水稻纹枯病菌拮抗菌的筛选_鉴定及_省略_hizoctoniasolani_曹琦琦

网络出版时间：2013-05-07 11:04

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29(2)270-276 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2013年5月水稻纹枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及培养条件探索

曹琦琦*，周登博*，郑丽，杨媚，周而勋**

（华南农业大学资源环境学院，广州 510642）

摘要：从不同土壤、植物和水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani菌核样品上分离到细菌菌株325株和放线菌菌株86株。通过琼脂平板对峙法及发酵滤液介质筛选法，获得了对水稻纹枯病菌具有较强拮抗活性的细菌和放线菌菌株各1株，它们对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制率分别为75.56%和84.07%。采用形态学和生理生化学以及分子生物学方法，将细菌菌株NB12鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、放线菌菌株NA1鉴定为Streptomyces triostinicus。对它们产生抑菌物质的发酵条件进行了探索，明确了菌株NB12的最佳发酵条件为：初始pH 7.0的LB或BPY培养液、装液量40 mL/250 mL、培养温度30 ℃、摇床转速180 r·min?1、培养时间48 h；菌株NA1的最佳发酵条件为：初始pH 6.0～9.0的大豆粉培养液或大豆粉–玉米粉培养液、装液量130 mL/250 mL、培养温度35 ℃、摇床转速140 r·min?1、培养时间≥72 h。

关 键 词：水稻纹枯病；立枯丝核菌；拮抗菌；菌种鉴定；发酵条件

中图分类号：S476.1；S435.111 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2013)02-0270-07 Screening, Identification and Cultivation Conditions of Microbes Antagonistic to

Rice Sheath Blight Fungus Rhizoctonia solani

CAO Qiqi*, ZHOU Dengbo*, ZHENG Li, YANG Mei, ZHOU Erxun**

(College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract: Three hundred and twenty five bacterial strains and eighty six actinomycete strains were isolated from the samples taken from different soils, plants and Rhizoctonia solani sclerotia. One bacterial and one actinomycete strains with strong antagonistic activities to R. solani were selected by using both agar plate dual culture and fermentation filtrate-amended medium screening methods. Their inhibition rates to mycelial growth of R. solani were 75.56% and 84.07%, respectively, on the two medial plates. Based on morphological, physiological, biochemical and molecular characteristics, NB12 was identified as Bacillus subtilis, and NA1 as Streptomyces triostinicus. The cultivation conditions for antifungal substance production by NB12 were: LB or BPY medium at initial pH 7.0, culture volume at 40 mL/250 mL flask, incubation temperature at 30 ?C, and shaking rate at 180 r·min?1 for 48 h; whereas those for NA1 were: soybean or soybean–corn powder liquid medium at initial pH 6.0—

9.0, culture volume at 130 mL/250 mL flask, incubation temperature at 35 ?C, and shaking rate at 140 r·min?1 for 72

h or above.

Key words: rice sheath blight; Rhizoctonia solani; antagonistic microbe; species identification; fermentation conditions

由立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn引起的水稻纹枯病是一种世界性病害，为水稻三大病害之一[1,2]。

随着高产、矮秆、多蘖良种的推广以及种植密度和施氮量的增加，其危害日趋严重，在我国尤其是南方稻

收稿日期：2012-07-08

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（nyhyzx3-16）

作者简介：*并列第一作者。曹琦琦（1987?），女，硕士，Email：vivi0608@https://www.360docs.net/doc/997943624.html,；周登博（1982?），女，博士研究生，Email：zhoudengbo@https://www.360docs.net/doc/997943624.html,；

**通信作者，博士，教授，博导，E-mail：exzhou@https://www.360docs.net/doc/997943624.html,。

第2期曹琦琦等：水稻纹枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及培养条件探索 271

区造成了严重的经济损失[3~5]。由于水稻种质资源中缺乏高抗纹枯病的品种，所以，水稻纹枯病的防治目

前主要以化学药剂为主。井冈霉素对纹枯病的防治效果较好，但在使用了近40年后，在田间也发现了抗

药性菌株[6]。因此，生物防治已成为防治水稻纹枯病的新途径。

人们发现细菌中的芽胞杆菌Bacillus spp. [7~11]、伯克霍尔德菌Burkholderia sp. [11]以及放线菌中的链

霉菌Streptomyces sp. [11]等拮抗微生物对水稻纹枯病都有一定的生防效果。李华荣等[10]测定了蜡质芽胞杆

菌B. cereus R2菌株对水稻纹枯病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用及菌液对人工接种纹枯病菌的离体

稻叶的防效，结果表明该菌对水稻纹枯病菌具有很好的抑制作用，菌液对水稻纹枯病有很好的防效。陈

志谊等[7~9]报道了枯草芽胞杆菌 B. subtilis对水稻纹枯病菌的抑制作用。张德涛等[11]对卡特拉链霉菌S.

katrae NB20菌株对水稻纹枯病的生防潜力进行了研究，取得了较好的防治效果。于飞进等[12]从培养基、

温度、pH值等方面优化了蜡质芽胞杆菌产拮抗物质的最佳培养条件。此外，放线菌链霉菌属中的吸水链

霉菌S. hygroscopicus是产生抗生素最常见的菌种之一，具有较好的抑菌作用[13]。吸水链霉菌S.

hygroscopicus [13]、毒三素链霉菌S. toxytricini [14]、黄色长孢链霉菌S. longisporoflavus [15]、阿南德氏链霉菌

S. anandii [16]等对植物病原真菌具有较好的生防效果，但除了本实验室对卡特拉链霉菌S. katrae对水稻纹枯

病进行过生物防治研究外[11]，鲜见其它链霉菌对水稻纹枯病生防作用的相关报道。

因此，为了筛选到适合于华南地区使用的水稻纹枯病菌的高效拮抗菌，本研究拟采用对峙培养法[17]，

对该地区不同土壤、植物和水稻纹枯病菌菌核等材料上的微生物进行分离和筛选，旨在获得拮抗效果更好

的生防菌株，并对其进行种类鉴定；另外，通过对拮抗菌产生拮抗物质的培养条件进行探索，旨在找到最

佳的发酵条件，为大规模生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

1.1.1 供试菌株靶标病原菌菌株水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani GD-118，菌丝融合群为AG-1 IA，为华

南农业大学真菌研究室以往鉴定、保存的强致病力菌株[18]。待筛菌株为本研究室从不同土壤、水稻病健植

株表面、水稻纹枯病菌核上分离到的各种细菌和放线菌菌株。

1.1.2 培养基固体培养基PDA、NA、高氏一号培养基，用于各种微生物的分离；液体培养基BPY、KMB、

LB、NB、PDB、大豆粉酵母膏、大豆粉、大豆粉-玉米粉、淀粉、玉米粉培养液，用于发酵条件的优化，

详细配方见文献[19]。YPDA是在PDA基础上加入酵母粉5 g·L?1配成。

1.2 拮抗菌的分离与筛选

1.2.1 取样及微生物的分离收集稻田、菜园和果园等地的根际土壤，水稻纹枯病病株、健株组织，稻田

水中打捞的菌核，稻株上的菌核，人工培养、埋藏在稻田土壤中的菌核[20]，备用。

将上述各种样品分别加入到灭菌水中激烈振荡（样品﹕水＝1﹕9）。所得悬浮液浓度记为1×10?1，

再将1×10?1的悬浮液依次稀释成1×10?6～1×10?2的系列浓度悬浮液。用高氏一号培养基分离放线菌；

用NA培养基分离细菌 [21]。每个浓度做3个重复。

1.2.2 拮抗菌的筛选采用平板对峙培养法，将上述分离到的各种微生物待测菌株与靶标病原菌菌株同时

接种到PDA或YPDA平板上，两菌距离3 cm左右，设置三个重复及空白对照，25～28 ℃恒温培养一段

时间后，测量待测菌株与靶标菌株之间的抑菌带宽度，作为拮抗作用强弱的指标。

1.2.3 拮抗菌培养滤液的抑菌作用测定根据平板对峙培养法测定结果，挑选出拮抗作用强的拮抗细菌和放

线菌菌株若干株，采用含药介质法测定其对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制率。在三角瓶中加入50 mL灭菌的

培养液（培养细菌用LB培养液，放线菌用大豆粉培养液）。向盛有培养液的三角瓶中分别加入5 mL培

养2 d的拮抗细菌或培养5 d的放线菌培养液，每个处理设3个重复，25～28 ℃恒温、180 r·min?1振荡培养，

细菌培养2 d、放线菌培养5 d后，取出培养好的拮抗菌悬浮液，10000 r·min?1离心10 min，用灭菌的细菌过

滤器（0.22 μm）过滤上清液，得到无菌的培养滤液，制成含培养滤液10%的PDA培养基平板，在平板中央

接上靶标病原菌菌株的菌丝块，设置三个重复及不含培养滤液的空白对照（CK），25～28 ℃恒温培养，待

CK培养皿上的菌落几乎长满整个培养皿时，取出各个处理平板，测量菌落直径的大小，计算抑菌率。

272 中国生物防治学报第29卷

抑制率＝（对照菌落平均直径—处理菌落平均直径）/对照菌落平均直径×100%

1.3 拮抗菌的鉴定

对拮抗性强的细菌菌株NB12和放线菌菌株NA1进行种类鉴定。参照周德庆[22]、中国科学院微生物研究所放线菌分类组[23]及瓦克斯曼[24]的方法，对放线菌菌株NA1进行生理生化特性测定以及形态学和培养特性的观察；对细菌菌株NB12进行生理生化测定[25,26]；另外，采用16S rDNA通用引物[27]对菌株NB12和NA1的基因组DNA进行PCR扩增、序列测定与BLAST比对分析。

1.4 拮抗菌的系统发育分析

对测得的拮抗细菌菌株NB12和拮抗放线菌菌株NA1的16S rDNA序列分别与其近缘属种的序列进行比对，并用MEGA4.1软件建立亲缘关系树，分析其遗传关系。

1.5 拮抗菌产拮抗物质的条件探索

对拮抗菌在以下培养条件下产生的拮抗物质进行研究。细菌菌株NB12发酵培养液分别为BPY、KMB、LB、NB和PDB，放线菌菌株NA1发酵培养液分别为PDB、大豆粉酵母膏、大豆粉、大豆粉―玉米粉、淀粉和玉米粉，培养液pH值为3～12，250 mL的三角瓶装液量为40、70、100、130、160和190 mL，培养时间为24、48、72、96、120和144 h，培养温度为15、20、25、28、30、35和40 ℃，摇床转速为60、100、140、180和220 r·min?1。发酵结束后，对发酵滤液的抑菌活性进行测定，方法同1.2.3。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选及发酵滤液对水稻纹枯病菌的抑制作用

从各种供试材料共分离到细菌菌株325株和放线菌菌株86株。通过平板对峙培养法，对全部菌株的拮抗活性进行了测定，共获得拮抗细菌40株，拮抗放线菌26株，分别占各自总菌株数的12.3%和30.2%。

拮抗菌发酵滤液的抑菌结果表明：不同拮抗菌的发酵滤液对水稻纹枯病菌的菌丝生长均有一定程度的抑制作用。在细菌菌株中，NB12的抑菌率最高，为75.56%；在放线菌菌株中，NA1的抑菌率最高，为84.07%。由此挑选出这2个菌株作进一步的种类鉴定和亲缘关系分析。

2.2 拮抗菌的鉴定

2.2.1 形态学和生理生化特征鉴定菌株NB12在LB培养基上培养3 d后观察，其单菌落圆形或不规则形，乳白色，表面粗糙有褶皱状突起，不透明，无光泽，粘质，不易乳化；在LB液体培养基中，轻度浑浊，色暗，表面形成完整白色粘质膜。其生理生化特征测定结果为：柠檬酸盐反应和V-P反应为阳性，淀粉水解反应和厌氧反应为阴性，可以利用D-甘露醇。形态学与生理生化特征的鉴定结果表明，菌株NB12与枯草芽胞杆菌B. subtilis的描述一致，因此将其鉴定为枯草芽胞杆菌B. subtilis。

菌株NA1的显微观察结果表明：基内菌丝无隔膜，不断裂；气生菌丝多分枝，且分枝较短，孢子丝螺旋形；孢子卵圆形，表面光滑（图1）。生理生化特性测定结果为：该菌株可以利用葡萄糖、D-木糖、A

B

A：菌丝形态特征Morphological characteristics of hyphae；B：孢子丝形态特征Morphological characteristics of spore belt

图1 NA1菌株的形态特征（×400）

Fig. 1 Morphological characteristics of NA1 strain (×400)

第2期曹琦琦等：水稻纹枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及培养条件探索 273

D-果糖、L-鼠李糖、乳糖、D-半乳糖和甘露醇等多种碳源，但不能利用蔗糖和D-山梨醇等碳源，对肌醇的

利用可疑。形态学和生理生化特性的鉴定结果表明，NA1菌株与Streptomyces triostinicus的描述一致，故

将其鉴定为S. triostinicus。

2.2.2 分子生物学鉴定拮抗细菌菌株NB12和拮抗放线菌菌株NA1用16S rDNA进行PCR扩增测得序

列在NCBI网上进行BLAST比对，发现拮抗细菌菌株NB12与 B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B.

polyfermenticus 和B. vallismortis的相似度最高，达到99%，结合生理生化测定结果，将其鉴定为枯草芽胞

杆菌B. subtilis。拮抗放线菌NA1菌株与Streptomyces triostinicus的相似度最高，达到99%，将其鉴定为

S. triostinicus。分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致（图2）。

用MEGA4.1软件分别建立了枯草芽胞杆菌B. subtilis NB12和放线菌S. triostinicus NA1与同属不同种

以及同一个种多个菌株间的亲缘关系树（图3）。

2000

750

500

250

100

1000

bp

2000

750

500

250

100

1000

bp

M12M12

A B

A：细菌菌株NB12基因组DNA 16S rDNA 引物的PCR扩增；PCR amplification of genomic DNA from bacterial strain NB12 with 16S rDNA primers（M：DNA Marker DL2000；1：ddH2O；2：NB12基因组DNA）。

B：放线菌菌株NA1基因组DNA 16S rDNA引物的PCR扩增；PCR amplification of genomic DNA from actinomycete strain NA1 with 16S rDNA primers （M：DNA Marker DL2000；1：NA1基因组DNA；2：ddH2O）。

图2 两个拮抗菌株的PCR扩增

Fig. 2 PCR amplification of two antagonistic microbes

A：细菌B. subtili NB12的亲缘关系树，以S. kathirae作为外群菌株。Phylogenetic tree of B. subtili strain NB12. S. kathirae served as outgroup strain. B：放线菌S. triostinicus NA1的亲缘关系树，以B. subtilis作为外群菌株。Phylogenetic tree of S. triostinicus strain NA1. B. subtilis served as outgroup strain

图3 两个拮抗菌株与其它菌株的亲缘关系树

Fig. 3 Phylogenetic trees of two antagonistic strains with other strains

2.3 拮抗菌最佳发酵条件的筛选

试验结果表明，细菌菌株NB12最适宜的发酵培养基为LB和BPY（图4A）；放线菌菌株NA1最适

274

中 国 生 物 防 治 学 报

第29卷

0.0

0.51.01.52.02.5LB KMB BPY NB PD

菌株NB12培养基种类Culture medium

O D 值

204060

80抑菌率 I n h i b i t i o n r a t e (%)抑菌率 (%)

值

15

20

25

28

30

35

40

温度Temperature (℃)抑菌率 I n h i b i t i o n r a t e (%)

60100140180220

摇床转速Rotation rates (r/min)

0102030405060708090A1

A2

A3

A4

A5

A6

菌株NA1培养基种类Culture medium

抑菌率 I n h i b i t i o n r a t e (%)

a

c

b

b

d a

抑菌率 I n h i b i t i o n r a t e (%)

O D 值

A

B

C D E

G

A ：菌株NB12培养夜Strain NB12 culture media ；

B ：放线菌菌株NA1培养夜（A1：淀粉培养液；A2：大豆粉酵母膏培养液；A3：大豆粉培养液；A4：PDB 培养液；A5：玉米粉培养液；A6：大豆粉-玉米粉培养液） Strain NA1 culture media (A1: Starch liquid medium; A2: Soybean powder and yeast extract liquid medium; A3: Soybean powder liquid medium; A4: PDB broth; A5: Corn powder liquid medium; A6: Soybean and corn liquid medium)；

C ：pH ；

D ：装液量Medium volumes ；

E ：细菌菌株NB12发酵时间Strain NB12 fermentation times ；

F ：放线菌菌株NA1发酵时间Strain NA1 fermentation times ；

G ：培养温度Incubation temperatures ；

H ：摇床转速Shaker rotation rates

图4 拮抗菌发酵的影响条件

Fig. 4 Fermentation conditions for antagonistic microbes

注：图中数据为平均值±标准误，数据后不同字母者表示经Duncan 氏新复极差法进行差异显著性分析，在0.05水平上差异显著。 Note: Data in this figure were mean ±SE, the data with different letters are significantly difference at 0.05 level by using Duncan’s multiple range test.

第2期曹琦琦等：水稻纹枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及培养条件探索 275

宜的发酵培养液为大豆粉培养液（A3）和大豆粉-玉米粉培养液（A6）（图4B）；细菌菌株NB12和放线

菌菌株NA1的最佳初始pH值分别为7.0和6.0～9.0（图4C）；细菌菌株NB12的最佳装液量为40 mL/250

mL，而放线菌菌株NA1在实验装液量范围内（40～190 mL/250 mL）发酵滤液的抑菌活性都没有明显差

异（图4D），为了发挥最佳效益并操作方便，我们选择最佳的装液量为130 mL/250 mL；细菌菌株NB12

最佳的发酵时间为48 h（图4E）；放线菌菌株NA1最佳的发酵时间应等于或大于72 h（图4F）；细菌菌

株NB12和放线菌菌株NA1的最佳发酵温度分别为30 ℃和35 ℃（图4G）；细菌菌株NB12和放线菌菌

株NA1的最佳摇床转速分别为180 r·min?1和140 r·min?1（图4H）。

3 讨论

拮抗菌的筛选方法和程序是否得当关系到筛选的成功与否。本研究采用对峙培养法，即将靶标病原菌

与拮抗菌共同培养在营养丰富的培养基上，通过观察抑菌带的有无以及宽度，判断拮抗菌对病原菌生长的

抑制作用及其强弱。这种方法的优点是简单、直观、快速、工作量小，可在短时间内对大量菌株进行

筛选[17]。为了更有效地筛选到生防细菌，本研究在前人研究方法的基础上，对采用的培养基进行了改进。

在PDA的基础上加入5 g 酵母粉配成YPDA，用于水稻纹枯病菌生防细菌的对峙培养，同时兼顾了水稻

纹枯病菌和拮抗细菌的生长，具有较好的效果，对植物病原真菌拮抗细菌的筛选具有重要指导意义。

本研究通过分离和对峙培养，筛选出了对水稻纹枯病菌具有明显抑制作用的细菌菌株NB12和放线菌

菌株NA1，通过生理生化和分子生物学鉴定，将细菌菌株NB12鉴定为枯草芽胞杆菌B. subtilis，将放线菌

菌株NA1鉴定为S. triostinicus。芽胞杆菌中的枯草芽胞杆菌B. subtilis [7~9]和蜡质芽胞杆菌B. cereus [10]已被

用于水稻纹枯病的生物防治，并证明具有较好的效果。此外，放线菌的一些种类（主要是链霉菌属的一些

种）对植物病原真菌也具有较好的生防效果[11,13~16]。本研究筛选到的放线菌菌株NA1经鉴定为链霉菌属

的另一个种——S. triostinicus，对水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用，是防治水稻纹枯病潜在的优良生防

菌株，具有良好的开发应用价值。本研究分离到的拮抗枯草芽胞杆菌 B. subtilis NB12菌株和链霉菌S.

triostinicus N A1菌株无疑丰富了水稻纹枯病的生防菌资源，对推动该病害的生物防治具有重要意义。

生防菌产拮抗物质的最佳培养条件对植物病害的生物防治具有重要意义，而培养基、温度和pH值等

是影响拮抗物质产率的主要因素[12,16]。本研究的枯草芽胞杆菌B. Subtilis NB12和链霉菌S. triostinicu NA1

产拮抗物质的最佳培养条件，与文献上报道的蜡质芽胞杆菌B. cereus [12]和阿南德氏链霉菌S. anandii[16]产

拮抗物质的培养条件存在差异，可能与采用的菌株属于不同的种类有关。

通过对筛选出的两个生防菌枯草芽胞杆菌B. Subtilis NB12和链霉菌S. triostinicu NA1的对峙培养和拮

抗物质发酵培养两个方面的研究，证明了这两个菌株对水稻纹枯病菌R. solani具有强烈的抑制作用，其发

酵滤液中的拮抗物质对田间病害的实际生防效果及药剂开发与应用有待进一步研究。

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