山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化
第 931~937页
第 18卷， 第5期，
农业生物技术学报， 2010年，
Journal of Agricultural Biotechnology,2010,Vol.18,No.5,931~937
研究报告
A Letter
山羊c-Myc 原癌基因克隆、 原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化
赵华 * 杨照海 * 刘平 卢晟盛 卢克焕 毕方方 郑喜邦 **
广西大学动物科技学院， 南宁 530005
*同等贡献作者
**通讯作者， zhxibang2005@https://www.360docs.net/doc/961787302.html,
摘 要 本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊 GST-Sox2 融合蛋白。用 RT-PCR 方法从山羊(悦葬责则葬 澡蚤则糟怎泽 )肠组织克隆了 c-Myc 基因, 通过 TA 克隆， 构建了 pMD18-T-Myc 质粒。 DNA 测序证明， 山羊 c-Myc 全长 cDNA 约 1320bp， 该序列包含一个完整的开放阅读框， 编码 439 个氨基 酸， 经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的 c-Myc 序列同源性为 99.2%。将该 cDNA片段亚克隆至 pGEX-KG载 体，构建了重组质粒 pGEX-KG-Myc。 经酶切鉴定和测序，将重组质粒导入大肠杆菌 (耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 ) BL21， 由 IPTG诱导表达， 以谷胱甘肽 -Sepharose4B 亲和纯化 GST-Myc融合蛋白。SDS-PAGE 分析表明， 纯
该融合蛋 化的 GST-Myc融合蛋白 约 75kD， 与预期值相符， 且呈现清晰的单一条带。 Western blot 检测证实，
白能够被 GST抗体所识别。本实验克隆了山羊 c-Myc 基因， 获得了高纯度的 GST-Myc 融合蛋白， 为其多克 隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料， 为山羊 iPS 细胞 (induced pluripotent stem cells)检测创造了条件。关键词 山羊，c-Myc 基因， 分子克隆， 原核表达， 蛋白纯化
Cloning and Prokaryotic Expression of Goat c-Myc Proto-oncogene,and Purification of GST-Myc Fusion Protein
Zhao Hua * Yang Zhaohai * Liu Ping Lu Shengsheng Lu Kehuan Bi Fangfang Zheng Xibang **
College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning530005,China
*The authors who contribute equally
**Corresponding author,zhxibang2005@https://www.360docs.net/doc/961787302.html,
DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.05.016
Abstract This paper was to obtain goat(Capra hircus)GST-Myc fusion protein by means of molecular cloning, prokaryotic expression and protein purification.The c-Myc cDNA of goat was amplified by RT-PCR from intestine tissues,and plasmid pMD18-T-Myc was constructed by T-A cloning.DNA sequencing showed that the cDNA was 1320bp， with a complete open reading frame that encoded439amino acids,sharing higher nucleotide homology (99.2%)with that of sheep(Ovis aries).The cDNA fragment was subcloned to pGEX-KG,and recombinant plasmid pGEX-KG-Myc was constructed,which was verified by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21,and GST-Myc fusion protein was expressed with induction of IPTG,and then purified with Glutathione-Sepharose4B argrose.Illustrated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),the purified fusion protein was about75 kD,a clear,and single band,which was expected.Western blot assay revealed that fusion protein could be identified by GST antibody.In conclution,we have cloned goat c-Myc gene,obtained GST-Myc fusion protein with higher purity,which will lead to preparation of polyclonal or monoclonal anti-Sox2antibody,and further to
DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.05.016
基金项目： 本研究由广西区自然科学基金项目(桂科自 No.0728019； 桂科自 No.0991043)、 广西亚热带生物资源保护利用重点实 验室开放课题(No.SB0907)和广西大学科研基金项目(No.X081102)共同资助
收稿日期： 2009-03-03 接受日期： 2009-04-11
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Journal of Agricultural Biotechnology
近两年来，利用特定的转录因子将体细胞诱导 为多能性干细胞(induced pluripotent stem cell， iPS 细 胞) 的研究获得了突破性进展。Takahashi 等 (2006) 利用 4 个转录因子 Oct3/4， Sox2， c-Myc 和 Klf4 ， 把 小鼠皮肤成纤维细胞诱导成为多能干细胞； Takahashi 等(2007)用同样的方法把人皮肤成纤维细 胞诱导成为多能干细胞， 该细胞可以形成嵌合体， 并 且在许多特征上与胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESCs)相似。iPS 细胞这项进展使人类有可能不再从 胚胎获得具有多向分化能力的胚胎干细胞，转而从 成体细胞直接获得。
c-Myc 原癌基因是 Neel 等(1982)最早发现的禽 类骨髓病毒 MC29 的 v-Myc 的细胞同源序列。核内 原癌基因 c-Myc 的扩增是 Collins 和 Groudine(1982) 和 Favera 等 (1982)首先报道的。 c-Myc 基因是一种 致癌基因， 存在于绝大多数人类癌症中， 在近 1/3 人 类癌症疾病中可观察到该基因高表达 (Yano et al., 1993)。自从 20 世纪 90 年代初期确立了 c-Myc蛋白 作为转录因子的本质以来，有关其下游靶基因的研 究已成为分子生物学的研究热点之一，人们寄希望 于通过研究其靶基因来阐明 c-Myc 在细胞生命过程 中所起的作用(朱 微和朱剑琴,2001)。c-Myc 的转 录能在许多发育中的组织中检测到。妊娠中期的小 鼠胚胎， 高水平 c-Myc 表达与活跃的细胞增殖相关， 它的表达下调则伴随着有丝分裂停止，分化的开始 (李江宁,2008)。
Dalla-favera 等(1982)研究发现人类伯基特淋巴 瘤细胞上的c-Myc 癌基因位于染色体 8 号区域。 Miyamoto 等 (1985)对人 c-Myc 基因进行分子克隆且 分别在大肠杆菌和酵母菌中进行表达，并比较了蛋 白产量。 朱 微和朱剑琴(2001)将人源 c-Myc 基因中 编码 bHLH/LZ结构域的 92 个氨基酸的 cDNA 片段 克隆到 pGEX-2T载体上， 诱导表达并纯化。目前， 国 内外关于山羊 c-Myc 原核表达及抗体制备的研究还 未见报道。家畜 c-Myc 的研究常因蛋白相关抗体的 不易获得而受到限制，因此制备针对山羊 c-Myc 的 高质量抗体对推动有关干细胞自我更新机制的研究 具有重要意义。本研究以山羊为研究对象， 利用基因 克隆技术，拟从山羊肠组织获得 c-Myc 基因，构建c-Myc 基因原核表达载体， 通过原核表达分离纯化得 到高纯度目的蛋白。1 结果与分析
1.1 山羊 cDNA RT-PCR 扩增
从山羊小肠组织提取总 RNA，经 RT-PCR 扩 增， 以 cDNA 为模板， 依据设定条件通过 PCR 扩增 目的片段， 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳， 得到大 小约 1320bp 的单一条带，与预期的目的片段相符 (图 1)。
1.2 pMD18-T-Myc 质粒的酶切鉴定与测序
纯化的 PCR 产物与 pMD18-T 载体连接，转化 大肠杆菌DH5琢，
构建的重组质粒经Bam H玉及Xho玉 双酶切和 1% 琼脂糖凝胶电泳， 得到 1320bp 条带， 与 PCR 产物大小相符(图 2)。 阳性质粒送往上海生工 测序，
结果表明：
山羊 c-Myc 编码序列全长是1320bp， 该序列包含一个完整的开放阅读框，编码 439 个氨 基酸(图 3)。 用 DNAStar软件将该基因核苷酸序与其
图 2pMD18-T-Myc 酶切鉴定
1：Bam H玉 和Xho 玉 双酶切；M： DNA marker DL2000
Figure2Identification of pMD18-T-Myc by restrictive enzyme digestion
1： pMD18-T-Myc digested by Bam H玉 and Xho玉?M： DNA marker
DL2000
1 M
bp
2000
1000
图 1山羊cDNA RT-PCR
1： RT-PCR产物；M： DNA marker DL2000
Figure1Electrophoresis map for RT-PCR products of goat cDNA
1： RT-PCR product?M： DNA marker DL2000
application in identification of goat iPS cells(induced pluripotent stem cells).
Keywords Capra hircus,c-Myc gene,Molecular cloning,Prokaryotic expression,Protein purification
1 M
bp
2000
1000
932
山羊 c -Myc 原癌基因克隆、 原核表达和 GST-Myc 融合蛋白纯化
Cloning and Prokaryotic Expression of Goat c -Myc Proto-oncogene,and Purification of GST-Myc Fusion Protein
它物种进行同源性比较发现，山羊与绵羊核苷酸序 列同源性最高， 达 99.2%； 与牛(Bos taurus )、 野猪(Sus scrofa )、 猫(Feline leukemia )、 犬(Canis lupus )的同源性 分别为 97.8%、 93.6%、 92.6%和 91.7%(图 4)。将测序 正确的重组质粒命名为 pMD18-T-Myc 。 1.3 重组质粒 pGEX -KG -Myc 酶切鉴定
pMD18-T-Myc 和 pGEX-KG 载体分别经过 Bam H 玉及 Xho 玉双酶切后， 把目标基因片段连接到
pGEX-KG 载体上，
转化大肠杆菌 DH5琢菌株， 获得 的重组质粒再次经 Bam H 玉及 Xho 玉双酶切鉴定， 得到 1320bp 的目的片段(图 5)。阳性质粒再次经过 测序验证， 显示目的片段含有完整的读码框， 与 GST
融合， 而且未发生移码， 说明目的基因已正确插入表 达载体。确认的阳性质粒命名为 pGEX-KG-Myc 。 1.4 重组质粒 pGEX -KG -Myc 在大肠杆菌中的诱导 表达
用空载体 pGEX-KG 和重组质粒 pGEX-KG-Myc 分别转化感受态大肠杆菌 BL21， 经 IPTG 诱导， 同时 设置未诱导重组菌液作为阴性对照。SDS-PAGE 分 析显示，诱导的重组菌液在相对分子量约 75kD 处
都有一特异性蛋白条带；未诱导的菌液没有目的带 出现；诱导的空载体在相对分子量约 26kD 处有一 条带， 系 GST 单体蛋白， 均符合预期值大小， 说明 GST-Myc 融合蛋白在大肠杆菌中成功表达(图 6)。 1.5 c -Myc 蛋白 Western blot 检测
由于预期表达产物为 N- 端含有 GST tag 的融 合蛋白，故利用该标签的特异抗体对样品进行 Western blot 分析。结果表明：
空载体在约 26kD 处 有一条清晰条带， 与 GST tag 的分子量相近； 未诱导 菌液没有条带出现；含有重组质粒的菌体蛋白出现 了一条 GST 抗体能特异性识别约 75kD 的杂交带， 同 GST 分子量与 c-Myc 的分子量之和 75kD 相吻 合， 证明表达产物具有免疫反应性(图 7)。 1.6 GST -Myc 融合蛋白的纯化
采用谷胱甘肽 -Sepharose4B 亲和层析方法对表 达的融合蛋白进行初步纯化。结果(图 8)显示： 菌体 裂解物离心后的上清液中含有该目的蛋白，说明
c-Myc 主要以可溶的形式存在；第 3 次洗脱杂蛋白
后收集的上清中没有条带，说明已将杂蛋白全部洗
脱；
纯化的 GST-Myc 融合蛋白在相对分子质量约 75
Bos taurus Canis lupus Capra hircus Feline leukemia Ovis aries Sus scrofa
Percent identity
1 1 1
1 2 2 2 2
3 3 3 3
4
5 6
4 4 4
5 5 5
6 6
6
92.0 97.9 92.3 98.0 93.5 8.4 92.2 94.3 92.2
92.6 92.6 99.2 93.6 92.7 92.3 94.0 2.2 8.1 2.1 6.8 8.3 5.6 8.3 7.8 7.8 0.8 6.7 7.8
7.7 6.3 图 4山羊 c -Myc 基因核苷酸序列与牛、 犬、 猫、 绵羊、 野猪物种 进行序列同源比较
Figure 4Nucleotide identity comparison of c -Myc gene among
Capra hircus , Bos taurus , Canis lupus , Feline leukemia , Ovis aries and Sus scrofa
图 3山羊c -My c 测序结果
ATG ： 起始密码子；TAA ： 终止密码子； 下划线部分： PCR 引物 Figure 3The DNA sequencing result of goat c -Myc gene ATG ： Start codon?TAA ： Stop codon?The underlined parts ： PCR primers
图5重组质粒pGEX-KG-Myc 酶切鉴定
M1： 姿 -Eco T14 玉 digest DNA marker ； M2： DNA marker DL2000； 1：
Bam H 玉和Xho 玉双酶切后的pGEX-KG-Myc Figure5Agorose electrophoresis detection of digested product of pGEX-KG-Myc plasmid
M1： 姿 -Eco T14 玉 digest DNA marker?M2： DNA marker DL2000? 1： pGEX-KG-
Myc digested by Ba mH 玉 and Xho 玉 M1
M2 1 bp bp
7743
6223 4254
2000 1000
19329 933
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Journal of Agricultural Biotechnology
kD 处出现单一条带，
没有其它杂带， 得到了纯化的 GST-Myc 融合蛋白。
2 讨论
本实验采用 LA Taq DNA 聚合酶代替 EX Taq
DNA 聚合酶进行 PCR 扩增，保证了 PCR 扩增的忠 实性； 采用 GC Buffer 代替 Ex Taq Buffer ， 解决了长 引物和高 GC 含量所带来的扩增难问题，成功地克 隆了山羊 c -Myc 基因。Jonak and Knight(1984)报道， 在正常生长状态下， c -Myc mRNA 在人淋巴母细胞 样细胞系 Daudi 有高水平的表达。本实验中成功地 从成年山羊的小肠组织中扩增了 c -Myc 基因。
在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原 核表达体系需要综合考虑三大因素， 即表达载体、 宿 主菌株和表达诱导条件， 以获得最满意的表达效果。 本实验采用载体 pGEX-KG ，此载体是表达 GST 融 合蛋白的高效表达载体，其所表达的蛋白产物在 N 端带有 GST 序列， GST 分子量为 26kD ， 此标签蛋白 本身溶解性高， 可增加融合表达蛋白的溶解性,也有 利于用 GST 亲和层析法纯化融合蛋白； GST 标签蛋 白在大肠杆菌 BL21 中不易被蛋白水解酶降解 (Harris,1998)。 GST
分子量大， 结构复杂， 免疫动物制 备抗体时， 免疫原性强， 用于基础免疫更有利于激发 特异性回忆反应(Lacham-Kaplan et al.,2006)。本研 究采用的宿主菌 E. coli BL21(DE3)，属于 lon 和
omp T 蛋白酶缺陷型，其胞内和胞间周质蛋白酶均 己失活，这样当进行外源蛋白的可溶性表达时， 不易
被宿主菌的蛋白酶水解而稳定存在；另外 E. coli
BL21(DE3)也是一类 T7 启动子表达菌株， 其染色体 上携带一拷贝由 lacUV5 控制的 T7RNA 聚合酶基
因，
T7RNA 聚合酶的选择性和活性保证了 T7 启动 子对外源蛋白表达的高效性和专一性，使得几乎所
有细胞资源都用于目标基因表达 (Davanloo et al., 图 8GST-Myc 融合蛋白纯化
M ： PageRuler prestained protein ladder ； 1：菌体裂解上清； 2：第 3次洗脱杂蛋白后收集的上清； 3： 纯化的GST-Myc 融合蛋白 Figure 8The purification of GST-Myc fusion protein
M ： PageRuler prestained protein ladder?1： Supernatant removed from sonicated recombinant bacterium fluid?2： Supernatant collected after the third wash of unspecific proteins?3： Purified GST-Myc fusion protein
M
1
2
3
kD
10
17 26 34 43 55 72 95 图7Western blot 检测GST-Myc 融合蛋白表达
M ： PageRuler prestained protein ladder ； 1： 诱导的 pGEX-KG 空 载体； 2： 未诱导的BL21；3~6： 用0.10、 0.25、 0.50、 1.00和 2.00 mmol/L IPTG 分别诱导 GST-Myc 融合蛋白表达 Figure 7Western blot detection of GST-Myc fusion protein M ： PageRuler prestained protein ladder?1： pGEX-KG vector with induction by IPTG?2： Recombinant E.coli BL21without induction by IPTG?3~6： Expression of GST-Myc fusion protein induced by different concentrations of IPTG (0.10,0.25,
0.50,1.00and 2.00
mmol/L)
M 1 2
3
4
5
6
7
kD 10 17 26
34 43 55 72 95 图6GST-Myc 融合蛋白的 SDS-PAGE 分析
M ： PageRuler prestained protein ladder ； 1： 诱导的 pGEX-KG 空 载体； 2：未诱导的重组菌； 3~7：用 0.10、 0.25、 0.50、 1.00 和 2.00mmol/L IPTG 分别诱导GST-Myc 融合蛋白表达； 1、 7：箭 头分别代表 GST 单体和 GST-Myc 融合蛋白
Figure 6SDS-PAGE analysis of expressed GST-Myc fusion protein
M ： PageRuler prestained protein ladder?1： pGEX-KG vector with induction by IPTG?2 ： Recombinant E.coli BL21without inducton by IPTG?3~7： Expression of GST-Myc fusion protein induced by different concentrations of IPTG (0.10,0.25,0.50, 1.00and 2.00mmol/L)?Arrows in lane 1and 7represent GST tag and GST-Myc fusion prtein ，
respectively
M
1
2
3
4
5
6
7
kD GST-Myc
GST
10
17
26 34 43 55 72 95 934
1984； Studier et al.,1990)。本研究建立了 c-Myc 基因 的原核表达体系，实验表明 IPTG 终浓度为 2.00
mmol/L 的 IPTG 诱导效果较差，可能由于高浓度 IPTG 将导致蛋白质合成速度过快而使外源蛋白在 胞内不能得到充分正确折叠，导致以不溶性包涵体 的形式表达或对菌有一定的毒害作用所致；采用低 温诱导 GST-Myc 融合蛋白表达， 基本避免了包涵体 的形成，
所得大部分融合蛋白以可溶形式存在。
本研究中 SDS-PAGE结果表明目的蛋白的表达 量在菌体中的含量明显高于其它蛋白质组分，说明 该表达系统较适于 c-Myc 基因的表达。Western blot 分析，融合蛋白能与 GST 抗体产生特异性免疫反 应， 提示 pGEX-KG-Myc 在 BL21 中表达的重组抗原 能够正确折叠， 保持着具有活性的免疫功能区， 具有 抗原特异性，为进一步研究 c-Myc 重组蛋白的免疫 原性提供基础资料。纯化的 c-Myc 蛋白可以用于制 备抗 c-Myc 蛋白抗体。
3 材料与方法
3.1 材料
TR Izol LS R Regen t RNA 提取试剂盒购自 Intrivigen 公司 (美国)；反转录试剂盒、 Ex Taq DNA 聚合酶、 2伊 GCBuffer玉、 dNTP、限制性内切酶Bam H玉、Xho 玉， 质粒 pMD18-T、 IPTG 及 Marker 购自 Takara 生物公司(日本)； 引物合成及 DNA 序列测定均由上
海生工公司完成；T
4
DNA 连接酶和预染蛋白 Marker 购自 Fermentas 公司(立陶宛)； 感受态大肠杆 菌(Escherichia coli)DH5琢和 BL21、 载体 pGEX-KG 由本实验室保存；质粒小提试剂盒、胶回收试剂 盒、 鼠源 GST 标签抗体、 辣根过氧化物酶(HRP)标 记的山羊抗鼠 IgG， 以及化学发光剂均购自天根公 司(北京)。
3.2 山羊 RNA 的提取
从当地屠宰场无菌采集新鲜成年山羊(Capra hircus) 小肠组织， 2~3h内送回实验室。将肠组织用 灭菌的手术剪剪碎， 放入研钵中加液氮充分研磨。边 磨边补充液氮，把研磨成粉沫状的组织用药匙移入 DEPC 处理好的 1.5mL EP 管中， 加 1mL TRIzol， 涡 悬混匀，室温放置 5min；再加入 200滋 L预冷的氯 仿， 振荡混匀， 室温放置 10min； 12000r/min、 4 ℃离 心 15min， 取上清 500滋 L， 加等体积预冷的异丙醇 室温静置 10min， 12000r/min、 4 ℃离心 10min； 弃 上清，
加入75%冰冷乙醇500滋 L，
旋涡振荡混匀， 7500 r/min 离心 5min； 弃上清， 倒置风干， 用适量的 DEPC 处理水溶解，原 20 ℃冻存备用。
3.3 目的片段克隆与测序
根据 GeneBank 中绵羊(Ovis aries)c-Myc mRNA 序列设计。
上游引物： CGGGATCCGCCATGCCCCTCAACGTCAGCTTCGCC；
Bam H玉
下游引物： CCGCTCGAGTTAGGCGCAAGAGTTCCGTATC。
Xho 玉
预计扩增片断长度为 1320bp，
引物由上海生物 工程公司合成。从山羊小肠组织提取总 RNA， 再反 转录为 cDNA，以 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增， PCR 反应体系为：12.5滋 L2伊 GC Buffer I， 2.5滋 L dNTP(10mmol/L)， 正、 反义引物(20滋 mol/L)各 0.5滋 L， 0.15滋 L Ex Taq DNA 聚合酶，模板 cDNA 0.75滋 L， 加 ddH2O8.1滋 L 补足至 25滋 L 体系。反应条件 为： 94 ℃ 3min 预变性， 94 ℃ 30s 变性， 61.6 ℃ 90s 退火， 72 ℃ 1min 延伸，共 30 个循环， 72 ℃延伸 10 min。经 1%琼脂糖凝胶电泳、 切胶后， 用胶回收试剂 盒纯化 PCR 产物。目的片段与 pMD18-T载体 16 ℃
连接过夜，
次日转化 DH5琢感受态细菌。转化菌液涂 布在含氨苄青霉素的 LA 平板上， 37 ℃培养 16~21 h。 挑取阳性菌落加入含 5mL LB(含氨苄青霉素 100滋 g/mL) 的试管中,37 ℃振荡培养 12~16h。小提质 粒， 分别用 Bam H玉和 Xho 玉进行双酶切鉴定， 鉴定 的阳性克隆送上海生物工程公司测序。
3.4 山羊 c-Myc 基因原核表达载体构建
选择测序正确的 pMD18-T-Myc 质粒，分别用Bam H玉和Xho玉 将 pMD18-T-Myc 与表达载体 pGEX-KG 进行双酶切， 胶回收目的片段与线性化的 pGEX-KG 载体，用 T4 DNA连接酶 16 ℃连接过夜。 连接产物转化 DH5琢感受态细菌， 培养、 挑斑、 増菌、 双酶切鉴定和测序， 具体方法同 3.3。
3.5 重组质粒在大肠杆菌中诱导表达
将测序正确的重组质粒命名为 pGEX-KG-Myc， 并将其转化大肠杆菌 BL21感受态细菌， 涂板、 挑菌， 在含 Amp 的 LB 培养基中 37 ℃振荡培养过夜后， 取 重组菌按 1颐 100 体积比接入含氨苄青霉素的 30mL LB 培养基中， 220r/min、 37 ℃振荡培养至OD600=
o 山羊 c-Myc 原癌基因克隆、
原核表达和 GST-Myc融合蛋白纯化
Cloning and Prokaryotic Expression of Goat c-Myc Proto-oncogene,and Purification of GST-Myc Fusion Protein
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0.4~0.6 时， 取出 2mL菌液作为空白对照； 剩下菌液 分 5 管，分别加入终浓度为 0.10， 0.25， 0.50， 1.00 和 2.00mmol/L的 IPTG， 在 37 ℃诱导表达 4h。收集 1 mL菌液分装于 1.5mL 的离心管中， 以 10000r/min 离心 1min， 弃上清， 加入 80滋 L1伊 SDS 于各 EP 管 中混匀，混匀后置冰上 10min，煮沸 5min， 12000 r/min3min 吸取上清 7滋 L 进行 12%SDS-PAGE 电 泳， 电压 80~100V。 电泳完毕后， 将凝胶取下，
用考马 斯亮蓝染色 2~3h， 然后用脱色液脱色 1~2h。
3.6 c-Myc 蛋白 Western blot 检测
在确定最佳诱导条件后， 诱导表达 GST-Myc 融 合蛋白，
取蛋白样品进行 SDS-PAGE。以湿转法将目 的蛋白转到 NC(硝酸纤维素)膜上， 再用 TBST 配制 的 10%脱脂奶粉 4 ℃封闭过夜。用 TBST 漂洗转印 膜 3 次，
每次 10min。加入 GST 抗体(1颐 1000)室温孵 育 1.5h， TBST 漂洗 3 次。再加入 HRP 标记的山羊 抗鼠 IgG(1颐 1000)， 室温孵育 1h， 再用 TBST 漂洗 3 次。洗膜后用化学发光剂显色 5min， 用保鲜膜包裹 NC 膜， 用胶布固定在暗盒内， 压 X光片， 曝光。经显 影、 定影， 用预染蛋白 Marker 判定目的蛋白的相对 分子质量。
3.7 GST-Myc 融合蛋白纯化
将诱导成功的 GST-Myc阳性重组菌按 1颐 100 体 积转接于 5mL LB 液体培养基中， 37 ℃振荡培养过 夜。将活化的菌液按 5% 的接种量转接至事先预热 至 37 ℃的 200mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37 ℃培养至 OD600 值达到 0.4~0.6 时， 加入终浓度为 1mmol/L IPTG， 22 ℃继续培养过夜。将诱导的菌液 离心收集于 50mL离心管中。 弃上清, 加入含适量溶 菌酶(lysozyme)的裂解液， 混匀后超声破碎菌体, 加 入适量已平衡好的谷胱甘肽 -Sepharose4B 小颗粒， 4 ℃结合，离心收集结合有目的蛋白的谷胱甘肽 -Sepharose4B 小颗粒。用不含溶菌酶的裂解液洗涤 非特异性杂蛋白。 还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱 GST- Myc融合蛋白。 最后用 SDS-PAGE 分析 GST-Myc 融 合蛋白纯度。纯化后蛋白冷冻干燥保存于原 70 ℃冰 箱待用。
参考文献
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cell line,Nature,298(2):679~681 Dalla-favera R.,Bregni M.,Erikson J.,Patterson D.,Gallo R.C., and Croce C.M.,1982,Human c-myc onc gene is located on the region of chromosome8that is translocated in
Burkitt lymphoma cells,Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,79:7824~7827 Davanloo P.,Rosenberg A.H.,Dunn J.J.,and Studier F.W.,1984, Cloning and expression of the gene for bacterio a Phage T7 RNA polymerase,Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,81:2035~2039
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山羊 c-Myc 原癌基因克隆、
原核表达和 GST-Myc融合蛋白纯化 Cloning and Prokaryotic Expression of Goat c-Myc Proto-oncogene,and Purification of GST-Myc Fusion Protein
利用 RNA-seq 法对人真菌病原体白色念珠菌转录组进行广泛注释
Comprehensive Annotation of the Transcriptome of the Human Fungal
Pathogen Candida albicans Using RNA seq
白色念珠菌(Candida albicans)是侵袭人类的主要真菌病原体， 从表面粘膜感染到不断散播引起系统性感染而引起多种疾 病通常都是致命的， 它引起疾病是依靠其适应不同的环境刺激来改变自身的转录组水平以确保在不同的宿主环境下生存。耶 鲁大学、
斯坦福大学和美国能源部联合基因组研究所的研究人员通过测序手段发现了白色念珠菌大量新的转录活性区域和新 的内含子。这一研究结果发表在 《Genome Research》 上。
研究人员在 9种不同的体外条件下培养白色念珠菌(菌株 SC5314)， 提取总 RNA后纯化出 poly(A)mRNA， 通过高通量的 RNA-seq法构建了一个不同条件下白色念珠菌转录组高分辨率图谱。运用 RNA-seq数据集， 通过确定不同转录本在基因组中 位置进一步精炼了白色念珠菌的主要基因组信息注释， 鉴定了 602个新的转录活性区域和 41个新的内含子。有趣地是， 许多 新鉴定的转录活性区域是受环境条件特异性的方式调节的。研究人员将获得数据进行了聚类分析和功能富集分析， 并用实时 荧光定量PCR的方法对其中的 41 个基因(包括26个新转录本和 15已注释转录本)进行了验证。这些结果不仅增加了对白色 念珠菌现有基因组信息的注释，
也为更全面地理解其发病机理的分子机制提供必需的基础资料。
编者：
王志伟、
应正宙(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所)，
本刊通讯员
本文引用格式： 王志伟、 应正宙，2010, 利用 RNA-seq法对人真菌病原体白色念珠菌转录组进行广泛注释， 农业生物技术学报, 18(5)： 937
信息来源： https://www.360docs.net/doc/961787302.html,/content/early/2010/08/31/gr.109553.110.long
937
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种
单克隆抗体手册
单克隆抗体技术 第一节单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的着名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。 （二）、基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，
表达蛋白的分离与纯化
表达蛋白的分离与纯化 大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。 一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白） （一）试剂准备 采用T7· Tag Affinity Purification Kit 1．T7·Tag抗体琼脂。 2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3.
0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。 4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。 5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。 1.PEG 20000。 （二）操作步骤 1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。 2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。 3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。 4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。 5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。 6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。 7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。 8.用PEG 20000浓缩蛋白。 （三）注意事项 蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。 二、包涵体的纯化
绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
什么是高丙种球蛋白血症
什么是高丙种球蛋白血症？ 血清蛋白以盐析法可以分为白蛋白和球蛋白。正常成人球蛋白估量为20～30g/L，超过35g/L称为高球蛋白血症。血清球蛋白浓度的升高主要取决于免疫球蛋白的含量，而α1、α2和β球蛋白一般变化幅度较小，不引起明显的高球蛋白血症。 高丙种球蛋白血症病因概要： 高丙种球蛋白血症的病因主要为：高丙种球蛋白血症离不开B细胞的生长、发育、活化与增殖。某些可以促进B细胞活化增殖的免疫活性细胞增殖或分泌细胞因子亦可促使B细胞功能增强。 高丙种球蛋白血症详细解析： 高丙种球蛋白血症的病因和发病机制 高丙种球蛋白血症离不开B细胞的生长、发育、活化与增殖。成熟的B细胞离开骨髓到达外周淋巴器官，接受适当的抗原刺激和T细胞提供的活化信号，并在多种免疫活性细胞分泌的细胞因子作用下，B细胞活化成为母细胞，大量分裂增殖。在细胞分裂过程中，每个子代细胞均可在免疫球蛋白的可变区基因发生突变，而产生具有多种不同可变区的免疫球蛋白，即为多克隆免疫球蛋白产生的基础。此后B细胞发育成能分泌大量免疫球蛋白的浆细胞。若因CD40L基因缺陷或其他原因造成类型转换障碍，则出现单纯高lgM血症，伴有其他类型免疫球蛋白减少甚至缺乏。肝脏疾病时由于损伤的干细胞不能清除从肠道来的抗原，或由于门体分流而抗原直接进入体循环，大量不同抗原刺激B细胞产生抗体.故可有多克隆免疫球蛋白明显升高。高丙种球蛋白血症病理状态下机体的自身成分以及恶性肿瘤的组分均可刺激B细胞活化，进而合成免疫球蛋白。同时，某些可以促进B细胞活化增殖的免疫活性细胞增殖或分泌细胞因子亦可促使B 细胞功能增强，可以解释部分非B细胞来源的淋巴增殖性疾病如Castleman病、血管免疫母细胞淋巴瘤等疾病时的高球蛋白血症。 寡克隆丙种球蛋白来自于限制性激活的B细胞克隆，引起B细胞寡克隆增生的原因可能与抗原的本质、免疫系统的反应性缺失或接触抗原的组织缺少免疫活性细胞等有关。寡克隆雨种球蛋白可能属于一种或多种免疫球蛋白类型，在本质上仍属于多克隆起源，其轻链具有κ和λ两种，而不是像单克隆免疫球蛋白那样仅具有单一的轻链型。但是，多克隆和寡克隆的B细胞在病因持续存在的条件下，可发生克隆演化，某一单克隆的B细胞获得生长优势，最终可能进展为相应的淋巴增殖性疾病。临床上熟知的结缔组织病如干燥综合征发生淋巴瘤的机会为正常人群的40～100倍。 单克隆免疫球蛋白由结构、功能完全相同的免疫球蛋白或其片段组成，来源于同一株B细胞或浆细胞。这是由于B细胞在发育过程中分化停滞于某一阶段
单克隆丙种球蛋白病的检测方法
第三节单克隆丙种球蛋白病的检测方法 单克隆丙种球蛋白病的实验室诊断主要依靠血液学和免疫学手段。其中免疫学检测尤为重要。一般，免疫球蛋白的多数分析测定技术都可用于丙种球蛋白病的检测。当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变疾病时，首先应该做血清蛋白区带电泳，如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫球蛋白测定与免疫电泳，作进一步定量分析和免疫球蛋白分类鉴定。注意作追踪观察，以助病情、疗效的了解和预后的推断。良性或继发患者往往是在体检或其他检查中，进行血清蛋白区带电泳而发现的。当疑为冷球蛋白血症或轻链病时，均应进行冷球蛋白测定或本周蛋白测定加以证实。 一、血清蛋白区带电泳 蛋白质区带电泳是血清蛋白的经典分析方法，血清（或尿液）标本中不同性质的蛋白质可明显分开形成不同的区带，通过正常的电流图谱进行比较分析，很容易发现患者电泳图谱不一狭窄而浓缩的集中带，即M区带（图26-1），这是由于M蛋白的化学结构高度均一，因而其电泳迁移率十分一致。如果将这些区带电泳图谱扫描，还可计算出异常蛋白的含量和百分比。这种M区带较多见于γ或β区，偶亦可见于α区。M区带的电泳位置可大致反应出免疫球蛋白的类型，IgG型多位于α区至γ慢区，IgA型多位于γ1与β区，IgM型多位于β2或γ区，IgD型多位于β或γ区。但是区带电泳不能完全确定免疫球蛋白的类型，最终确定还需用特异性抗体进行鉴定。 在某些情况下还可以出现假的狭区带，易与M蛋白混淆，应注意区别。例如溶血标本中血红蛋白形成的β位区带，陈旧血清中聚合IgG形成的近原位窄区带，以及由类风湿因子形成的位于γ区中间的细区带都易于M区带相混淆，遇到这些可疑情况时，应进一步做免疫电泳等分析加以区别。 非分泌型骨髓瘤患者血清蛋白区带电泳中不能检出单克隆丙种球蛋白的M区带，往往呈现低丙种球蛋白血症的特征，临床上却存在浆细胞骨髓瘤的表现。为明确诊断需对患者骨髓中恶性浆细胞进行表面免疫荧光染色分析，或提取其恶性浆细胞，经溶解后再行免疫球蛋白分析。轻链病有时血清中也检测不出M蛋白，这就需要进行尿中本周蛋白的检测。多克隆丙种球蛋白病是临床上更为常见的一类疾病，其病因与单克隆丙种球蛋白病明显不同，是受一些抗原刺激引起多株细胞过度免疫应答的结果。因此，血清蛋白电泳图谱是在γ区域呈现着色深浓、宽阔而不匀的区带，易与M蛋白相区别。多克隆丙种球蛋白病中免疫球蛋白的升高谱型大多无特异性，一般以IgG升高为多，可伴IgA或IgM 升高，也可IgA或IgM单独升高。低丙种球蛋白血症则表现为γ区的缺失。结缔组织中多克隆丙种球蛋白增高有随疾病严重程度而升高的趋势，而肝病中的增高程度也可用来估计肝损伤的程度。 二、免疫球蛋白定量测定 免疫球蛋白定量测定较常用的方法有单向扩散法与免疫浊度法，前者较为简便，后者更为准确迅速。恶性单克隆丙种球蛋白病常呈现某一类丙种球蛋白的显著增高，大多在30mg/ml以上；而正常的免疫球蛋白，包括与M蛋白同类的丙种球蛋白的含量则显著降低。在良性丙种球蛋白病的血清标本中，M蛋白的升高幅度一般不象恶性丙种球蛋白病那么高，多在20mg/ml以下；M蛋白以外的免疫球蛋白含量一般仍在正常范围之内。如在单向扩散试验中出现双圈状沉淀环，则标本中可能存在某种免疫球蛋白片段的M蛋白。多克隆丙种球蛋白病患者的血清中常有多种类型的免疫球蛋白水平同时升高，每类上升的幅度不太大，但总的丙种球蛋白水平增主比较明显。 免疫球蛋白的定量检测，有时会由于不同实验室所用抗血清特异性的差异，而造成M蛋白定量结果的不同，特别在使用某一株M蛋白制备的抗血清检测其他患者的M蛋白时。如能配合作用区带电泳光密度扫描，常可纠正这种误差。
单克隆抗体药物
浅谈单克隆抗体药物 摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
蛋白的纯化
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
单克隆免疫球蛋白血症
单克隆免疫球蛋白血症 单克隆免疫球蛋白血症可分为原发性单克隆免疫球蛋白血症和继发性单克隆免疫球蛋白血症。其病因尚不明了，可能与多种因素刺激导致单克隆B细胞-浆细胞过度增殖并分泌单克隆免疫球蛋白有关。原发性单克隆免疫球蛋白血症患者一般不具有多发性骨髓瘤或其它B淋巴细胞增生性疾病的症状和体征（如贫血，淋巴结肿大，浆细胞瘤，骨损害和淀粉样沉积）。有些患者常常是因蛋白电泳偶然发现血、尿中出现M蛋白而诊断。目前的处理标准是观察不需治疗。 1疾病简介 单克隆免疫球蛋白血症既可是浆细胞病的特征，也可出现于某些浆细胞疾病或原因不明。伴发于非浆细胞病的单克隆免疫球蛋白血症称为继发性单克隆免疫球蛋白血症；原因不明的单克隆免疫球蛋白血症称为“意义未明单克隆免疫球蛋白血症”(MGUS)，其诊断依据是血中出现单克隆免疫球蛋白，但既无浆细胞病也无可引起免疫球蛋白增多的其它疾病的存在。意义未明单克隆免疫球蛋白血症无需特殊治疗，但需长期随诊，因为部分患者可发展为多发性骨髓瘤。 2疾病分类 单克隆免疫球蛋白血症可分为①原发性单克隆免疫球蛋白血症；②继发性单克隆免疫球蛋白血症。 3定义 意义未明单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）也称为原发性单克隆免疫球蛋白血症，其特点是患者无恶性浆细胞病或可引起免疫球蛋白增多的疾病，单克隆免疫球蛋白水平升高有限（血M蛋白小于30g/l），骨髓浆细胞小于10%，尿中少量或无M蛋白，无溶骨性损害，无浆细胞病相关性贫血、高钙血症或肾功能不全。无需特殊治疗，需要长期随诊，因为部分患者可发展为多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症或淋巴瘤。患者多因体检或患其它无关疾病进行检查时发现。 4发病原因 病因尚不明了，可能与多种因素刺激导致单克隆B细胞-浆细胞过度增殖并分泌单克隆免疫球蛋白有关。
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.360docs.net/doc/961787302.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
蛋白表达纯化流程
第一章蛋白表达纯化 一、诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜; 2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜; 3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时; 4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。 二、蛋白纯化 2.1重组蛋白的提取 2.1.1 提取缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。 2.1.2 方法 1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬； 3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。 4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。 5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分 析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。 6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。