微生物发酵法提取甲壳素的国内外研究进展
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甲壳素(Chitin)是自然界中唯一带正电荷的
天然高分子聚合物，学名为(1,4)-2-乙酰氨基-2-
脱氧-β-D-葡萄糖(C 8H 13NO 5)n。它的来源极为
广泛，主要存在于甲壳动物外壳、软体动物内骨
骼、昆虫表皮、菌类及藻类等微生物的细胞壁
中。每年地球上的生物合成量约为100亿t，是产
量仅次于纤维素的第二大可再生资源，也是除蛋白质外数量最大的含氮天然有机高分子。甲壳素收稿日期：2011-08-11 *通讯作者
作者简介：程倩(1986—)，女，湖北天门人，博士研究生，研究方向为食品科学。
性能独特、组织相容性良好、可生物降解，其开发应用已涉及工业、农业、国防、化工、环保、食品、医药、保健、美容、纺织等诸多领域。目前，工业上用来生产甲壳素的主要原料是水产加工厂废弃的虾壳和蟹壳，其甲壳素的含量一般在15%~40%，蛋白质含量为20%~40%，碳酸钙含量为20%~50%。制备甲壳素的方法主要包括脱盐、脱蛋白、脱色等３个步骤，即采用稀盐酸程 倩1，吴 薇2，籍保平1*
(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；
2.中国农业大学工学院，北京 100083)
摘要：甲壳素是含氮天然有机高分子，具有优良的生物活性、安全性和降解性，在农业、化工、环保、食品、医药等行业有着巨大的应用前景。甲壳素制备方法主要有传统的酸碱法以及新兴的微生物发酵法。对微生物发酵法提取甲壳素的国内外研究进行综述，并探讨了微生物发酵的问题及今后的研究方向。
关键词：甲壳素；发酵；提取；进展
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)03-0040-04
Progress on the extraction of chitin by microbial fermentation
CHENG Qian 1, WU Wei 2, JI bao-ping 1*
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083; 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083 )Abstract: Chitin is a nitrogen-containing natural organic polymer, possesses excellent biological activity, safety and degradability, and has a great prospect in agriculture, chemical industry, environmental protection, food, pharmaceutical and other industries. The traditional acid-base method and the emerging microbial fermentation are two main methods for chitin preparation. In this paper, the advance of the extraction of chitin by microbial fermentation at home and abroad was illuminated. At last, the method of fermentation was also discussed.
Key words: chitin; fermentation; extraction; progress
微生物发酵法提取甲壳素的国内外研究进展
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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2012年 第37卷 第3期
浸泡脱去碳酸钙，稀氢氧化钠或氢氧化钾溶液进行碱煮脱去蛋白质和脂类物质，高锰酸钾或过氧化氢溶液漂白。前两个步骤的顺序可以互换，但如果要回收蛋白质的话就需先进行脱蛋白处理。该化学法操作简单方便、效率高，但存在一定危险性，能源和资源消耗较大；加工过程产生大量的酸碱废液，对环境污染严重，处理费用高；长时间酸碱作用下甲壳素易发生解聚、异构化、脱乙酰化等现象导致产品结构不均一；此外，蛋白质、钙、虾青素等有效成分很难回收利用。由于化学法存在以上诸多缺陷，学者们尝试做了很多的改进。用乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸代替盐酸作脱钙剂，得到甲壳素的品质更高，另外EDTA 还可回收，柠檬酸与钙反应生成的柠檬酸钙还可以作为补钙剂利用，降低了制备成本，又提高了产品的附加值。随着生物技术的发展，酶法也被应用于甲壳素的提取。Alcalase、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶等大量的商业酶已见于脱蛋白的研究。酶法虽大大降低了污染物的产生，减少了能耗，但却存在耗时长、效率低、成本高、脱蛋白不充分等不足之处。微生物发酵法是一种从虾壳和虾头中制备甲壳素和壳聚糖崭新的思路和方法。微生物发酵法即以虾壳和虾头等废弃物为底料，利用微生物在其生长繁殖过程中产酸去除矿物质，产蛋白酶去除蛋白质。相比传统的酸碱法，微生物发酵法不仅反应条件温和，耗能少，而且发酵过程不会水解甲壳素，可以得到较大分子量的甲壳素产物，另外不会产生酸碱废液，对环境友好，同时可大量降低生产用水，其他副产物能被有效回收利用。但目前此方法还处在实验室研究阶段，尚未大规模应用到工业化生产中。以下将从国外、国内开展的研究着重介绍微生物发酵提取甲壳素的最新进展。1 国外研究进展1.1 生物处理脱盐微生物发酵产生有机酸可以将虾、蟹等加工下脚料中的钙溶解起到脱盐的作用，乳酸菌发酵消耗葡萄糖往往能产生大量乳酸，因而常被用于发酵提取甲壳素的研究对象。发酵产酸的速度与总量取决于接种量、碳源及其浓度、壳浓度、壳大小、温度等因素。Jung等[1]比较了Lactobacillus paracasei KCTC-3074发酵与2 mol/L HCL、不同浓度EDTA、不同浓度乳酸等方式处理蟹壳的脱盐效果，脱盐后上述方法各自所得甲壳素残渣最低灰分含量为18.3%、0.1%、0.2%和5.0%，由此可知，发酵相对于传统化学方法而言，脱盐率(DM)要低得多。他们又分别研究了该菌株不同接种量与糖浓度[2]、不同温度、壳浓度和大小[3]对发酵脱盐的影响，结果表明：DM与pH值呈负相关，而与总酸度呈正相关；糖浓度对微生物的生长与pH 的下降起着关键作用，接种量超过5%后影响并不显著；25~35 ℃的温度范围和0.84~35 mm的壳大小范围对DM影响甚微，壳浓度对DM有重要的影响，壳在培养基中的淹没程度决定了DM的高低；10%的接种量、10%的葡萄糖、10%的壳浓度、30 ℃发酵5 d后DM为80%。Choorit等[4]利用响应曲面法优化Pediococcus sp. L1/2发酵虾头脱盐的最佳条件，在蔗糖浓度为50 g/L、起始pH值为7.0、发酵
36 h后DM可以达到83.47%。
1.2 生物处理脱蛋白
微生物发酵法脱蛋白，主要是通过环境友好的真菌或细菌的发酵体系中产生的“酵素”将蛋白质水解从而达到去除的目的。用于研究发酵脱蛋白的菌种有Lactobacillus sp.、Bacillus sp.、Pseudomonas sp.和S.marcesce等。微生物脱蛋白的效率比较低，脱蛋白率(DP)一般在40%~88%，主要与使用的原料和菌种、发酵类型和时间有关。Yang等[5]比较了Bacillus subtilis Y-108、Bacillus subtilis CCRC 10029、Pseudomonas maltophilia CCRC 10737这3株菌的脱蛋白效果，结果显示Bacillus subtilis Y-108效果最好，发酵3 d，未经处理的虾壳DP为88%，盐酸处理过的虾壳DP 降至76%。王三郎等[6]利用Bacillus sp. TKU004和S. marcescens TKU011发酵鱿鱼软骨提取β-甲壳素，3 d后DP分别达到73%和80%。选用Pseudomonas aeruginosa K-187液态发酵虾-蟹壳粉、虾壳、虾头，7、5、5 d后DP分别达到
55%、48%、61%；固态发酵虾-蟹壳粉、酸化虾-蟹壳粉、虾壳、虾头，10、10、5、5 d后DP
分别达到68%、46%、82%、81%；通过比较发现，Pseudomonas aeruginosa K-187脱蛋白活力比Pseudomonas maltophilia高。Jo等[7]筛选Serratia marcescens FS-3发酵蟹壳，7 d后DP为84%，同时产生了47%的DM。此外研究还表明：壳浓度影响脱蛋白率，当壳浓度在5%~10%时，全部没在培养基中，液态发酵的DP为80%；当壳浓度在
· 42 ·20%~30%时，半固态或固态发酵的DP为55%。根
据前人的研究结果，微生物发酵脱蛋白的效果要
优于其本身所产的酶。
1.3 生物处理脱盐脱蛋白
乳杆菌在发酵过程中既能产生有机酸又能产
生蛋白酶，是从生物原料中采取一次发酵提取甲
壳素的理想菌种。现有关于乳杆菌的报道较多。
Zakaria等[8]利用Lactobacillus paracasei A3在旋转卧
式生物反应器中发酵螯虾废料，5 d后DM和DP分
别为61.0%和77.5%。Rao等[9]在鼓式反应器中接种
10%的Lactobacillus plantarum 541、加入5%的葡萄
糖，发酵1 d后，虾头的DP和DM为83%、88%，
虾壳的DP和DM为66%、63%。经过发酵所得残渣
再用4%NaOH和4%HCL处理后，灰分含量都降至
1%以下，符合甲壳素工业级要求(矿物质含量低
于3%)[10]。Cremades等[11]对螯虾下脚料进行浮沉处
理脱去部分蛋白质后，接种Lactobacillus paracasei
A3，发酵3 d后所得甲壳素中蛋白质和灰分含量分
别为2.07%和1.34%。Cira等[12]对碳源及其浓度、
接种量等发酵因子进行优化，结果表明：在添加
10%的蔗糖、接种5% Lactobacillus sp.strain B2的前
提下，虾壳废料在固态塔式反应器中可以发酵保
藏至少3个月。2 kg规模的虾壳废料发酵6 d后达到
最高DM和DP分别为85%、87.6%，此时甲壳素中
含6.31%的钙和16.5%的蛋白质，该粗品经0.5 mol/
L HCL和0.4 mol/L NaOH处理后，钙含量在1%以
下，蛋白质含量在2%以下。Xu等[13]利用L. casei
MRS1分别发酵P. monodon和Crangon crangon两种虾
壳，前者发酵4.8 d后DM和DP为99.6%、97.4%，
所得甲壳素蛋白质和钙含量为5.8%、0.4%；后者
发酵4 d后DM和DP为99.7%、90.8%，所得甲壳素
蛋白质和钙含量为6.7%、0.3%。以上所得甲壳素
产品均符合工业级要求。
为了更好地提高发酵的效果，最大程度地
脱除钙盐和蛋白质，有学者尝试了共培养和分步
连续培养的发酵方式。Jung等[14]将产乳酸的菌株
Lactobacillus paracasei KCTC-3074和产蛋白酶的
菌株Serratia marcescens FS-3也进行共培养，结果
表明共培养比各自单独培养脱盐效果都要好，但
脱蛋白效果不如Serratia marcescens FS-3单培养，
这可能由于Lactobacillus paracasei KCTC-3074产
生酸抑制了蛋白酶的活性。共培养条件下，DM
和DP分别为97.2%和52.6%。为进一步提高脱蛋
白的程度，他们[15]首次采取了分步连续发酵的方
法，通过比较L. paracasei KCTC-3074单发酵、S. marcescens FS-3单发酵、先L. paracasei KCTC-3074后S. marcescens FS-3发酵、先S. marcescens FS-3后L. paracasei KCTC-3074发酵等不同策略的发酵效果，得出第4种方式最佳，DM和DP分别达到94.3%和68.9%。影响发酵脱盐脱蛋白效果的因素很多，如壳浓度、糖浓度、起始pH、接种量、发酵时间、温度、搅拌速度、氧气环境等。Ghorbel-Bellaaj 等[16]通过Plzckett-Burman 设计挑选出壳浓度、糖浓度、发酵时间、接种量为主要影响因子，并通过效应曲面法进行了优化，最终得出Pseudomonas aeruginosa A2发酵的最佳条件为：50 g/L虾壳、50 g/L葡萄糖、5 d、OD值为0.05的接种量，该条件下DM和DP分别达到96%、89%。Bhaskar等[17]通过响应曲面法优化了Pediococcus acidolactici CFR2182的发酵条件，在5%的接种量、15%的糖浓度、发酵3 d的条件下最低pH值为4.3，虾壳的DM和DP分别为72.5%、97.9%。Pacheco等 指出温度对lactic acid bacteria发酵虾壳的脱盐脱蛋白效果有重要影响，通过响应曲面法研究了温度、TTA与DM的关系，并建立数学预测模型。温度范围为15~45 ℃时，35 ℃发酵最优，发酵6 d后残渣中灰分和蛋白质含量为18.21%和7.72%。2 国内研究进展虽然近年来国内对如何利用虾壳和虾头等工业废弃物做了不少的研究，但采用微生物发酵提取甲壳素的报道并不多见。周湘池等[19]从虾壳中分离到1株乳杆菌BR-3，当接种量为10%、葡萄糖浓度为4.5%、固液比为1:3、发酵温度为(35±2) ℃、发酵时间为3~4 d时，平均灰分去除率达95.67%，甲壳素产品灰分含量均小于6%，最低可达1%。段杉等[20]利用嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳酸杆菌的共生体系发酵7 d，脱钙率、脱蛋白率、脱色素率分别达到91.3%、97.7% 和 32.3%。由此可见，微生物发酵用于甲壳素的制备在国内的研究尚处于起步阶段，尽管已经取得的一些实验室结果还算理想，但离扩大到中试甚至到最后的工业化生产还有很长距离。3 结语到目前为止，所有发酵相关的研究都旨在评价生物处理的脱盐和脱蛋白效果。用于发酵提取
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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2012年 第37卷 第3期
甲壳素的微生物种类有乳杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、片球菌属、沙雷菌属和黑曲霉等，其中以乳杆菌属的报道最多。以上所有菌都能产生有机酸和蛋白酶起到脱盐脱蛋白的作用，但不同的微生物自身产酸和产蛋白酶的能力不一样，在不同的培养条件下微生物的生长以及发挥的效力也存在较大的差异。虽然通过筛选良菌、组合不同的发酵方式、优化发酵条件等手段已获得具有较高纯度的甲壳素产品，但符合工业级要求的却极少。绝大多数研究结果都存在一个共性的问题，即产生的酸和蛋白酶不足，导致脱盐和脱蛋白不够充分，同时酸的生产速度不能有效地阻止虾壳废料的腐败。因此，作为一种环保节能生产技术的发展方向，微生物发酵提取甲壳素的研究有待不断的突破和完善。今后需要努力的工作有：进一步筛选产酸和产蛋白酶能力强的优势菌株；优化培养基和发酵因子，提高发酵的效果；生物法与化学法等相结合，通过发酵所得产品可经过后期少量的酸碱处理进行纯化；解决规模扩大的技术问题，真正实现微生物发酵提取甲壳素的工业生产。参考文献：[1] Jung W J, Jo G H, Kuk J H, et al. Demineralization of crab shells by chemical and biological treatments[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2005,10(1):67-72[2] Jung W J, Kuk J H, Kim K Y, et al. Demineralization of red crab shell waste by lactic acid fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2005,67(6):851-854[3] Oh K T, Kim Y J, Nguyen V, et al. Effect of Crab Shell Size on Bio-demineralization with Lactic Acid-Producing Bacterium,Lactobacillus paracasei subsp tolerans KCTC-3074[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2008,13(5):566-570[4] Choorit W, Patthanamanee W, Manurakchinakorn S. Use of response surface method for the determination of demineralization efficiency in fermented shrimp shells[J]. Bioresource Technology,2008,99(14):6168-6173[5] Yang J K, Shih I L, Tzeng Y M, et al. Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes[J]. Enzyme and Microbial Technology,2000,26(5-6):406-413[6] Wang S L, Kao T Y, Wang C L, et al. A solvent stable metalloprotease produced by Bacillus sp TKU004 and its application in the deproteinization of squid pen for beta-chitin preparation[J]. Enzyme and Microbial Technology,2006,39(4):724-731[7] Jo G H, Jung W J, Kuk J H, et al. Screening of protease-producing Serratia marcescens FS-3 and its application to deproteinization of crab shell waste for chitin extraction[J]. Carbohydrate Polymers,2008,74(3):504-508
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· 44 ·南瓜多糖已被国内外公认为具有降血糖作用，但是到目前为止其具体的作用机制还不是很收稿日期：2011-08-16
基金项目：广州市科技计划项目(2010Z1-E191)
作者简介：万艳娟(1987—)，女，湖北安陆人，硕士，研究方向为食品化学与营养。
清楚。有研究表明，α-淀粉酶抑制剂能抑制肠道内唾液及胰α-淀粉酶的活性，阻碍食物中淀粉及万艳娟，刘晓娟，赵力超，周爱梅，刘 欣
(华南农业大学食品学院，广州 510642)
摘要：研究了南瓜多糖对α-淀粉酶活性的抑制效果及其抗菌性。结果表明：南瓜多糖对α-淀粉酶活力的抑制作用较弱；热水提取的南瓜多糖抗菌活性较高，并且对大肠杆菌的抑制作用强于枯草芽孢杆菌，但是对黄曲霉和黑曲霉没有抑制性。
关键词：南瓜多糖；α-淀粉酶；抑菌性
中图分类号： TS 201.2+5 文献标志码： A 文章编号：1005-9989(2012)03-0044-04
The inhibitory effect on α-amylase and antibiotic activity from pumpkin
polysaccharide
WAN Yan-juan, LIU Xiao-juan, ZHAO Li-chao, ZHOU Ai-mei, LIU Xin
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)Abstract: The inhibitory effect of pumpkin polysaccharide on α-amylase activity and its antibiotic activity were investigated. Results showed that pumpkin polysaccharide with hot water extraction had stronger antimicrobial effect on E.scherichia coli than on Bacillus subtilis. But pumpkin polysaccharide may not have the effect of growth inhibition on Aspergillus ? avus and Aspergillus niger.
Key words: pumpkin polysaccharide; α-amylase; antibiotic activity
南瓜多糖抑制α-淀粉酶及
抑菌活性的研究
[18] Pacheco N, Garnica-Gonzalez M, Ramirez-Hernandez J
Y, et al. Effect of temperature on chitin and astaxanthin
recoveries from shrimp waste using lactic acid bacteria[J].
Bioresource Technology,2009,100(11):2849-2854
[19] 周湘池,刘必谦,郭春苹,等.生物技术清洁生产替代高污染化学法制备甲壳素的研究与应用[J].海洋与湖沼,2008,39(5):517-522[20] Duan S, Zhang Y X, Lu T T, et al. Shrimp Waste Ferment-ation Using Symbiotic Lactic Acid Bacteria[J]. Advanced Materials Research,2011,194:2156-2163