人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf_9细胞中的表达_李华
第21卷第3期中 国 兽 医 学 报Vol.21,No.3 2001年5月Chinese Jo urnal o f Veterina ry Science May2001
人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf9细胞中的表达
李 华2,刘维全1*,王吉贵3,江 禹1,王本旭1,王 萍4,齐顺章3,殷 震1
(1.解放军军需大学军事兽医研究所,吉林长春130062;2.中国医科大学实验动物部,辽宁沈阳
110001;3.中国农业大学生物学院,北京100094;4.吉林大学耳鼻喉研究所,吉林长春130021)
摘要:对人胰岛素基因组基因真核表达载体(pCM A/m IN S)进行X hoⅠ酶切,回收的含人胰岛素基因组基因
的1608bp片段与线性化的杆状病毒载体pFast BacⅠ进行连接,获得重组载体pFast/mIN S。将该重组载体
转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经2次抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组载体Bacmid/
m IN S。将该载体转染Sf9细胞,获得了重组杆状病毒,经T ricine-SDS-PA G E和W estern-blo tting检测,重组
杆状病毒在Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原,而细胞培养上清中未检测到胰岛素和胰岛素原。
关键词:人胰岛素基因;载体构建;杆状病毒表达系统;Sf
9
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2001)03-0258-05
我国临床上应用的胰岛素(insulin)主要来源于猪胰脏,但长期应用动物源胰岛素会导致患者体内产生抗体,使疗效下降。DN A重组技术的出现为人源胰岛素的生产开创了新途径。到目前为止,胰岛素原及其类似物已在许多系统,如大肠杆菌、酵母、枯草杆菌及链球菌中得到了表达[1,2]。杆状病毒是无脊椎动物的病毒,其感染具有严格的宿主专一性,其作为表达载体已广泛用于表达各种外源基因[3]。为了探索利用杆状病毒表达系统表达有生物活性的胰岛素,特进行了本研究。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株、细胞 转座载体质粒pFast Bac Ⅰ、E.c oli DH10Bac和Sf9细胞,由解放军军需大学军事兽医研究所金宁一研究员惠赠;E.coli DH5α、质粒pCM V/m IN S[4]由本课题组保存。1.2 工具酶与试剂 限制性内切酶XhoⅠ、Xba Ⅰ,T4Ligase,牛小肠碱性磷酸酶(CIP),Tricine, Insulin单抗等,购自Sig ma公司;LIPOFEC-T AM IN E Reagent、Grace′s营养液等,购自
收稿日期:2000-11-30
基金项目:吉林省科委基金资助项目(98579)
作者简介:李 华(1962～),女,副教授,博士。
*通讯作者
GIBCO/BRL公司。
1.3 Bacmid/mINS重组质粒的构建与鉴定 将pCMV/m IN S质粒用XhoⅠ酶切,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收含m INS的1608bp片段,同时将pFast B acⅠ用XhoⅠ酶切后去磷酸化,然后用T4Ligase将回收的1608bp片段与去磷酸化的pFast BacⅠ载体连接,连接产物转化E.Coli DH5α感受态细胞,先通过快速鉴定选出大于载体质粒的菌株,再用XhoⅠ酶切鉴定m INS是否插入载体pFast BacⅠ中,最后用XbaⅠ酶切鉴定外源基因插入的方向,将正向插入的重组质粒命名为pFast/m IN S(见图1)。再将pFast/m IN S转化E.c oli D H10Bac感受态细胞,取200μL转化产物涂于Gm++Kan++X-g al+IPTG/LB平板,挑取白色菌落进行第2次筛选,仍为白色菌落者即为重组Bacmid/m IN S。大量提取、纯化Bacmid/m IN S,供转染昆虫细胞用。
1.4 Bacmid/mIN S转染Sf9细胞 转染前24h 将Sf9细胞传代,待细胞长满瓶底50%～60%时,即可进行转染。取A、B2个Eppendrof管,A管中加入5μL(2μg)Bacmid/m INS和100μL无血清无抗生素Grace′s营养液;B管中加入10μg LIPO FECT AM INE Reagent和100μL无血清无抗生素Grace′s营养液。将A液逐滴加入B液中,轻轻混匀,室温静置30min以形成DN A-脂质体
复合物。将待转染Sf 9细胞用无血清无抗生素Grace ′s 营养液洗涤2遍,取800μL 无血清无抗生素Grace ′s 营养液稀释DN A-脂质体复合物,轻轻混匀,并倒入待转染细胞瓶中,置27℃培养6h 后,换成含8%血清有抗生素的正常细胞培养液,27℃继续培养,待细胞发生病变时(7～8d),将细胞反复冻融3次,取冻融液再接种于Sf 9细胞,培养3～4d ,即可见细胞发生病变。此时取20μL 进行电镜观察,看有无重组杆状病毒。观察到杆状病毒后,再如上进行传代。传到第4代时,收集细胞培养液,并按以下方法裂解细胞,以进行表达水平检测
。
图1 p Fa st /m IN S 载体构建
1.5 细胞裂解 用PBS 洗涤细胞3次,每次洗涤后以5000r /min 离心5min,按每106
个细胞加入细胞裂解液50μL ,冰浴30min ,再加入50μL 2×SDS 上样缓冲液,煮沸3min ,10000r /
min 离心5min ,收集上清即为待测细胞样品。按同样方法处理正常对照的Sf 9细胞。
1.6 Insulin 的检测 采用Tricine-SDS-PAGE 系统检测
[5,6]
。取15μL 细胞培养液样品与15μL
2×SDS 上样缓冲液混匀;取1.5的待测细胞样品及对照样品各30μL ,煮沸3min 使蛋白质变性后上样,以0.25%考马斯亮蓝染色液染色后观察。1.7 免疫印迹 经Tricine -SDS -PAGE 分离蛋白质后,将分离胶转移至硝酸纤维素膜上(电转移条件为30V ,4℃,12h ),以3%牛血清白蛋白缓
冲液37℃封闭2h ,再洗涤3次,将胰岛素单抗用
封闭液稀释(1∶200)后覆盖膜上,经37℃2h ,再将碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig G 用封闭液稀释(1∶500),37℃与膜感作2h ,洗涤3次后,稍晾干,将膜置于含有NB T 、BCIP 的碱性磷酸酶缓冲液中显色10～20min ,当特异的蛋白带显色清晰时,即用蒸馏水终止显色。
2 结果
2.1 重组pFast /mINS 的酶切鉴定结果 用Xho Ⅰ酶切重组质粒,经1%琼脂糖凝胶电泳,结果出现1608bp 含m IN S 的片段和 4.7kb 的pFastBac Ⅰ载体,再用Xba Ⅰ酶切重组质粒,经1%琼脂糖凝胶电泳,结果出现约6.3kb 的片段,说明该重组质粒为正向插入(见图2)。
图2 重组pFast /mIN S 酶切鉴定结果 1.Xh o Ⅰ酶
切p Fast /mIN S ;2.Xho Ⅰ酶切pFastBac Ⅰ; 3.λDN A /Eco R
Ⅰ+Hind ⅢMa rker ; 4.回收的1608bp 片段; 5.Xba Ⅰ酶切p Fa st /m IN S
2.2 重组Bacmid /mINS 的筛选结果 将所构
建的pFa st /m IN S 转化至受体菌E .c oli DH10Bac 后,在含有X-gal +IPTG +Kan +
+Gm +
的LB 板上形成白色菌落(见图3)。
图3 蓝白斑筛选重组pBacmid /m IN S 结果 箭头示
白色菌落
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第3期
李 华等:人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf 9细胞中的表达
2.3 重组Bacmid /mINS 转染昆虫细胞结果 将Bacmid /m INS 转染Sf 9细胞后,在Sf 9细胞中装配,产生了重组杆状病毒(见图4),并使Sf 9细胞发生了病变,细胞变大、核增大(见图5)。2.4 Tricine -SDS -PAGE 和Western -blotting 结果 重组杆状病毒传至第4代,待细胞产生病变(约72h)后,收集培养液样品,处理细胞并收集细胞样品,以Tricine -SDS -PAGE 和Western -blo tting 检测,结果见图6。从图6看出,感染细胞与对照细胞在6100～14400之间带型不一致,经W estern-blo tting 检测,在此之间出现与胰岛素原相对分子质量接近的特异带,而培养液样品无论是PAGE 还是Western-blo tting 都未见到与胰
岛素或胰岛素原相对分子质量接近的特异带型
。
图4
重组的杆状病毒
图5 Sf 9细胞 左为正常的Sf 9细胞,右为出现病变的Sf 9
细胞
图6 T ricine-SD S-P AG E (左)与W ester n-blo tting
(右)结果 1.正常的Sf 9细胞; 2.重组杆状病毒感染的Sf 9细胞; 3.正常Sf 9细胞的培养上清; 4.重组杆状病毒感染Sf 9细胞的培养上清; 5.低分子质量M a rker; 6.标准人胰岛素
3 讨论
随着杆状病毒表达载体的不断发展和成熟,昆虫细胞表达系统已被广泛用于生产基因工程产品[7～9]。本试验所采用的B ac to Bac 系统是Luck-ow 等
[10]
1993年创建的新型杆状病毒表达系
统
[11]
。该系统由转座载体pFa st Bac Ⅰ、杆状病毒
穿梭载体Bacmid 、助手质粒pM ON 7124和受体菌DH10Bac 等组成。重组的Bacmid 是通过将转座载体pFast Bac Ⅰ上的mini-Tn7元件转座到Bacmid 上的转座识别位点(mini-a ttTn7)而构建的。此转座过程需要助手质粒(helper plasmid )
pM ON 7124提供转座所需的转座酶。当mini -Tn 7通过转座插入mini -att Tn 7识别位点后,就阻断了LacZ 基因的表达,所以在含有Gm 、Tc 、Kan 三
抗和X -gal 、IPTG 的LB 平板上呈白色菌落。在本试验中,我们将所构建的pFast /m IN S 转化至受体菌DH10Bac 后,其所带的m IN S 基因便在助手质粒提供转座酶的情况下,插入到Bacmid 的mi-ni-a ttTn7识别位点中,使Bacmid 的LacZ 基因失活,进而在含有三抗和X-gal /IPTG 的LB 平板中长有白色菌落,由此获得了Bacmid /m IN S 。提取、纯化Bacmid /m INS ,通过脂质体转染法转染Sf 9细胞,得到了重组杆状病毒。与其他病毒表达系统相比,该系统突出的特点是阳性重组率高,重组体不需要空斑纯化即可获得,这就大大减少了鉴定和纯化重组病毒的时间、人力和物力,提高了经济效益。
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中 国 兽 医 学 报2001年
胰岛素的生物合成过程包括前胰岛素原的m RN A在内质网的向质面被翻译成1条肽链的前胰岛素原,此肽链在信号肽的引导下,穿过内质网膜进入内质腔,同时移去信号肽成为胰岛素原,然后胰岛素原进入高尔基体,经过折叠、硫硫配对和包装进入分泌颗粒,最后由类似胰蛋白酶和羧肽酶B的专一蛋白水解酶加工成2条链的胰岛素和C肽。所以,由胰岛素基因表达成有活性的胰岛素,需要转录水平的加工去除内含子和翻译水平的加工去除信号肽与C肽。在正常情况下,只有胰岛β细胞中才能合成分泌有活性的胰岛素,而普通真核非内分泌细胞不能在细胞内对胰岛素原做翻译后加工使之转变成胰岛素,表达出的产物只是胰岛素原[12,13]。所以,在真核细胞中表达外源人胰岛素基因的研究工作很少有人进行。但已有研究发现,大多数组织和细胞内存在一类蛋白水解酶Furin,此酶能专一地识别和切割特定的氨基酸序列(Arg-/Lys-X-Lys-Arg-↓-),对由组成性分泌途径分泌的蛋白质起加工作用[14～16]。而人胰岛素原仅B链与C肽间存在Fu-rin识别位点可被切割,另一端A链C肽间如何被加工,尚不清楚。于是有人对胰岛素基因做定点改造,将胰岛素B链C肽间和A链C肽间的氨基酸序列改造成Furin酶识别模式,然后在真核细胞中表达,结果能分泌出成熟的胰岛素,并具有生物学活性,但表达量较低。1997年我国学者寿思明等[4]对其所克隆的人胰岛素基因组基因进行了定点突变,将Furin酶识别的最佳模式-Arg-X-Ly s-Arg-↓-引入C肽与A链及C肽与B链之间,构建了pCM W/m IN S真核表达载体,并在CHO和M CF-7细胞中进行了表达。放免检测结果表明,表达量仍较低,未能检出表达产物是胰岛素还是胰岛素原。本试验利用pCMV/m IN S构建了Bacmid/m IN S重组质粒,并在Sf9细胞中包装重组杆状病毒,以进行胰岛素表达研究。结果表明,该系统能在Sf9细胞内表达胰岛素原,但细胞培养上清未检测到胰岛素,其原因尚待进一步研究。
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Construction of Baculovirus Expression Vector of Human Insulin Gene and Its Expression in Sf9Cells
LI Hua2,LIU Wei-qua n1*,W AN G J i-gui3,JIAN G Yu1,W AN G Ben-x u1,W AN G Ping4,
Q I Shun-zhang3,YIN Zhen1 (1.The Military Veterinary Institute,Quartermaster Univ ersity of PL A,Changchun130062,China;2.Faculty of Laboratory animal,Chinese Medical
University,Shenyang110001,China;3.College of Biology,China Agriculture University, Beijing100094,China; 4.The Otorhinolaryngology Institute,J ilin University,Changc hun
130021,China)
Abstract:The transpo sitional recombinant v ector w as constructed firstly.Then it was trans-form ed in E.c oli DH10Bac a nd cultured in LB plate w hich co ntained Gm,Kan,X-g al and IPTG.The w hite bacterial colonies were positiv e reco mbinant Bacmid named as Bacmid/m IN S.The recombinant baculoviruses w ere o btained after the tra nsfection o f the recom binant v ector into Sf9lines.The tech-niques o f Tricine-SDS-PAGE a nd Western-blo tting w ere used to detect and identify the pro ducts ex-pressed in Sf9lines by recombina nt baculovirus.The results indicated that the products ex pressed in Sf9lines by baculov irus v ecto r system w ere mo st likely proinsulin.No ne of the proinsulin and insulin w ere detected in the supernatant of Sf9cell culture.
Key words:hum an insulin g ene;v ecto r construction;baculovirus ex pression v ecto r system;Sf9 *Corresponding author
第1只转基因灵长类动物产生
美国科学家已成功得到第1只转基因灵长类动物罗猴(rhesus)。这只猴被命名为AN Di(即inser ted DN A的倒拼),是用反转录病毒载体介导的转基因方法产生的,所转的外源基因是作为标记基因的绿色荧光蛋白基因。在过去,转基因小鼠为人类的许多疾病提供了研究模型,但由于小鼠与人的亲缘关系较远,因此转基因猴的建立可望弥补转基因小鼠动物模型的一些不足,加快某些人类顽疾的研究进程。
(郭志儒摘自Science,2001,291:309～312)
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