CTAB法提取植物总DNA
关于CTAB法提取基因组DNA，原理
CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA 分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
简言之，无论哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的。
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
发布: 2010-06-02 08:20| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 634 次
原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
一、CTAB提取缓冲液的经典配方：
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
二、CTAB提取缓冲液的改进配方：
(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；
(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；
(3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从
而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；
(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；
(5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE 中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。
三、基因组DNA提取常见问题
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。
（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。
（2）DNA降解，DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。
要用冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：
1.确保采样后立即投入液氮中保存.
2.在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会DNA降解得很厉害。装管的时候，材料一定要有液氮的保护才行！否则研磨时的液氮保护DNA不都前功尽弃了？可以这样做：将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。
另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。
提取DNA时加液氮的目的主要是防止DNA的降解，所以必须一直提醒自己，减少材料回温的机会，液氮保护必须自始至终。
3.在用CTAB法提取时，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔！
4.加酚/氯仿/异戊醇静置30min后，离心温度不可过低。尽量保持在15度以上。
5.将DNA加入异丙醇析出时用的枪头一定要剪过的。这点很重要。过尖的枪头会把DNA 链弄断。
6.加入异丙醇后出现的DNA絮状物尽量要挑出，尽量不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多了。
另外，看楼主的电泳图条带比较弱，看来不只是降解，提取量也比较少。这里对于增加提取量想说明一点，在研磨样品时，研得细和研得很细，提出的DNA量可以相差几倍！所以，在液氮保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！