CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书
CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书
目录
内容和保存
介绍
产品信息
方法
实验轮廓
设计单链DNA寡核苷酸
产生双链寡核苷酸
连接反应
转化感受态E.coli细胞
分析转化子
转染哺乳细胞系
附录A
CRISPR核酸酶载体试剂盒的图谱和特点
附属产品
技术支持
参考
附录B
CRISPR核酸酶表达细胞的富集
内容和含量
1.1 双链（ds）对照寡核苷酸序列
ds 克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。ds 克隆对照的寡核苷酸来自退火的，并在试剂盒中提供的50μM的双链寡核苷酸。 ds 克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行再退火和稀释。
5’ CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 3’
3’GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT 5’
1.2感受态细胞
转化效率≥1×109 cfu/微克质粒DNA
1.3 TOP10细胞的基因型
F-MCRAΔ（MRR-hsdRMS-mcrBC）φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1 araD139Δ（ARA-LEU）7697Galu galKpsL（STRR）endA1 nupG
2 介绍
2.1 产品信息
2.1.1 介绍
GENEART?CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPR RNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓性链球菌II型CRISPR/ Cas系统，并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统（Jinek等人，2012;。Mali1等人，2013;。cong等人，2013）。带有OFP的GENEART?CRISPR核酸载体允许Cas9和CRISPR RNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选，而带有CD4的GENEART?CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPR RNA为基础的表达细胞的富集。线性GENEART?CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPR RNA靶到表达盒，允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。虽然该工具包被设计来表达Cas9和引导RNA的代表以最简单，最直接的方式，使用该试剂盒的基因组编辑和靶位点的特定靶序列裂解分析假设用户熟悉的CRISPR系统，载体的原则为基础的生产CRISPR RNA，并转染哺乳动物系统。我们强烈建议用户拥有CRISPR系统的工作知识。
2.1.2该CRISPR系统
在CRISPR系统是一种使用RNA指导的DNA核酸酶沉默病毒核酸（Jinek等人，2012）原核适应性免疫系统。在细菌中CRISPR位点组成的串联重复序列由外源DNA片段的分离（?30bp的长度），称为间隔件。的重复间隔件阵列被转录为一个长的前体和重复序列内被处理，以产生用于指定由CRISPR核酸酶裂解的靶序列（也被称为protospacers）小crRNAs。 CRISPR间隔物，然后用于识别和沉默的RNA或DNA水平的外源遗传元件。必不可少的裂解是一个序列基序紧接在目标区的3'端，被称为protospacer相邻的基序（PAM）的下游。在PAM中存在的靶DNA，但不能靶向它的crRNA。
2.1.3基因组编辑
基因组编辑包括使用在与内源性修复机制一起使用的设计好的核酸，以从基因组DNA中的特定位置中插入，删除或取代DNA序列。设计好的核酸酶在基因组中的特定位置诱导双链断裂（DSB），在这之后的内源性修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源性定向修复修复断裂。 II型CRISPR系统已被证明可作为在各种生物体，包括哺乳动物细胞的基因的编辑工具。（Mali1等人，2013;cong等人，2013）。它由三部分组成：CRISPR相关Cas9核酸（双链DNA的核酸内切酶），靶互补CRISPR RNA（crRNA），和一个辅助反式激活crRNA（tracrRNA）。该crRNA和tracrRNA作为一个短导的RNA为目标的Cas9核酸酶对特定基因组位点（图1）。
图1 CRISPR/Cas9介导的靶DNA裂解示意图
该crRNA和GENEART?CRISPR核酸载体的tracrRNA可以表示在一起为指导RNA，模仿在细菌系统自然crRNA-tracrRNA杂交。引导RNA的表达是由U6 polIII启动型的启动子（图2）驱动。
在GENEART?CRISPR核酸载体图2指南的RNA表达盒。
该系统具有通用性，且易于使用，改变目标专一只需要变更CRISPR RNA的设计即可。
3 方法
3.1 实验轮廓
下表和图列出了创建你的GENEART?CRISPR核酸酶载体和表达它的细胞所需的步骤。
图3 靶定特异的ds寡核苷酸的克隆和分析
3.2 设计单链DNA寡核苷酸
3.2.1 介绍
要使用GENEART?CRISPR核酸载体试剂盒，你首先需要设计带有两个单链DNA寡核苷酸突出段来与线性化的载体互补; 一个编码靶CRISPR RNA（正链寡核苷酸），而另一个与其互补（反向链寡核苷酸）。然后，将退火的顶部和底部链寡核苷酸，以产生一个双链寡核苷酸（DS寡核苷酸）以适于克隆到试剂盒中提供的线性载体中。
单链（ss）寡核苷酸的设计是两个克隆过程的成功是至关重要的。一般准则是提供在本节，以帮助您选择了靶序列，并设计了ss的寡核苷酸。请注意，对于一个给定的靶基因，你可能需要产生和筛选多个crRNA序列，在其中找出一个在有效地裂解你的目标基因位点是活跃的。
3.2.2 选择靶序列
当执行CRISPR/Cas9诱导的DNA上的特定基因或基因位点双链断裂，您选择靶序列可以显著影响裂解观察到的程度。当选择你的靶定序列时，我们推荐下面的指导方针。这些只是一般性建议;可能发生例外。
长度：选择的靶序列，从19到20个核苷酸长度的邻近一个NGG原垫片相邻的基序（PAM）的序列上的靶序列的3'末端。注意：需要从U6 polIII启动子转录起始的5'G是已经包含在突出端，并且不需要被包括在靶序列中。
同源性：确保靶序列不包含显著的同源性的其他基因，因为这可以增加脱靶效应。最近发表的工作表明，指导gRNA-Cas9复合物有可能容忍高达1-3的不匹配。更多见解的选择靶序列参见刊登的文章。（Fu等，2013;。Mali2等人，2013）。
定位：您可以选择靶序列编码靶基因的有义序列或反义序列。因此，您可以在提供其符合在3'端PAM的需求两个可能的方向产生CRISPR RNA。
3.2.3 需要定向克隆的序列
选择19-20个碱基对的靶序列后，继续设计crRNA特异性寡核苷酸引物。
重要！在寡核苷酸引物中不包括PAM序列。
要启用DS的定向克隆寡核苷酸进入GENEART?CRISPR核酸载体，你必须添加以下5个核苷酸到相应的ss寡核苷酸的3'端：
?上链低聚核苷酸加入GTTTT到所述寡核苷酸的3'末端。该GTTTT是互补的突出端序列，CAAAA，在线性CRISPR核酸载体（参见图3），并构成tracrRNA的前5个碱基。
底链寡核苷酸：底部链寡核苷酸应该是靶序列的反向互补。加CGGTG到所述寡核苷酸的3'末端。这个序列是互补的突出端序列，CACCG，在线性GENEART?CRISPR核酸载体（参见图3），并构成U6启动子的最后4个碱基和所需polIII启动转录起始位点的第一个碱基。
退火两条单链寡核苷酸产生带有为克隆入GENEART?CRISPR核酸载体合适末端的双链寡核苷酸。
3.2.4 制备双链寡核苷酸
3.2.4．1 介绍
退火每单链寡核苷酸的相等量，以产生一个双链（ds）的寡核苷酸。退火后，稀释ds等分寡核苷酸从50μM到5nm的工作浓度。
3.2.4．2所需材料
?正向链寡核苷酸（200uM的水或TE缓冲液）
?反向链寡核苷酸（200微米的水或TE缓冲液）
?50uM的库存的ds对照寡核苷酸（融冰）
?10X寡核苷酸退火缓冲液
?DNA酶/ RNA酶的水（用试剂盒中提供）
?1.5毫升无菌离心管
?95℃热块
3.2.4．3 退火过程
1、在室温下在干净的微量离心管中加入以下试剂。
正链寡核苷酸（200微米） 5微升
反向链寡核苷酸（200微米） 5微升
10X寡核苷酸退火缓冲液 2μL
DNA酶/ RNA酶的水 8μL
总量 20μL
2，重新退火的DS克隆控制寡。短暂离心（?5秒），转移5μL到一个干净的离心管中，然后继续
下一个步骤。
注意：此过程也适用于当重新退火等50uM 的ds寡核苷酸。
3，在加热块孵育管中于95℃进行4分钟。
4，从散热块中取出管，并让反应混合物冷却至25℃进行5-10分钟。
5，离心管短暂（约5秒）。轻轻混匀。
6，继续进行稀释双链寡核苷酸
对于长期储存，保持50μMDS寡核苷酸贮备液在-20°C。
3.2.4．4准备稀释的双链寡核苷酸
单链寡核苷酸和克隆控制寡核苷酸退火后，进行两个稀释：50μM的ds100倍连续稀释寡核苷酸库存，制备500nM的DS寡核苷酸原液（100倍稀释），和一个为5nM的ds寡核苷酸工作溶液（10,000倍稀释）。准备500 nM的原液准备一个500uM 的ds寡核苷酸原液稀释50μMDS寡核苷酸库存100倍。 1，混合下列试剂在一个干净的离心管中：
50μM ds寡核苷酸库存 1μL
DNA酶/ RNA酶的水 99μL
总量100μL
2，旋涡混匀。对于长期储存，保持500 nM的DS寡核苷酸贮备液在-20°C。
3.2.4．5 准备5 nM的工作液
准备一个5 nM的ds通过稀释500 nM的DS寡核苷酸原液100倍寡核苷酸工作液。注意：为5nM的ds 寡核苷酸工作溶液不适于长期储存，并应在每次新鲜制备。
1，混合下列试剂在一个干净的离心管中： 500 nM的DS寡核苷酸溶液 1μL； 10X寡核苷酸退火缓冲液 10μL ；DNA酶/ RNA酶的水 89μL；总成交量 100μL
2，旋涡混匀。
处理双链寡核苷酸的溶液
?在冰上解冻冷冻的ds寡核苷酸的溶液。
?切勿加热或允许的ds寡核苷酸溶液温度上升高于室温。 ds的加热寡核苷酸中部分变性的溶液的效果，并且在克隆效率的降低。
o如果500nM的储备液，或5 nM的工作液温度过高，准备新的稀释溶液。
o如果50μMDS寡核苷酸库存变热，再退火的寡核苷酸。
3.2.4．6 处理双链寡核苷酸溶液
?解冻冷冻DS寡核苷酸在冰上的溶液。?切勿加热或允许的DS寡核苷酸溶液温度上升高于室温。ds 的加热寡核苷酸中部分变性的解决方案的效果，并且在克隆效率的降低。o如果500nM的储备液，或5 nM的工作液温度过高，准备新的稀释溶液。o如果50uM的ds 寡核苷酸库存变热，再退火寡核苷酸。
4 连接反应
4.1 介绍
一旦你生成你的ds寡核苷酸，并准备相应的储备液，克隆ds寡核苷酸进入GENEART?CRISPR核酸载体。
4.2 所需材料
?双链寡核苷酸（5uM的1X寡核苷酸退火缓冲液，在解冻后使用冰）?双链控制寡核苷酸（5uM的1X寡核苷酸退火缓冲液，在解冻后使用冰）?线性GENEART?CRISPR核酸向量（使用前解冻冰）?5X连接缓冲液（用试剂盒中提供）?DNA酶/ RNA酶的水（用试剂盒中提供）?T4 DNA连接酶（与试剂盒中提供）
4.3 对照
我们建议，包括试剂盒提供的阳性对照在你的结扎实验DS控制寡核苷酸。在DS控制的寡核苷酸被提供作为在1X寡核苷酸退火缓冲液为50μM的股票，并且需要被重新退火和稀释10,000倍的连接反应使用之前。
如果你想有一个阴性对照，建立一个单独的连接反应，但省略了DS寡核苷酸。
4.4 连接步骤
在室温下对于每个ds寡核苷酸被克隆的建立具有20μL的连接反应。
1、按照显示的顺序加入下列试剂到一个干净的离心管中：
5X连接缓冲液 4μL
线性GENEART?CRISPR核酸载体 2μL
DS寡核苷酸（5纳米） 2μL
DNA酶/ RNA酶的水 11μL
T4 DNA连接酶 1μL
总量 20μL
2、混合反应：向上和向下吹打。
注：PEG的存在和甘油（由连接缓冲液和T4 DNA连接酶提供）将造成反应混合物的粘性。一定要通过上下吹打调匀反应。不要旋涡。
3，孵育10分钟，在室温下（25-27℃）。
注意：孵育时间可以延长到2小时，并可能导致较高的产率的菌落。
4，置于冰上反应，并进行TransformOne shot?TOP10感受态大肠杆菌。
注意：您可以储存剩余的连接反应在-20℃过夜
2.5 转化感受态大肠杆菌细胞
2.5.1 介绍
一旦你已经完成了连接反应，转化One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌与由此产生的CRISPR核酸结构。
One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌是理想的高效率克隆和质粒传播。他们允许高拷贝数质粒稳定复制。 TOP10细胞的基因型是类似于DH10B?菌株。为每个连接反应，One Shot?TOP10大肠杆菌需要一管。
2.5. 2 所需材料
?连接反应（从第4步，第8页）
?（可选）pUC19控制（带试剂盒中提供）
?One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌细胞（用试剂盒中提供）
?S.O.C.培养基（暖至室温后再使用）
?含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板（2个：为每个转化;温暖，在37℃，30分钟）
?42℃水浴
?37℃振荡和非振荡培养箱
2.5. 3 One Shot?TOP10转化程序
1，解冻One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌，并继续进行下一步的细胞解冻后立即使用。
2，添加连接反应3μL（从第4步，第8页）One Shot?TOP10化学感受态大肠杆菌的小瓶中，并通过涡旋或轻敲管轻轻轻轻混匀。不要上下吹打混匀。
注意：如果执行阳性对照的转化效率，转化1μL的的pUC19质粒。
3，将管立即放置在冰上，并孵育10-30分钟。
注意：长时间孵育似乎对转化效率的影响最小。在培养的长短是在用户的决定。
4，热激细胞30秒，在42°C，无晃动。
5，紧随管转移到冰。
6，加入250μL的的室温S.O.C.培养基。
7，盖上管紧密，摇管水平（200转），在37℃下1小时。
8，差价50微升来自于含有100微克/毫升氨苄青霉素的一个预热的LB琼脂平板上的转化反应。镀上的第二预热的LB琼脂平板上反应的剩余部分。过夜孵育所述板在37℃下
注意：我们建议放置两种不同的体积，以保证至少有一个板具有良好的间距菌落。如果你正在改变的pUC19对照，在含100μg/ mL氨苄青霉素的预热的LB平板放置20-100μL的转化。
9，一个高效的连接反应可在总共产生了100个的菌落。挑选5-10菌落进行分析（见分析转化，第10页）。
3．4 分析转化子
3．4．1确认阳性克隆
通过测序在阳性转化子中确认ds寡核苷酸插入的身份。分析每个CRISPR核酸结构来验证：?该DS 寡核苷酸插入存在，并且在正确的方向?该ds寡核苷酸插入有正确的序列
注：限制分析是推荐的，由于ds寡核苷酸插入的小尺寸。
3．4．2 分析转化子
1，在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，37℃下挑选5-10个氨苄青霉素抗性菌落并培养它们过夜
2，使用您选择的方法提取质粒DNA。我们建议使用的PureLink?HQ迷你质粒纯化试剂盒。
3，进行使用U6正向引物（与试剂盒提供）的CRISPR核酸结构的测序。
4，制作所需的CRISPR核酸表达质粒的甘油库存（见长期储存）。
5，继续进行转染（第11页）。
3．4．3 测序指导
如果一个特定的CRISPR核酸结构是很难顺序，遵循这些建议，以改进的结果：
?使用高品质，纯化的质粒DNA进行测序。我们建议使用的PureLink?HQ迷你质粒纯化试剂盒（货号K2100-01）制备DNA。?添加DMSO，测序反应，以5％的最终浓度。?增加模板的测序反应（至正常浓度的两倍）的使用量。?在你的测序反应使用的dITP：三磷酸的7:1摩尔比。
3．4．4 长期储存
一旦正确的CRISPR核酸构建体被识别，甘油库存用于长期存储。
1，在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板在原始菌落上加上f 的条纹，孵育过夜在37°C 2，分离单个菌落，接种于1-2毫升含100μg/ mL的氨苄青霉素LB培养基中。
3，在37°C，直到培养物达到稳定期。
4，混合0.85毫升培养与0.15毫升无菌甘油和转移到离心管。
5，存放甘油于-80℃
3.5 哺乳动物细胞系转染
3.5．1 转染的方法
转染质粒导入哺乳动物细胞系的方法包括磷酸钙（Chen和Okayama，1987;。Wigler等人，1977），脂质介导的技术（Felgner等人，1989; Felgner和Ringold，1989），以及电穿孔（储等。
对于范围广泛的哺乳动物细胞系的高效率转染，我们建议使用阳离子脂质为基础的脂质体?2000试剂（货号11668-027）（Ciccarone等，1999）。，1987; Shigekawa和道尔，1988）。
细胞系转染的最佳方法查阅相关文献或者供应商。要特别注意培养基的要求，何时传递细胞，以及在什么稀释分裂细胞。
3.5．2 质粒制备
的转染真核细胞质粒DNA必须是纯净，不受苯酚和氯化钠的污染。我们建议您使用高品质的maxi 准备的DNA用于转染。商店质粒DNA库存在-20°C。
3.5．3转染
指引以下一般原则，建议在一个标准的6孔板进行转染：
?用脂质体转染?2000进行转染与大多数细胞系。
?在转染当天种子细胞达到70％的汇合。
注：结果将随与细胞类型接种密度而变化。?有3微克CRISPR/Cas9表达载体的转染执行。注意：结果将依赖于细胞类型和传代数量，和脂质：DNA的最适浓度取得最佳效果是需要的。富集的种群使用任何OFP或CD4报告转GENEART?CRISPR核酸载体的详细信息，请参阅附录B（第18页）。
3.5．4 对照
我们建议您包括阳性对照和阴性对照（模拟转染）在实验来评估你的的结果。
3.5．5 故障排除
4．附录A
GENEART?CRISPR核酸载体的图谱和特点
4．1 GENEART?CRISPR核酸载体
下图显示了GENEART?CRISPR核酸载体的功能。该载体被提供线性化的核苷酸在7335和7356（CD4）或6732和6752（OFP）与每条链上所指示的5个碱基对的3'突出端。载体的完整序列是可以从我们的网站（https://www.360docs.net/doc/9e1730552.html,）下载或联系技术支持（请参见第16页）
GENEART?CRISPR核酸载体的特点
GENEART?CRISPR核酸酶载体（9822 bp的CD4和9219 bp的OFP）包含以下元素。所有的特点进行了功能性测试和载体的完全测序
5.附录B GENEART?CRISPR核酸酶表达细胞富集
5.1 介绍
GENEART?CRISPR核酸载体转染的细胞（与OFP或CD4记者）的种群可以使用荧光激活细胞分选（FACS）富集，或者在CD4报告基因载体的情况下，采用Dynabeads?CD4磁珠。
5.2 流式细胞仪富集
请遵循以下准则，以富集转染有GENEART?CRISPR核酸酶（OFP记者）载体的细胞：
?收获活的转染的细胞，为正在使用的细胞系重悬在FACS缓冲液。例如，0.2微米的无菌过滤的FACS 缓冲液（1X PBS中含有1mM EDTA，25mM的HEPES，1％FBS），可以很好地用于粘附细胞系，如HEK 293。
?OFP有548 nm的峰值激发和560 nm发射。
o一个488 nm激光被推荐用于高效率的激发。
o标准530/30, 574/26 和 603/48 发射器被推荐用于检测。
最优收集缓冲器，将取决于所选择的下游应用，但含2％FBS和FACS缓冲液（见上文）的RPMI培养基都是可行的方案。
。
图1 由GENEART?CRISPR核酸OFP载体转染的细胞时由488激光激发，并通过不同的检测器测得的ΔMFI（平均荧光强度）
请遵循以下准则，以丰富GENEART?CRISPR核酸酶（CD4报告）转染载体的细胞：?收获活转染的细胞，为正在使用的细胞系重悬在FACS缓冲液。
?染色细胞与CD4抗体结合到你所选择的荧光团（根据制造商的说明）。
?一旦染色，GENEART?CRISPR核酸酶（CD4报告）载体转染的细胞可以通过流式细胞仪（见上文）富集。
5.3使用CD4磁珠富集
GENEART?CRISPR核酸酶（CD4报告））载体转染的细胞可以用磁珠?CD4磁珠（货号11331D）富集。我们在使用本产品时，建议使用以下协议：
1，收获转染的活细胞和离心机在400×g离心5分钟。
2，倒出上清，重悬在2ml缓冲液I（0.2微米无菌过滤的PBS，0.1％BSA，2 mM EDTA）中。
3，离心机在400×g离心5分钟。
4，与2毫升缓冲液I的洗两次
5，重悬细胞在缓冲液一适当的体积
6，继续执行“Prepare Dynabeads? CD4磁珠”。
5.4 准备磁珠?CD4磁珠
1，重悬的Dynabeads?CD4磁珠的瓶内，用混合器使3分钟倾斜和管的旋转（例如HulaMixer?样品混合器）。
2，传输珠25μL至无菌的1.7毫升离心管中，并放置在磁性分离器进行1分钟。
3，随着管仍然在磁铁，倒出上清液。
4，重悬珠在缓冲一100μL
5，将管子放在磁力分离器为1分钟，用小瓶静止的磁铁，倒出上清液。
6，重悬珠在缓冲I的25μL
7，进到“孵育细胞与磁珠?CD4磁珠”（第20页）
5.5 孵育细胞与磁珠?CD4磁珠
1:1珠细胞的比率是推荐（25珠?107μL珠），虽然这个数目可能需要根据应用程序进行优化。
1，添加收获细胞悬浮珠，并把为1毫升缓冲带一终体积
2 .孵育在4℃下于一个混频器30分钟，以便让倾斜和管的旋转。
3，将管在磁性分离器进行1分钟。
4，随着管仍然在磁铁，倒出上清液。
5，重悬细胞和珠与500μL缓冲液Ⅰ的
6，孵育在混合器2分钟。
7 重复步骤3-6，共5次。
8 最后一次洗涤后，再悬浮在缓冲液Ⅱ（0.2微米无菌过滤的RPMI，2％FBS）中加入100μL细胞和珠。
9 加入10微升DETACHaBEAD?的CD4（提供11331D套件）。
10 孵育混合机在室温下放置45分钟。
11 放置在管上的磁性分离器进行1分钟。
12 取上清液（含有CD4 +细胞）转移到一个新的试管。
13 重悬珠在500μL缓冲液II中。
14 放置在管上的磁性分离，将上清液加到含有回收的CD4 +细胞的试管中。
15 重复步骤13-14，共3次，以获得回收的CD4 +细胞的最大产率。
16 把含有回收的CD4 +细胞的管的4毫升的最终体积。
17 离心机在400×g下6分钟。
18 富集重悬细胞在溶液适合您的下游应用（如染色溶液，流式细胞仪缓冲液，培养基）。
高纯度质粒小量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://https://www.360docs.net/doc/9e1730552.html, HighPure Plasmid Mini Kit 高纯质粒小量快速提取试剂盒 目录号：PL03 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存 50次 （PL0301） 100次 （PL0302） 200次 （PL0303） 平衡液室温5ml 10ml 20ml RNaseA（10mg/ml）-20℃150μl 250μl 500μl 溶液P1 4℃15 ml 25 ml 50 ml 溶液P2 室温15 ml 25 ml 50 ml 溶液P3 室温20 ml 35 ml 70 ml 去蛋白液PE 室温16ml 31.5 ml 63 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 15ml 20ml 吸附柱AC 室温50个100个200个 收集管（2ml）室温50个100个200个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍：
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－
0922粪便核酸提取试剂盒说明书
磁珠法粪便核酸提取试剂盒（常规版） Faeces DNA Extraction Kit (Regular Version) 【目录号】FDE-5005、FDE-5030 【运输条件】2~25℃； 【保存条件】磁珠分散液、裂解液②2~8℃，其它组分室温； 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 在使用本试剂盒钱，请用户自备80%乙醇； 2. 使用前请检查裂解液①、②是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将裂解液置 于378℃水浴重新溶解； 3. 本操作指南经本公司反复验证，使用前请仔细阅读，并且按照操作指南的建议操作。
磁珠法·自动化：为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案 【产品简介】 本试剂盒采用具有独特分离作用的磁珠和独特的缓冲液系统，从各种固态或液态粪便样品中分离纯化高质量基因组DNA。特殊技术包埋的磁珠在特定条件下对核酸具有极强的 亲和力，而当条件改变时，磁珠会释放吸附的核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的。 提取的基因组DNA片段打，纯度高，质量稳定可靠，尤其适合高通量工作站的自动化提取，特别是本公司各型号的自动化核酸提取仪。 本试剂盒纯化的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Sputhem杂交、芯片检测和高通量测序等实验。 【试剂盒说明】 1. 磁珠分散液严禁反复冻融和离心，磁珠使用前务必充分混匀，可涡旋振荡10秒左右； 2. 实验中使用我先混合仪的目的是为使磁珠能够充分吸附核酸、将磁珠表面的杂质充分去 除或核酸从磁珠表面充分洗脱； 3. 使用前检查裂解液①、②是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将裂解①、② 于37℃水浴重新溶解。 【自备仪器、耗材和试剂】 仪器自动版 涡旋混合仪、高速离心机、水浴锅或金属浴、96孔方孔圆底板、无水乙醇、异丙醇、英芮诚ETP-300核酸提取仪。 手动版 涡旋混合仪、高速离心机、金属浴或水浴锅；EP管、EP管用磁力架、无水乙醇、异丙醇。 【仪器自动版操作步骤】 以英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪为例，可同步完成32个样本的提取工作。 1．上样准备 参照下表用量向96孔板中分别加入相应试剂。
UU核酸检测试剂盒产品使用说明书
解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法）说明书 【产品名称】通用名称：解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 英文名称：Detection Kit for Nucleic Acid of Ureaplasma urealyticum (PCR-fluorescence probing) 【包装规格】 32人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于定性检测尿道、生殖道分泌物拭子样本中的解脲脲原体核酸成分，主要用于解脲脲原体感染的临床辅助诊断。根据相关文献研究，解脲支原体有14 株脲原体标准血清型可分为微小脲原体（Ureaplasma parvum，UP）1、3、6、14 和解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，UU）2、4、5、7、8、9、10、11、12、13，其中UP为条件致病菌，致病性与其含量有关，且普通人也有携带少量UP。UU是引起非淋球菌性尿道炎、阴道炎等病症的主要致病菌之一，也是引起输卵管炎、盆腔炎、慢性前列腺炎、流产、产后热等的重要病原菌之一。目前，临床上常用的脲原体检测方法有液体培养和核酸检测，但其并不能鉴别出其病菌是UP还是UU。 【检验原理】本试剂盒选用针对解脲脲原体（UU）特异性基因片段设计特异引物及特异Taqman荧光探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA摸板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5′端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3′端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对解脲脲原体（UU）核酸的自动检测，发出荧光信号的强度与UU-DNA的量呈正相关。 【主要组成成份】 注：不同批号试剂盒中各组份不能互换。 【储存条件及有效期】试剂应储存在-20℃保存，产品有效期为12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳定性，但试剂反复冻融不得超过3次。 生产日期、有效期至：见标签字样。 【适用仪器】具有FAM、JOE荧光检测通道的ABI 7300/7500、ABI 7500 Fast、LightCycler 480等实时荧光定量PCR仪。 【样本要求】 1．使用藻酸钙拭子、普通棉拭子或涤纶拭子采集尿道、生殖道部位带柱状上皮细胞的分泌物样本，应当选用国家批准生产的一次性使用的男性拭子或女性拭子，拭子应当包括套管、棉签杆、塞子，棉签杆与塞子都应连接牢固。 1.1尿道：对男性患者，先用生理盐水清洗尿道口，将男用取材拭子插入尿道内1-2cm，稍用力转动，保留数秒钟再取出，以采集到粘膜上皮细胞。 对女性患者，可低着耻骨联合轻轻按摩尿道后，用同男性相似的方法取材。 1.2宫颈：取材前用温水或生理盐水湿润扩阴器，应避免使用防腐剂和润滑剂。如果宫颈口外面的分泌物较多，先用无菌棉拭清除过多的分泌液， 将女用取材拭子插入宫颈管内2-3cm，稍用力转动，保留数秒，采集阴道分泌物。 1.3阴道：对于子宫切除的妇女和青春期前女孩可采用阴道样本。将取材拭子置于阴道后穹窿10-15s，采集阴道分泌物。如果处女膜完整，则从 阴道口取材。
小鼠髓过氧化物酶(MPO)酶联免疫试剂盒(ELISA试剂盒)
仅供科研使用，不得用于临床检验。 小鼠髓过氧化物酶（MPO）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）说明书 黄石市艾恩斯生物科技有限公司 【产品名称】 通用名称：小鼠髓过氧化物酶（MPO）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒） 英文名称：Mouse Myeloperoxidase（MPO）ELISA KIT 【包装规格】 48人份/盒，96人份/盒 【预期用途】 仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中小鼠髓过氧化物酶（MPO）的浓度。【检验原理】 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗小鼠髓过氧化物酶（MPO）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入小鼠髓过氧化物酶（MPO）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗小鼠髓过氧化物酶（MPO）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中小鼠髓过氧化物酶（MPO）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中小鼠髓过氧化物酶（MPO）的浓度。 【主要组成成分】 主要成分
校准品检测范围：0.156-10ng/ml。校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。 需要但未提供的材料及耗材 1、酶标仪 2、精密移液器及一次性吸头 3、蒸馏水 4、洗瓶或者自动洗板机 5、37℃水浴锅或恒温箱 6、500ml量筒 7、无粉一次性乳胶手套 【储存条件及有效期】 1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。 2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。 3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。 【适用仪器】 半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。 【样本要求】 样本类型和采集 以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。 1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。 2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。 3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
人C反应蛋白CRP酶联免疫分析试剂盒使用方法
人C-反应蛋白(CRP)酶联免疫分析试剂盒使用方法 检测范围：96T 30μg/L -800μg/L 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中C-反应蛋白(CRP)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人C-反应蛋白(CRP)水平。用纯化的人C-反应蛋白(CRP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入C-反应蛋白(CRP)，再与HRP标记的C-反应蛋白(CRP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的C-反应蛋白(CRP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中C-反应蛋白(CRP)浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
质粒提取试剂盒-说明书-翻译
精品文档 。 1欢迎下载 E.Z.N.A.? 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培 养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉 淀对于获得高质量的DNA 非常重要。 4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。 可能需要孵育2min 。不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min 。溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免 形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼．．．． 的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清 洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA 清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA 清洗液稀 释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g 离心2min ，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可 遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml 微量离心管中。将30-50μl （取决于终产物的期望浓度） 洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min 。≥13,000 x g 离心1min 洗脱DNA 。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA 。 13. DNA 的产量和质量：分别在波长260nm 和280nm 处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA 的浓度计算如下： DNA 浓度=A 260×50×（稀释倍数）μg/ml A 260/A 280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA 的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA 样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA 是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强 翻译
BIOG核酸提取试剂盒操作步骤说明
BIOG 游离DNA 提取试剂盒操作步骤 说明 运输条件：常温运输 货 号：51019:50次反应 51020:100次反应 储存条件：室温（15-25℃），消化液、DNA Carrier 请于-20℃存放 产品特点 试剂盒组成 组分 50次 100次 吸附柱和收集管 各50个 各100个 裂解液 18mL 36 mL 洗涤液A 21mL 42 mL 洗涤液B 9 mL 18 mL 洗脱液 3mL 6 mL 消化液 1.2 mL 2.4 mL DNA Carrier 0.24 mL 0.48 mL 说明书 1份 1份 产品介绍 BIOG cfDNA Easy Kit 是常州百代生物科技股份有限公司研制的专门用于提取血清、血浆等游离DNA 的试剂盒。BIOG cfDNA Easy Kit 采用了最新的优质进口离子膜，裂解液和洗脱液经过多次优化，能高效地分离DNA 。提取得到的DNA 较其它品牌的同类试剂盒产量更大，纯度更高，最大限度地去除了蛋白、色素、脂类等杂质污染，可以直接应用于PCR 、荧光定量PCR 和各种酶切试验等。 操作步骤 1. 请自行准备：无水乙醇、1.5mL 离心管。 2. 取出洗涤液，按以下操作： a) 洗涤液A ：21mL 加入9mL 无水乙醇；42mL 加入18mL 无水乙醇。 b) 洗涤液B ：9mL 加入21mL 无水乙醇；18mL 加入42mL 无水乙醇。 c) 配制好的洗涤液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用。 3. 取1.5mL 离心管，加入200μL 样本，4μL DNA Carrier 混合均匀，加入300μL 裂解液及20μL 消化液，振荡混匀，56℃水浴10 分钟。 4. 加入1000μL 无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA 的提取与后续实验。 5. 将吸附柱放入收集管内，将760μL 上述溶液转入吸附柱内，静置2 分钟，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液； 6. 将吸附柱放回收集管内，将剩余760μL 溶液转移至吸附柱内，重复步骤5。 7. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液A 至吸附柱内，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液。 8. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液B 至吸附柱内，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液。 9. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 4℃离心2 分钟，离去残留的洗涤液。 10. 取出吸附柱，放入新的1.5 mL 离心管内，加入30-50 μL 洗脱液，静置3 分钟，12,000 rpm 4℃ 离心2 分钟，收集DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。 注意事项： 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛， 请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时请就医。 储存、运输和有效期 本试剂盒可常温运输，室温（15-25℃）保存，有效期为12个月，消化液、DNA Carrier 请于-20℃存放，避免反复冻融。 质量控制 本产品经严格的质量检验证明，无生物污染 注意 ：本产品仅用于科研 BIOG 游离RNA 提取试剂盒操作步骤说明 运输条件：常温运输 ◎操作简便快速，可在半小时内获得理想的DNA ； ◎提取DNA 纯度高，无抑制剂，A260/A280为1.7-1.9； ◎产量更高，较国内同类产品高出20%； ◎可用于血清、血浆等游离样本中DNA 的提取； ◎不含苯酚和氯仿等有毒溶剂，安全无毒。
YYT核酸扩增检测用试剂盒
YY/T1182-2010 核酸扩增检测用试剂（盒） 1范围 本标准规定了核酸扩增检测试剂（盒）【以下简称“试剂（盒）”】的术语和定义、命名和分类、技术要求、试验方法、标识、标签和说明书、包装、运输和贮存等。 本标准适用于核酸扩增检测试剂（盒）的质量控制。核酸扩增检测试剂（盒）应包括核酸提取、核酸扩增及产物分析试剂组份，如核酸扩增检测试剂（盒）内不含有核酸提取组份，应由生产企业说明或指定提取试剂（盒）。 本标准不适用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突变检测用试剂（盒）及血源筛查的试剂（盒）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T21415-2008体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性 3术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1聚合酶链反应polymerasechainreaction,PCR 聚合酶链反应或多聚酶链反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。 3.2PCR杂交（膜上、板上）PCRhybridization 具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）可以通过氢键的方式，按碱基互补配对原则相结合，探针结合于特定核酸序列或PCR产物的杂交过程可以在液相中进行，也可以将其中一个固定在固相载体上进行。 3.3PCR电泳PCRelectrophoresis 根据PCR产物分子质量和所带电荷的不同在电场中进行分离的技术。 3.4实时荧光PCRreal-timepolymerasechainreaction,PCR
高灵敏小鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
高灵敏小鼠白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 金益柏试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆样本中白细胞介素-6（IL-6）含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠白细胞介素6（IL-6）水平。用纯化的小鼠白细胞介素6（IL-6）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白细胞介素6（IL-6），再与HRP标记的白细胞介素6（IL-6）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的白细胞介素6（IL-6）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠白细胞介素6（IL-6）浓度。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS （PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。 仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速 冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS （PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。 若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、 第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第 四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中， 再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加 标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90 pg/mL，60 pg/mL ，30 pg/mL，15 pg/mL，7.5 pg/mL）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各 步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释 液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则
附件1 酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则 一、前言 本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。 本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。 三、基本要求 （一）基本原则 1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂
生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： （1）外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。 （2）纯度和分子量
大量全血基因组DNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书
大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。
鸡马立克氏病病毒(MDV)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
鸡马立克氏病病毒（MDV）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒 使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于检测鸡血清，血浆及相关液体样本中马立克氏病病毒（MDV）水平。 实验原理： 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中鸡马立克氏病病毒（MDV）。用纯化的鸡马立克氏病病毒（MDV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中马立克氏病病毒（MDV）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的马立克氏病病毒（MDV）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF 值相比较，从而判定标本中鸡马立克氏病病毒（MDV）的存在与否。 试剂盒组成：
样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
克伦特罗酶联免疫定量检测试剂盒I
克伦特罗酶联免疫定量检测试剂盒（I） 使用说明书 概述： 克伦特罗(Clenbuterol)属于一类β-兴奋剂，具有改进脂肪型动物体内肉与脂肪的比例的作用，亦可促进动物生长。但同时，此药物还会使非横纹肌松弛，人体摄入后可引起心跳、心率不正常等副反应，甚至可导致心脏病。因此在我国，克伦特罗在畜牧业上的使用是被严格禁止的。 本试剂盒利用竞争酶联免疫法对生物样品中的克伦特罗进行定量分析。适用于动物尿液、血清、内脏等物质中克伦特罗的快速检测。由于ELISA法的高通量与简便快速，适合大量样本的定量筛查，自样本加入至结果读出，不超过60分钟，检测灵敏度为0.1ppb。 一、简要原理 试剂盒所提供的微孔板上包被有抗体，然后将校准品或样本中的克伦特罗与酶标记的克伦特罗加入微孔中后，两者可竞争结合克伦特罗抗体，洗去未结合的酶标记克伦特罗。加入底物后，在酶作用下，底物溶液会显蓝色，加入终止剂后，溶液由蓝转为金黄色。在450nm波长光下测吸光度，吸光度高低与校准品或样品中克伦特罗的含量呈反比，根据校准品的读数作出校准曲线，并利用校准曲线计算出样品中克伦特罗的含量。 二、试剂盒组成 1.酶标反应板： 96孔易折板，抗体已包被 2.克伦特罗校准品： 1ml/瓶×6瓶浓度：0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb 3.11×酶标记克伦特罗浓缩液： 1.2ml/瓶×1瓶(稀释11倍使用) 4.底物液： 11ml/瓶×1瓶 5.酶标稀释液： 20ml/瓶×1瓶 6.50×浓缩洗涤液： 20ml/瓶×1瓶(稀释50倍使用) 7.终止剂： 11ml/瓶×1瓶 8.其他：说明书×1份自封袋×1个 2-8℃贮存，有效期一年 三、实验需要但试剂盒不提供的试剂和仪器 1.试剂 ――――――10mM盐酸溶液 ――――――氯化钠 ――――――50mM PH7.0 PBS (配制:9g NaCl；4.65g Na2HPO4·12H2O；0.56g NaH2PO4·2H2O 溶解于1000ml蒸馏水中) ――――――异丙醇 ――――――乙酸乙酯 2 .仪器 ――――――微孔板酶标仪 ――――――涡旋振荡器或超声波粉碎仪 ――――――离心机
高纯度质粒小提试剂盒使用说明书
高纯度质粒小提试剂盒 Pure Mini Plasmid Kit (目录号：HS0103) 产品包装 试剂盒成分 50 preps Buffer P1 15 ml Buffer P2 15 ml Buffer P3 20 ml Buffer PD 30 ml RNase A(10 mg/ml) 150 ul Buffer PW 60 ml Buffer EB 10 ml Spin Columns PA 50个 Collection Tubes (2 ml) 50个 （注意：使用前将全部RNase A 溶液加到Buffer P1中混合均匀，2 ~ 8℃保存） 保存条件 本试剂盒在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A 后的Buffer P1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。 产品简介 本试剂盒用于高纯度质粒DNA 的小量制备与纯化。菌体经碱裂解、高盐、低pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜（Spin Columns PA ）吸附。通过去蛋白液（Buffer PD ）和漂洗液（Buffer PW ）的清洗可去除蛋白及其他杂质，在低盐、高pH 条件下洗脱，最后得到高纯度的质粒DNA 。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.
使用本试剂盒可从1 ~ 5 ml过夜培养的菌液中纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA，可在30 min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 产品特点 1. 快速：步骤少，操作简便，节约时间。 2. 简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液Buffer PW 和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即开即用。 3. 纯度高：所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 操作步骤 1. 取1 ~ 5 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。 （注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1 ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次） 2. 加入250 ul Buffer P1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。 （注意：是否将RNase A溶液加到Buffer P1中并混合均匀；菌体沉淀是否悬浮充分，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低） 3. 加入250 ul Buffer P2，温和颠倒混匀6 ~ 8次，直到溶液变得清亮粘稠。 （注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer P2的用量，在后续的操作中Buffer P3的用量也要相应增加） 4. 加入350 ul Buffer P3，立即温和颠倒混匀6 ~ 8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2 min，然后12,000 rpm离心3 ~ 5 min。 （注意：Buffer P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清） 5. 小心将上清液转移到离心吸附柱Spin Columns PA中，静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm离心0.5 ~ 1 min，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中废液。 （注意：如果宿主菌是endA-，如DH5α若TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是endA+，如TG1、BL21、HB101、JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒
YY-T1182-2010核酸扩增检测用试剂(盒)
YY/T 1182-2010 核酸扩增检测用试剂（盒） 1围 本标准规定了核酸扩增检测试剂（盒）【以下简称“试剂（盒）”】的术语和定义、命名和分类、技术要求、试验方法、标识、标签和说明书、包装、运输和贮存等。 本标准适用于核酸扩增检测试剂（盒）的质量控制。核酸扩增检测试剂（盒）应包括核酸提取、核酸扩增及产物分析试剂组份，如核酸扩增检测试剂（盒）不含有核酸提取组份，应由生产企业说明或指定提取试剂（盒）。 本标准不适用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突变检测用试剂（盒）及血源筛查的试剂（盒）。 2规性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 21415-2008 体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性 3术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链反应polymerase chain reaction,PCR 聚合酶链反应或多聚酶链反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。 3.2 PCR杂交（膜上、板上）PCR hybridization 具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）可以通过氢键的方式，按碱基互补配对原则相结合，探针结合于特定核酸序列或PCR产物的杂交过程可以在液相中进行，也可以将其中一个固定在固相载体上进行。 3.3 PCR 电泳 PCR electrophoresis 根据PCR产物分子质量和所带电荷的不同在电场中进行分离的技术。 3.4实时荧光PCR real-time polymerase chain reaction,PCR
人封闭抗体(BA)酶联免疫分析试剂盒使用说明书
人封闭抗体（BA）酶联免疫分析试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 特异性：本试剂盒可检测人封闭抗体（BA），且与其他相关抗体无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中封闭抗体（BA）含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。 2.酶结合物（Conjugate）：2×6ml/瓶。 3.样品稀释液（Sample Diluent）：2×6ml/瓶。 4.阳性对照（Positive Control）：1×0.5ml/瓶。 5.阴性对照（Negative Control）：1×0.5ml/瓶。 6.底物溶液A（Substrate A）：1×7ml/瓶。 7.底物溶液B（Substrate B）：1×7ml/瓶。 8.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。 9.终止液（Stop Solution）：1×7ml/瓶。 需要而未提供的试剂和器材 1.标准规格酶标仪 2.高速离心机 3.电热恒温培养箱 4.干净的试管和Eppendof管 5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6.蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置2小时或室温过夜后于1000x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。 1.加样：分别设空白孔，不加任何溶液；设阴性对照孔2孔，加阴性对照100μl；设阳性对照孔2孔，加阳性对照100μl；余孔加100μl样本稀释液，然后直接加待测样本5μl。注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃放置30分钟。 2.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。 3.每孔加酶结合物100μl（空白孔除外），充分混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃放置20分钟。 4.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。 5.依序每孔加底物溶液A和B各50μl，37℃避光显色10分钟。 6.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加