细胞生长的检测

细胞生长的检测

1）、MTT 溶液的配制方法：

通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml

的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

2）、普通MTT法实验步骤：

1 接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

2 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3 呈色：培养3-5天后，每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/ml用PBS配制，

pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

4 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

五、细胞迁移、侵袭检测

(采用transwell实验，因为transwell相对划痕更好定量，还可以检测细胞穿越ECM成分的能力，Transwell的另一个优点是可以加不同的趋化因子在下面的孔里，也可以加不同的抑制剂或促进剂在上面的孔里，相对划痕，可以做更多的实验设计)

采用corning公司的24孔板中装的transwell小室，孔径为8微米，ECM胶是sigma公司的，8-12mg/ml，所用细胞为恶性胶质瘤细胞

步骤如下：

1.实验前一天将ECM胶（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4℃冰箱中融化过夜

2.实验时将所用的枪头在冰上预冷半个小时，ECM胶用预冷的无血清1640按1：9稀释（稀释至1mg/ml），每孔中加入稀释好的ECM胶40μl，放入37℃培养箱中，孵育5h

3.水化基底膜：吸出小室中残余液体，每孔加入70ul含无血清1640培养液，37℃，30min，吸去培养基

4.对数生长期的细胞，胰酶消化细胞，0.1%血清1640悬浮，计数，稀释至密度为1 106/ml，每空中加200μl细胞悬液

5.24孔板下室一般加入600μl含30%新生牛血清的1640培养基

6.24h后，弃去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20分钟，0.1%结晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞

7.400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数

六、细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)具体操作如下：

1、对于悬浮细胞：

A、在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm) 离心5分钟，弃上清，收集细胞，

用PBS轻轻重悬细胞并计数。（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。）

B、取1~5×105重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入500μl 结合液轻轻重悬细胞。

C、加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。

D、室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。

E、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧

光显微镜下检测，滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。

2、对于贴壁细胞：

A、把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细胞消化液(最

好不用含有EDTA)消化细胞。（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）B、细胞消化下来后，加入步骤2A中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g

离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。。

C、取1~5×105重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入500μl结合液轻轻重悬细胞。

D、加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。

E、室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。

F、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧

光显微镜下检测，滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。