质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定
一、实验目的
1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；
2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；
3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；
4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；
5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理
1.PCR(多聚酶链式反应)
在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：
A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备
(1).碱裂解法：
染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：
A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；
B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：
A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；
B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；
C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；
B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:
DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰
蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰
碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰
C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；
A260/A280=1.8 DNA纯净
A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质
A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
4.质粒DNA的酶切鉴定：
限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).
三、材料与方法：
（一）实验材料：
1.PCR
仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管
材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物
2. 质粒DNA的提取与制备
仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管
材料：溶液P1（S1）、溶液P2 (S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法）
仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪
材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ
4.质粒DNA的酶切鉴定
仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪
材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳
仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统
材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（二）实验方法
1.PCR
2.质粒DNA的提取与制备
3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）
4.质粒DNA的酶切鉴定
5.琼脂糖凝胶电泳
四、结果与讨论：
（一）实验现象
1.加入溶液P1，出现悬浮现象；
2.加入溶液P2,温和混匀，溶液会变得清亮；
3.加入溶液P3,有白色絮状沉淀生成；
4.电泳时，可观察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度不同。在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。
（二）实验结果
原始实验数据
电泳后的图片
（四）实验分析
1.由上数据可知，Ratio=1.47
A260/A280<1.8 表明样品中含有较多的蛋白质（芳香族）
2. 在图片中，其他三类DNA与Maker相比较，可知质粒DNA的分子大小在2500bp-3500bp，酶切反应的质粒DNA片段分子大小在2800-3000bp和400-500左右，PCR的DNA分子大小在400-500bp。基本符合预期。
（四）实验讨论
1.质粒DNA中出现三条带，分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。,
2.对于实验结果中：A260/A280<1.8的可能原因为：
A.在质粒DNA的提取实验的“取上清液”步骤中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质，进而导致后续实验中因蛋白质量较多而难以去除。
B.可能为试剂污染引起杂质蛋白的引入。
3.实验中需注意的事项：
用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不用换吸头，每次换不同试剂时要记得换一个新吸头。
在PCR中，如果配好的反应液较多沾到管壁上，要将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后才将反应管放到基因扩增仪上。
在质粒DNA提取的实验中，加入溶液S2时，时间不能太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次。
在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。
在电泳中，Geldview有毒，切勿用手接触。
思考题：
（1）碱裂解法提取质粒时，溶液I、II、III的作用分别为？
答：
溶液I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用；有利于溶酶体的作用。溶液II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。
溶液III：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA。（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？
答：
①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul，且酶切反应中甘油浓度应低于5%。
③底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。
④反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应。