20091112不同蜕皮时期中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因mRNA 表达

不同蜕皮时期中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基

因mRNA 表达研究

林海，周刚，张彤晴，许志强，李旭光，葛家春

（江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017）

摘要:根据中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮抑制激素1(MIH1)基因组DNA序列设计引物，运用RT-PCR 技术,从不同蜕皮间期中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)眼柄中提取总RNA并扩增获得了MIH基因cDNA目的片段，运用Realtime PCR技术对该基因在不同蜕皮时期表达进行了定量。结果发现，不同蜕皮亚期均检测到了稳态的MIH mRNA表达，利用2-△△CT 方法比较了不同蜕皮亚期MIH mRNA的表达差异，结果表明MIH mRNA的表达水平伴随着蜕皮的发生有显著的起伏。

关键词:中华绒螯蟹；蜕皮抑制激素mRNA表达水平；不同时期；Realtime PCR 定量Primary Study On The MIH mRNA Expression of Eriocheir sinensis In Different

Molt Stages

Lin Hai, Zhou Gang, Xu zhi-qiang, Li Xu-guang Zhang Tong-qing , Ge Jia-chun, (Freshwater Aquaculture Research Institute of Jiangsu Province , Nanjing, 210017,China)

ABSTRACT: According to the DNA sequence of the molt inhibiting hormone gene of Eriocheir sinensis, a primer was designed, Using reverse transcription PCR(RT-PCR) and rapid amplification of cDNA end(RACE) techniques, the target cDNA fragemt was obtained from the eye-stalks of Eriocheir sinensis. Real-time fluorescent quantitative PCR was performed to study the expression of this gene expression of different molt stages during a molt cycle. The results showed that the mRNA expression signal of different molt stages was hardly detected, by the way of 2 - △△CT the mRNA expression difference of different stages was analyzed ,it revealed stage-specific changes in the level of MIH mRNA during the molt cycle.

Key words:Eriocheir sinensis; expression level of MIH mRNA; different stages; real-time fluorescent quantitative

甲壳动物成体眼柄内的神经1内分泌器官X器官(XO)窦腺(SG)复合体是甲壳动物神经内

1基金项目：国家“十一五”科技支撑计划（2006BAD03B07）；农业部公益性行业科研专项（3-54）

作者简介：林海，（1983-），男，安徽巢湖人，江苏省淡水水产研究所，本科，主要从事甲壳类增养殖等研究。EMAIL:solarlin@https://www.360docs.net/doc/9c15010157.html,；

分泌的主要调控中心，其分泌物能抑制甲壳动物蜕皮，称为蜕皮抑制激素(MIHquanxie )，一般认为该激素在体内通过抑制Y-器官蜕皮激素的分泌来调控蜕皮过程。在蜕皮间期血淋巴中高水平的MIH抑制Y-器官蜕皮激素的合成和释放,只有当MIH的分泌量减少或停止时蜕皮现象才会发生(Spaziani et al., 1989; Chang et al.,1990)。目前河蟹生产养殖中普遍出现性早熟现象，蜕皮次数过频，蜕皮死亡发生率高，蜕皮后增长增重不明显，影响产量和效益。然而国内关于中华绒螯蟹蜕皮现象的研究多偏重于生理学、形态学等方面[1 - 3 ],分子水平的研究报道较少。本研究采用了RT-PCR技术，从不同蜕皮亚期中华绒螯蟹眼柄中提取的总RNA中，扩增得到了蜕皮抑制激素MIH目的片段，运用荧光定量技术（Realtime PCR）对该基因在不同蜕皮亚期表达水平进行了定量，并利用2 - △△ CT方法比较了不同蜕皮阶段中华绒螯蟹MIH mRNA的表达差异[4]。该研究旨在为研究中华绒螯蟹蜕皮调节与表达机制探索一种新手段新思路，为中华绒螯蟹的蜕皮及养殖过程中出现的性早熟现象的提供分子机理奠定基础，以期对河蟹蜕皮能进行人工调控，提高河蟹养殖的规格和效益，此类研究对其它甲壳类动物的蜕皮发生研究也有一定参考价值。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

河蟹材料取自金坛渔业科技园区，均2龄河蟹，收集2008年6月上旬、7月两次集中蜕壳的两批河蟹，挑选同一蜕皮间期的4只为1个样本（雌雄各半），共11个样本44只河蟹。河蟹分期结合

1.1.2试剂：RNA marker、Taq DNA聚合酶和Trizol Reagent、RT-PCR Kit (gongsi);DU-600紫外分光光度计(BECKMAN)

1.2 方法

1.2.1中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)眼柄总RNA 的制备

取不同蜕皮间期的中华绒螯蟹, 同一蜕皮间期的4只河蟹为1个样本（雌雄各半），河蟹活体称重、测量背甲长、宽及高度，剪眼柄, 切开外壳，取出X器官-窦腺复合体，迅速浸入液氮并充分研磨, 然后用Trizol 试剂提取总RNA ,具体操作按说明书进行。用1﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。紫外分光光度法测定提取RNA的浓度和纯度。

1.2.2引物设计

引物设计直接参考中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮抑制激素(MIH)基因组DNA序列(GenBank检索号:AY310313)，全长为3506 bp。利用Premier5. 0软件设计了两对引物和一

对内参，分别如下：

MIH1F:5'-aggaggagcagaaggaggag-3';MIH1R:5'-cacacactcacacacaaaggaa-3';

MIH2F:5'-gatcgggaatcgtgacatct-3'；MIH2R:5'-aggagttattgcccgaggat-3'；

β-actin CR:5'-gactctggtgacggtgtctccc-3';

β-actin CF:5'-gcggtggtcgtgaaggtgtagc-3'；

预计扩增的片段大小分别为232 bp、204 bp、131bp。

1.2.3 逆转录反应条件的优化

按照ReverTra Ace-ɑ-TM试剂盒步骤与程序进行。将1μg（根据总RNA浓度，适当调整稀释倍数）左右X2器官窦腺复合体总RNA加入到20μL反应液(Rnase Free Water 9.75ul;5*buffer 4ul; 20mmol dNTP Mixture; Oligo(dT) 10pmol;Rnase inhibitor 10U;ReverTra Ace 1ul;)中,并于42℃反应20min,99℃下热处理5min，逆转录合成第一链cDNA。反应结束后,-20℃保存或直接做荧光定量PCR（Realtime PCR）。

1.2.4 Realtime PCR反应条件的摸索与确立

将上述合成的第一链cDNA 稀释5 倍取2ul用作简并引物MIH2 和内参引物扩增模板。

Realtime PCR：引物稀释后浓度为10uM。在ABI 7000仪器上进行扩增。反应体系为20ul （SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10ul、上游引物0.4ul、下游引物0.4ul、ddH2O 7.2ul）。反应程序为：95℃5min,95℃15s，48℃(54℃) 15s，72℃45s，40个循环。

1.2.5 溶解曲线的制备

把获得的第一链CDNA进行系列稀释作为Realtime PCR扩增模版，用于制备MIH、内参的相对标准曲线。所有计算采用每个标准3个复孔所得的平均循环数值（CT），且3个复孔的CT值之间差异小于1个循环。从中绘制出模版的对数与△CT 的关系图以证明靶基因和内参的扩增效率基本相同（选择了引物MIH2），这样即可用2 - △△ CT 方法进行相对定量。1.2.6 数据处理方法：

（1）利用2 - △△ CT 方法确定目标转录本在不同时相的表达差异。

Amount of target=2 - △△ CT

（△ CT= CT目标基因-CT内标基因；-△△ CT=-（△ CT某时期-△ CT参照期）、选择MIH表达最低的D3-D4期为参照期）

（2）裂缝指数=裂缝厚度*0.1/河蟹厚度

2.结果与分析

2.1 RNA纯度和完整性分析

提取的眼柄总RNA经琼脂糖凝胶电泳分析，带与带之间无明显拖尾现象，经一定浓度的

稀释，分光光度计检测表明RNA A260/A280比值均在1.8～2.1之间，说明RNA质量较好未被蛋白质、酚等污染。眼柄总RNA浓度经计算为3.5～7.5mg/ml之间。

2. 2 Real time PCR产物检测

2.2.1 电泳检测：Real time PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明, 引物MIH2的扩增结果较好，得到大小为204bp左右的目的片段(图1) 。

图1 real ime PCR产物琼脂糖凝胶电泳

Fig1. Agarose gel electrophoresis of real time PCR products

real time PCR products 204bp; 2: DNA marker

2.2.2溶解曲线：

图2 MIH、内参溶解曲线

Fig2. Dissociation cure of β-actin

溶解温度均一，大峰出现81℃左右，对应204bp的扩增子，产物特异性较高，无明显杂带，可确定其为目标产物。在75℃左右有少数小峰，估计是引物二聚体、引物和一些非

特异性扩增产物，它们的量相比于扩增子显得很少，对相对定量结果影响很小。

2.3 不同蜕皮时期MIHmRNA的表达差异

CT内标基因36.74 37.56 36.36 36.46 35.87

CT目标基因36.74 37.56 36.36 36.46 35.87

裂缝指数(index) 0.23 0.10 0.09 0.18 0.10

2 - △△ CT675.12 1.00 32.75 127.25 172.74

表1不同蜕皮时相中华绒螯蟹MIH mRNA的表达差异（2008年6月上旬）

Table 1.The MIH mRNA expressions levels of Eriocheir sinensis in different stages (early June of

2008)

CT内标基因

CT目标基因35.10 37.45 36.50 39.19 36.42 33.99

裂缝指数0.10 0.05 0.12 0.05 0.20 0.21

2 - △△ CT1462.28 130.42 1.00 7.76 21.19 1479.10

表2不同蜕皮时相中华绒螯蟹MIHmRNA的表达差异（2008年7月上旬）

Table2.The MIH mRNA expressions levels of Eriocheir sinensis in different stages (early July of

2008)

血淋巴中MIH表达水平的下降会引起Y-器官的激活，使之分泌和释放蜕皮激素，从而引起河蟹蜕皮发生。通过对中华绒螯蟹蜕皮周期中编码MIH的mRNA进行荧光定量分析，不同蜕皮间期均有稳态的MIH mRNA转录表达，结果如表1和2所示：在蜕皮间期中，MIH mRNA表达水平亦呈周期性的变化，即在蜕皮前期(D1-D4期)MIH mRNA表达水平逐渐降低，在D3-D4期左右时达到最低，蜕皮之后2～10天（A-B期）MIH mRNA表达水平急剧升高，达8～30倍以上，在C-D期MIH mRNA表达水平继续持续稳定升高，直到进入下一蜕皮周期，该结论与R.DOUGLAS WATSON[ 5 ]等人对另一种甲壳类动物（美国蓝蟹）的蜕皮抑制激素研究变化结果一致。2008年6月份、7月份两次采集生产上不同蜕皮时期的河蟹，蜕皮抑制激素MIH mRNA水平均呈现此周期性变化，与河蟹蜕皮发生现象相一致。

本文结合生产中蟹农根据河蟹头胸甲用于判断河蟹蜕壳时期的经验

通过研究R.DOUGLAS WATSON[ 4 ]等人研究成果如图3，姜仁良等人的研究结论在蜕皮前后，河蟹血淋巴中20-羟基蜕皮酮含量伴随蜕皮前后呈升高降低的周期性变化趋势，结合

本次实验结果表1和2，可初步认为河蟹蜕皮抑制激素与蜕皮激素协同作用参与蜕皮发生，伴随蜕皮前后呈现周期性变化趋势，本实验在mRNA水平上证实了蜕皮抑制激素MIH的生理功能，通过抑制Y器管蜕皮素的合成来调节蜕皮现象发生，这与Lee[6 ]等人的关于美国蓝蟹蜕皮抑制激素和蜕皮激素周期性变化的研究结果相似，但要具体弄清楚蜕皮现象的调节机制，仍有许多工作需进一步深入探究。

From R.DOUGLAS WATSON

图3 不同蜕皮时期蓝蟹蜕皮激素水平变化

Figure3.Ecdysteroid titer in different stages during a molt cycl of C. sapidus.A

3. 结论

蜕皮抑制激素MIH控制甲壳动物的蜕皮，在蜕皮间期血淋巴中高水平的MIH抑制Y-器官的蜕皮酮的合成和释放，因此，MIH在蜕皮周期的多数时间内抑制Y-器官的活动．只有当MIH的分泌量减少或停止时蜕皮现象才会发生(Spazianietal，1991；Kleinetal，1993)，然而大量的研究表明，在蜕皮现象的调控过程中，蜕皮抑制激素MIH的作用不是独立的，是各种神经激素相互之间的促进与制约来实现对蜕皮这一生理过程的调节。本文在此基础上，在mRNA 水平上研究动物了不同蜕皮亚期中华绒螯蟹蜕皮抑制激素表达水平的变化，下一步我们将重点摸索其体内和体外进行功能和相互关系的测定，以提高蜕皮调控生产效益。

参考文献：

[ 1 ] 罗荣生, 王幽兰, 曹梅讯等. 中华绒螯蟹血淋巴20 - 羟蜕皮酮诱发蜕皮和卵巢发育的作用[J ] . 动物学报, 1990 , 36 (2) :157 - 164.

[2] 顾志敏, 何林岗. 切除单侧眼柄对中华绒螯蟹蜕壳、生长、成熟的影响[J ] . 淡水渔业, 1991 , 5 : 10 - 13.

[3 ] 孙金生, 刘安西, 杜育哲等. 中华绒螯蟹窦腺的显微和超微结构[J ] . 动物学报, 2001 , 47 (1) : 27 - 31.

[4] Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen，利用实时定量PCR技术通过2 - △△ CT 方法分析

相对基因表，METHODS25,402-408.（available online at https://www.360docs.net/doc/9c15010157.html,）[5 ] R. Douglas Watson, Kara J. Lee, ShihongQiu. Molecular Cloning, Expression, and Tissue Distribution of Crustacean Molt-Inhibiting Hormone1 , American Zoologist[J ],2001，

41(3):407-417;

[6 ] Lee KJ, Watson RD, Roer RD. Molt-inhibiting hormone mRNA levels and ecdysteroid titer during a molt cycle of the blue crab, Callinectes sapidus. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Aug 28;249(3):624–627.