧密连接是细胞连接的主要成分，对维持表皮和内皮细胞的选择渗透性屏障功能是非常关键的。紧密连接有两个重要的功能，一是封闭细胞间的空隙使表皮与内皮细胞的顶端和基底液体腔室分割开来，另一是作用是维持细胞极性。紧密连接复合物由occludins、Claudins、JAMs(junction—associated molecules)和CARs(the coxsackie vires B adenovirus receptors)四种跨膜蛋白组成。紧密连接的CLDN1和Occludin是新近发现的与HCV入胞相关的蛋白质。1．CLDN1：CLDN1是Claudin家族之一，是一种在肝细胞高表达的胞间紧密连接组分。该分子由211个氨基酸组成，形成2个细胞外环、3个细胞内结构域和4个跨膜结构，外环分子1(first extracellular

loop，EL1)上含有1段高度保守序列，是该家族分子的特征性结构，与HCV人胞有关的区域可能位于该序列上J。CLDN1是目前惟一一个通过异位表达于非肝源细胞而使该细胞对HCV易感的分子：在293T和SW13细胞表面表达CLDN1后，HCVpp对该细胞的易感性增加。而Huh-7细胞CLDN1的沉默表达降低对HCV易感性。动力学研究表明

CLDN1参与晚期HCV人胞的过程，在HCV和CD81结合或SR—B I结合后发挥作用。Claudin家族成员CLDN6、CLDN9同样介导HCV入胞J，CLDN6、CLDN9具有高度保守的EL1，并和CLDN1明显的序列同源性。不同于CLDN1，CLDN6、CLDN9同时还在HCV可能的肝外复制场所外周血单核细胞中表达。CLDN6、CLDN9在CD81阳性的内皮细胞表达可使不同基因型的HCVpp入胞。这提示Claudin蛋白在HCV的生活周期中的重要作用。

2．Occludin：OCLN与CLDN1同为紧密连接整合蛋白，定位于细胞侧膜的近顶面处，相对分子质量6O kD，由4个跨膜区，2个细胞外区和胞质内N一末端、c一末端组成。OCLN是紧密连接中最重要的结构蛋白，不仅能通过外环以拉链式结合产生严密的细胞旁封闭，还与不同分子结合，参与紧密连接形成的信号调节。目前认为CLDN1是HCV感染人肝源细胞系所必需的，但同时在人非肝源细胞系HeLa和HepH细胞(天然表达CD81和SR—B I)中过表达CLDN1，并不能是细胞对HCV易感，提示HCV的入胞还需要其他受体参与。Liu等通过siRNA和shRNA干扰降低CLDN1和OCLN在细胞表面的表达可抑制HCVcc和HCVpp入胞，共聚焦显微观察发现OCLN和E2蛋白结合后在内质网处聚集，免疫沉淀法和pulldown assay．进一步证实E2和Occludin和结合。Ploss等将HCV两种易感细胞Huh7．5和Hep3B细胞OCLN分子表达沉默后观察到2种细胞被HCVpp和HCVcc感染能力均有丢失，随后又将OCLN分子导入表达CD81、SR．B I以及CLDN1的不能被HCV感染的肾癌细胞786一O，随即该细胞可被HCV感染。这些证据显示0c—cludin 直接和E2作用，也许是HCV入侵宿主细胞的最后一个细

胞关键因子。有研究表明HCV能在相邻易感细胞间传播，这种传播途径不能被HCV感染中抗体阻断，所以能够部分解释HCV在人体内的免疫逃避J，在此过程中，CLDN1和OCLN有可能参与其中。另外一点HCV感染可改变紧密连接蛋白的分布，在HCV感染后的肝细胞CLDN1和Oeeludin表达水平下调，导致感染后细胞难以对HCVpp双重感染。紧密连接在维持肝细胞极性和功能有重要作用，肝细胞连接面上存在连接复合体，由紧密连接、桥粒和缝隙连接组成。细胞连接对维持肝细胞的多种生理功能起重要作用，包括胆汁的分泌及运输，细胞色素P450同工酶的表达以及糖原分解等。其中紧密连接的作用尤为重要，被称为“血胆屏障”，保证胆小管中的胆汁不溢入肝血窦。紧密连接位于相邻肝细胞靠近顶极的侧膜上，连接区域形成嵴线，嵴线主要由整合蛋白CLDN、OCLN和外周蛋白ZO组成。

6、低密度脂蛋白受体(1ow density lipoprotein receptor，LDL—R、

由于HCV与血清中LDL或极低密度脂蛋白(VLDL)的自然联系，LDL．R也一直被认为是HCV的假定候选受体。细胞从胞外摄取诸如低密度脂蛋白(LDL)等的脂蛋白颗粒并利用其内的磷脂及胆固醇合成新的细胞膜。LDL与LDL—R结合后，通过网蛋白介导的内吞作用转送至内涵体，在酸性环境诱导下，脂蛋白颗粒从LDL．R释放，随后脂蛋白在溶酶体降解，释放胆固醇至细胞内。LDL．R由839个氨基酸残基组成，分子量是93 kD，可分成5个区域，分别是：配体结合结构域、表皮生长因子前体结构域、含糖基结构域、跨膜结构域和胞内结构域。LDL—R 最先发现能够介导血浆源性HCV和其他黄病毒家族的部分成员入侵细胞。同时HCV的内摄能够被针对LDL—R的抗体所阻断，外源性的VLDL和LDL亦可。但是LDL—R在HCV感染中的作用存在争议，目前的研究认为，HCV人胞是一个多因素参与的复杂过程，需要多种分子介导或参与，包括CD81、SR—B I、CLDN1、Occlu—din、GAGs、DC—SIGN、L．SIGN和LDL R。这几种分子间的内在联系及是否还存在新的候选受体需进一步研究。对HCV入侵机

制的研究，这有助于在HCV入胞的各个环节对该过程进行阻断。因此，制备HCV受体的抗体、受体类似物以及利用RNA干扰技术下调HCV受体的表达、使用拮抗剂或药物来改变HCV

入胞的环境因素等，极有可能成为今后预防和治疗HCV感染的重要途径。