芝麻EST-SSR标记的开发和初步研究

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(12): 2077?2084　https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.02077

芝麻EST-SSR标记的开发和初步研究

魏利斌1张海洋2,*郑永战2郭旺珍1,*张天真1

(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095; 2 河南省农作物新品种重点实验室, 河南郑州450002)

摘要: 为加速分子标记在芝麻研究中的应用, 利用网上现有的芝麻EST(expressed sequence tags)数据信息, 开展了

芝麻EST-SSR功能性标记的开发和利用研究。在所有的3 328条芝麻EST序列中共确认得到1 785条非冗余EST

序列。其中, 在含有微卫星重复的148条序列中共检测有155个EST-SSR。非冗余EST序列总长为774.27 kb, 平均

每4.99 kb含有一个EST-SSR。EST-SSR的分布频率和特征分析表明, 以AG/TC为重复基元(motif)的SSR出现最多,

占总SSR的37.42%。利用这些序列, 设计开发了50对EST-SSR引物, 并分别选用36个芝麻、2个棉花、2个大豆

和2个油葵进行多态性和通用性研究。其中44对引物在供试芝麻材料中扩增出条带, 共产生108个位点, 平均每对

引物产生2.45个位点, 多态信息含量(polymorphism information content, PIC)平均值为0.390。根据遗传相似性系数进

行聚类, 有26个芝麻材料聚类在两个大的亚类(III和IV)中, 聚类结果表明芝麻的基因型与地理来源之间没有必然的

联系。此外, 分别有2对、3对和4对引物可以在棉花、大豆和油葵中进行通用性扩增。本研究证实这种全新开发的

芝麻EST-SSR标记在芝麻遗传多样性分析、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。

关键词: 芝麻; 表达序列标签(EST); 简单重复序列(SSR); 多态信息含量(PIC); 遗传多样性

Development and Utilization of EST-derived Microsatellites in Sesame (Sesamum indicum L.)

WEI Li-Bin1, ZHANG Hai-Yang2,*, ZHENG Yong-Zhan2, GUO Wang-Zhen1,*, and ZHANG Tian-Zhen1

(1 National Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Cotton Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu; 2 Henan Key Laboratory of Crop Improvement, Zhengzhou 450002, Henan, China)

Abstract: The deficiencies of markers in Sesamum indicum L. that can be used at home and aboard seriously restrict its studies in molecular field. To accelerate the application of molecular markers in sesame, EST-SSR markers development and utilization using publicly available sesame EST data were performed. A total of 1 785 non-redundant EST sets were assembled among the

3 328 identified sesame EST. 148 microsatellites sequences containing 155 EST-SSR were detected from these EST. The total length of the non-redundant EST sequences was 774.27 kb, on average one EST-SSR each 4.99 kb. The distribution characteris-

tics of the EST-SSR markers was analyzed. Among the SSR, dinucleotide AG/TC was the most abundant (occurring 58 times), with frequency of 37.42%. According to these EST sequences containing SSR, 50 primer pairs were designed and tested on 36 sesame accessions, 2 cotton accessions, 2 soybean accessions, and 2 oil sunflower accessions to detect polymorphisms and trans-ferability. With 44 EST-SSR, 108 loci were successfully amplified in sesame, with an average of 2.45 loci per primer pair. Of the

44 amplified primer pairs, 27(61.4%) primer pairs revealed polymorphisms in the 36 sesame accessions. The PIC (polymorphism information content) ranged from 0.105 to 0.844, with an average of 0.390. Based on genetic similarity coefficient, the UPGMA dendrogram grouped 26 of 36 accessions in to two sub-clusters (III and IV), but it revealed no association between genotypes and geographical sources. In addition, 2, 3, and 4 SSR markers could be transferred to the PCR of cotton, soybean and oil sunflower

基金项目: 国家自然科学基金项目(30471104); 国家重大基础研究前期研究专项(2003CCAO0700); 教育部111工程项目(B08025)

作者简介: 魏利斌(1980?), 男, 山西大同人, 博士研究生, 主要从事分子遗传育种研究。E-mail: liwang206 @https://www.360docs.net/doc/a29217002.html, *通讯作者(Corresponding authors): 郭旺珍(1970?), E-mail: moelab@https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,; 张海洋(1963?), E-mail: zhy@https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,

两个完成单位具有同等贡献。

Received(收稿日期): 2008-05-04; Accepted(接受日期): 2008-07-15.

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respectively. This study effectively proved that EST-SSR from sesame is valuable for genetic analysis, linkage mapping and transferability study among oil plants.

Keywords: Sesame (Sesamum indicum L.); EST; SSR; PIC; Genetic diversity

近几年, 国内外在芝麻(Sesamum indicum L.)分子领域的研究已悄然兴起, 但可利用标记的匮乏严重制约着其发展。目前, 在芝麻研究中应用到的分子标记十分有限, 仅有少数关于RAPD[1-2]、ISSR[3]、AFLP[4]和SSR[5]标记的初步报道, 尚未开展利用分子标记技术进行芝麻品种改良及遗传图谱构建等研究。加快芝麻的基因组研究, 需要开发更多有效的分子标记。生物信息学和新标记技术的不断发展为芝麻分子标记的开发提供了新手段。

在表达序列标签(expressed sequence tag, EST)中存在一定数量的微卫星或简单重复序列(EST-SSR), 因此, EST-SSR反映基因的编码部分, 可直接获得基因表达的信息, 并有可能对重要性状的等位基因进行直接鉴定。利用GenBank上(https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,/dbEST/dbEST_summary .html)公布的芝麻EST数据开发其功能性的EST-SSR标记, 不仅可降低引物开发的成本, 而且能大大提高现有测序数据的利用效率。自2000年起, 已有许多作物开展了EST-SSR标记的开发, 并已用于基因组和分子育种研究等方面[6-9]。本文利用生物信息学软件对网上公布的芝麻EST-SSR的分布特征进行了分析, 在此基础上开发50对芝麻EST-SSR标记并初步研究了这些标记在芝麻和其他油料作物间的可利用性。该结果将为芝麻EST-SSRs标记的后续开发以及应用于遗传多样性、遗传图谱构建和比较基因组研究等方面奠定基础。

1材料与方法

1.1 EST序列来源及EST-SSR的检测

从dbEST/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih/entrez) 中以FASTA格式下载芝麻中所有的来源于开花后5~25 d种子形成过程的EST序列, 共3 328条。利用Blastclust (v.2.2.10; https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,/web/ newsltr/spring04/blastlab.htm)软件, 对3 328条EST 序列进行冗余性查找, 再用文本文件中的查找功能在非冗余的1 785条序列中查找以单核苷酸为重复基元(motif)的SSR; 并用在线软件SSRIT (https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,/cgi-bin/rice/ssrtool.pl)查找以2、3、4、5、6个核苷酸为重复基元的其余5种类型SSR。种类型SSR。SSR的查找标准为不同重复基元的SSR 其总重复序列长度不低于18个核苷酸。

1.2 EST-SSR的引物开发

利用Primer 3.0(https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,/cgi-bin/ primer3/primer3_www.cgi)对包含155个EST-SSR的148条EST进行引物设计, 得到50对EST-SSR引物。引物设计的主要参数是, 引物长度20~26 bp; 退火温度T m值48℃~65℃; (G+C)含量30%~70%; PCR扩增产物长度大于150 bp; 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。采用Blastn和Blastx (http://www. https://www.360docs.net/doc/a29217002.html,)对EST序列的相关信息和功能进行预测(数据略)。

1.3植物材料

选取36个芝麻材料, 包括18个国内品种, 16个国外品种和2个野生种(表1), 用于检测所设计EST- SSR引物的扩增效果和多态信息含量(PIC); 同时选取2个棉花材料(海7124和TM-1)、2个大豆品种(南农9416和科丰-1)、2个油葵品种(康地1033和新葵扎1207-8), 用于检测芝麻EST-SSR标记在这些作物中的通用性。

1.4 DNA提取、PCR扩增和电泳检测

供试材料的DNA主要参照Paterson 等[10]的方法提取, 在美国MJ Research公司的PTC-225上完成SSR-PCR扩增。反应总体系为10 μL, 其中含1倍的buffer, 2.0 mmol L?1的MgCl2, 0.1 mmol L?1的dNTPs, 1 μmol L?1的引物, 0.5 U的Taq聚合酶和 80 ng的模板DNA。为避免和减少非特异性扩增的发生, 所设退火温度均不低于58℃。参照张军等[11]方法将扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳, 银染, 检测多态性。以1、0记录扩增带型的有无。

1.5多态信息含量和遗传相似性分析

多态信息含量被用来评估所设计引物的潜在利用率。本实验的每个EST-SSR引物的多态信息含量

按Park等[12]提供的公式计算, 即PIC=1?∑

=

n

i1

P i2, 其

中P i为i位点的基因频率, n为等位基因数。利用NTSYS-pc Ver.2.10 [13]软件中的SIMQUAL程序对36个供试芝麻品种进行遗传相似性分析, 按SHAN 程序和UPGMA方法进行聚类分析生成聚类图[14-15]。

第12期魏利斌等: 芝麻EST-SSR标记的开发和初步研究2079

表1本实验所用36个芝麻材料

Table 1 Description of 36 sesame accessions used in this study

编号No. 材料名称

Accession

缩写

Abbreviation

来源

Source

驯化程度

Domestication

1 白芝麻White sesame WS 山东Shandong, China 栽培种Cultivated

2 黄芝麻Yellow sesame YS 辽宁Liaoning, China 栽培种Cultivated

3 河北霸王鞭Hebei bawangbian HBBWB 河北Hebei, China 栽培种Cultivated

4 吐鲁番白芝麻Tulufan white sesame TLFWS 新疆Xinjiang, China 栽培种Cultivated

5 巧家美字Qiaojiameizi 1 QJMZ 云南Yunnan, China 栽培种Cultivated

6 中油所1134 Zhongyousuo 1134 ZYS1134 湖北Hubei, China 栽培种Cultivated

7 荣县黑芝麻Rongxian black sesame RXBS 四川Sichuan, China 栽培种Cultivated

8 湖南芝麻Hunan sesame HNS 湖南Hunan, China 栽培种Cultivated

9 武乡芝麻Wuxiang sesame WXS 山西Shanxi, China 栽培种Cultivated

10 五撮鞭 Wucuobian WCL 陕西Shaanxi, China 栽培种Cultivated

11 风台1号 Fengtai 1 FT 安徽An’hui, China 栽培种Cultivated

12 广东黑芝麻Guangdong black sesame GDBS 广东Guangdong, China 栽培种Cultivated

13 武宁黑芝麻Wuning black sesame WNBS 江西Jiangxi, China 栽培种Cultivated

14 北京霸王鞭 Beijing bawangbian BJBWB 北京Beijing, China 栽培种Cultivated

15 豫芝1号 Yuzhi 1 YZ 河南Henan, China 栽培种Cultivated

16 芩巩芝麻Qingong sesame QGS 贵州Guizhou, China 栽培种Cultivated

17 崖州黑芝麻Yazhou black sesame YZBS 海南Hainan, China 栽培种Cultivated

18 通榆芝麻 Tongyu sesame TYS 吉林Jilin, China 栽培种Cultivated

19 Tashengan

122 TSG122 苏联Russia 栽培种Cultivated

20 Japan sesame 301 JS301 日本Japan 栽培种Cultivated

21 Japan sesame 25 JS25 日本Japan 栽培种Cultivated

22 India sesame 3 IS3 印度India 栽培种Cultivated

23 India sesame 6 IS6 印度India 栽培种Cultivated

24 Turkey

sesame TS 土耳其Turkey 栽培种Cultivated 25 Sesame

23-1 S23-1 阿联酋United Arab Emirates 栽培种Cultivated 26 Sesame

24-12 S24-12 阿联酋United Arab Emirates 栽培种Cultivated

27 Gaochanzhe GCZ 缅甸Burma 栽培种Cultivated

28 Black sesame B BSB 缅甸Burma 栽培种Cultivated

29 Liano27 Liano27 墨西哥Mexico 栽培种Cultivated

30 Venezuela

sesame VZLAS 委内瑞拉Venezuela 栽培种Cultivated 31 Ethiopia

sesame ETHS 埃塞俄比亚Ethiopia 栽培种Cultivated 32 Guinea

K2-1 GUIK2-1 几内亚Guinea 栽培种Cultivated 33 Oro

short-2 ORO-2 莫桑比克Mozambique 栽培种Cultivated

34 Ciano27 Ciano27 美国America 栽培种Cultivated

35 Wild sesame 1 WILD1 印度India 野生种Wild

36 Congo wide sesame CWILD 刚果Congo 野生种Wild

1~18为国内芝麻品种; 19~36 为国外芝麻品种。

1–18 are Chinese sesame accessions; 19–36 are exotic sesame accessions.

2结果与分析

2.1源于芝麻EST的SSR发掘及其特征分析2.1.1 EST-SSR的发掘用Blastclust (ver.2.2.10)和ClastalX1.81软件对3 328条EST序列进行冗余性查找, 得到非冗余序列1 785条。然后利用在线软件SSRIT和文本文件中的查找功能在非冗余序列中查找, 共获得符合标准的EST-SSR 155个, 分布于148条EST序列中, 占被调查EST的8.68%。1 785条非冗余EST序列拼接总长度为774.27 kb, 平均每4.99 kb出现一个SSR。

2080 作 物 学 报 第34卷

参照Weber [16]的分类标准把155个EST-SSR 分为精密型(perfect)、非精密型(imperfect)和复合型(compound) 3种类型, 其中精密型SSR 有125个(80.65%), 非精密型SSR 有11个(7.10%), 复合型SSR 有19个(12.26%)(表2)。在精密型SSR 中二核苷酸重复基元类型的SSR 出现频率最多, 为65个, 占整个精密型SSR 的52.00%; 在非精密型SSR 中单核苷酸重复基元类型的SSR 出现频率最多, 为8个, 占整个非精密型SSR 的72.73%。复合型SSR 又分成精密复合型(perfect compound)和非精密复合型(imperfect compound)两类, 分别含5个和14个SSR, 且全为二核苷酸重复基元类型。

表2 芝麻EST-SSR 的类型和频率

Table 2 Types and frequencies of EST-SSR in sesame

重复基元类型 Repeat motif type

数量 Number 频率

Frequency (%)

单核苷酸 Mono-nucleotide 9 7.2 二核苷酸 Di-nucleotide 65 52.0 三核苷酸 Tri-nucleotide 13 10.4 四核苷酸 Tetra-nucleotide 4 3.2 五核苷酸 Penta-nucleotide 3 2.4 六核苷酸 Hexa-nucleotide 31 24.8 精密型Perfect

总数 Total

125 80.7

单核苷酸 Mono-nucleotide 8 72.7 二核苷酸 Di-nucleotide 3 27.3 非精密型Imperfect 总数 Total

11 7.1

精密型 Perfect 5 26.3 非精密型 Imperfect 14 73.7 复合型Compound 总数 Total

19 12.3

2.1.2 EST-SSR 重复基元的类型特征 在精密型和非精密型SSR 中, 按照重复基元的种类, 可将136个SSR 分为52种重复基元。 其中单、二、三和六碱基重复基元中出现频率最多的重复基元分别是(A/T)n 、(AG/TC)n 、(CCA/GGT)n 和(CGGCAA/GCCGTT)n (表

3)。它们在各自重复基元类型中的比例分别是100%、 85.29%、23.08%和29.03%(因四、五碱基重复基元类型较少, 故未做统计)。在所有类型的重复基元中, 二核苷酸重复基元出现的频率最高为50.0%, 其次分别为六、单、三、四和五核苷酸重复基元(表3)。

表3 精密型和非精密型SSR 中不同重复基元出现的频率

Table 3 Frequency of different repeat motifs in perfect and imperfect SSR

频率 Frequency (%)

最多的重复基元 The highest motif 重复基元类型 Motif type

数量 Number

非复合型SSR

In perfect and imperfect SSR

总SSR In all SSR 类型 Type

数量 Number 频率

Frequency in all SSR(%)

Mono-nucleotide 17 12.5 11.0 (A/T)n 17 11.0 Di-nucleotide 68 50.0 43.9 (AG/TC)n 58 37.4 Tri-nucleotide 13 9.6 8.4 (CCA/GGT)n 3

1.9 Tetra-nucleotide 4

2.9 2.6 — — — Penta-nucleotide 3 2.2 1.9

—

—

—

Hexa-nucleotide 31

22.8

20.0 (CGGCAA/GCCGTT)n 9 5.8

在检测到的52种SSR 重复基元中, 所占比例最大的是(AG/TC)n , 为37.42%, 其次是(A/T)n , 为10.97% 和(CGGCAA/GCCGTT)n , 为5.81%等(图1)。

在复合型SSR 中, 所有的19个复合型SSR 均为两核苷酸和两核苷酸重复基元串联, 且每一串联重复基元的长度大于8 bp, 总长度不低于18 bp 。

第12期

魏利斌等: 芝麻EST-SSR 标记的开发和初步研究 2081

图1 芝麻EST-SSR 的分布频率

Fig. 1 Frequency distribution of sesame EST-derived SSR

based on motif numbers

本图仅列出SSR 基元频率大于1.5%的类型。 SSR motifs frequency >1.5% in the figure.

2.2 芝麻EST-SSR 的有效扩增率和多态性分析

利用Primer 3.0, 本文共设计50对EST-SSR 引物, 并选取36个芝麻品种对新合成引物进行扩增能力和多态性分析。其中44对(88%)引物扩增出特异性条带、4对(8%)扩增出非特异性条带、2对(4%)无扩增产物。44对引物共产生108个位点, 平均每对引物产生2.45个位点。在可利用的44对引物中有27对(61.4%)在36个芝麻材料间扩增出多态, 共产生91个多态性位点。其中引物Y1994检测到的位点最多为7个(图2)。

2.3 36个芝麻品种的遗传相似性分析

根据27对多态引物在36个芝麻材料中所获的多态性位点数据, 得到0.105~0.844的PIC 值, 平均为0.390。引物Y1994显示最高的PIC 值(0.844)。聚类分析(图3)表明供试芝麻材料的聚类结果与地理

图2 EST-SSR 引物Y1994对36个芝麻材料扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

Fig. 2 Electrophoregram displaying the marker landing patterns of 36 sesame accessions with Y1994 EST-SSR primer

M: 分子量marker; 01~36: 36个芝麻材料; 序号同表1。

M: DNA ladders; 01–36: 36 sesame accessions. The numbers for each lane correspond with the numbers for accessions given in Table 1.

图3 基于91个EST-SSR 多态位点的Jaccard 相似性系数构建的36个芝麻材料的聚类树状图

Fig. 3 UPGMA dendrogram of genetic relationships of sesame varieties based on the Jaccard similarity coefficient from the 91 am-plified EST-SSR loci

2082作物学报第34卷

来源不存在相关性, 不同来源的品种交错分布在所聚类的分支中; 2个野生芝麻种(WILD1和CWILD)作为第一分支(I)在相似性系数为0.199时和其余的34个栽培种分开; 在相似性系数为0.451时, 国内品种河北霸王鞭(HBBWB)与其余的33个栽培种分开。当相似性系数为0.675时有两个大的亚支(III和IV)被分开, 共包括36个品种中的26个, 其中在分支IV 内聚类有6个国外和12个国内品种; 在分支III内聚类有2个国内和6个国外品种。

2.4芝麻EST-SSR标记在不同油料作物间的通用性

利用所设计的50对引物在棉花、大豆、油葵3个异属油料作物中进行PCR扩增(退火温度不低于62℃), 分别有2对(Y1988和Y1995)、3对(Y1966, Y1981, Y2015)、4对(Y1984, Y2001, Y2005, Y2007)引物能扩增出清晰条带, 可用于进一步的比较基因组学研究(图4)。

图4芝麻EST-SSR引物在不同油料作物中通用性的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

Fig. 4 Electrophoregram displaying transferability of the sesame EST-SSR in different oil crops

M1~M4: 分子量marker; 1~4: 棉花品种(1, 3: TM-1; 2, 4: 海7124); 5~10: 大豆品种(5, 7, 9: 南农9416; 6, 8, 10: 科丰-1); 11~18: 油葵

品种(11, 13, 15, 17: 康地1033; 12, 14, 16, 18: 新葵扎1207-8)

M1-M4: DNA ladders; 1–4: cotton accessions (1, 3: TM-1; 2, 4: H7124); 5–10: soybean accessions (5, 7, 9: Nannong 9416; 6, 8, 10: Ke-feng-1); 11–18: oil sunflower accessions (11, 13, 15, 17: Kangdi 1033; 12, 14, 16, 18: Xinkuiza 1207-8).

3讨论

对于EST-SSR的分布特征, 不同学者利用不同的材料以及不同的EST-SSR搜索标准导致了不同的结果。在拟南芥中, 按照Cardle等[17]的统计标准, 平均13.8 kb出现一个SSR; 按照Morgante等[18]的统计标准, 平均2.1 kb出现一个SSR; 在水稻中, 按照Cardle等[17]的统计标准, 平均3.4 kb出现一个SSR; 若按照Gao等[19]的统计标准, 将不同重复基元的最小长度定为18 bp, 则平均11.8 kb出现一个SSR。本文按照Gao等[19]的统计标准, 将不同(单、二、三、四、五、六)重复基元的最小长度定为18 bp, 结果显示在芝麻中平均4.99 kb出现一个SSR。这明显高于Gao等[19]小麦中平均17.42 kb、水稻中平均11.81 kb、玉米中平均28.32 kb、大豆中平均23.80 kb出现一个SSR的研究结果。

与EST-SSR的分布特征相同, EST中不同基元类型SSR的出现频率, 不同研究者得出的结果也不尽相同。在棉花[8]中, 按单核苷酸重复≥25 bp, 二核苷酸重复≥14 bp, 三核苷酸重复≥15 bp的标准, 三核苷酸重复出现的频率最高(38.31%), 其次是二核苷酸(24.09%)和单核苷酸(23.35%); 在白菜[20]中, 按单核苷酸重复≥15 bp; 二核苷酸重复≥14 bp; 三核苷酸重复≥18 bp标准查找得出: 单核苷酸重复出现的频率最高(35.51%), 其次是三核苷酸(33.15%)和二核苷酸(30.67%); 但总的说来, 若按照Kantety等[21]对大麦、小麦、玉米、高粱和水稻查找EST-SSR的标准, 即所有重复基元总长度≥18 bp, 则上述各作物均以三核苷酸重复出现的频率最高。然而, Sook 等[22]对杏、桃等蔷薇科植物的EST-SSR分布特点的研究表明, 二核苷酸重复出现的频率最高, 且均超过总EST-SSR个数的50%。出现这种差异的原因可能是各作物EST的组织来源不同。在对棉花EST-SSR分布特征的研究中, Wang等[8]和Li等[23]用不同组织来源的EST进行分析, 得出的结果相差较大, 其中三核苷酸重复出现的频率分别为38.31%和54.80%; 本文中, 可能由于芝麻EST-SSR数量较少, 二核苷酸重复出现的频率最高(56.13%), 与Sook等[22]的研究结果相似。此外, 在芝麻二核苷酸重复基元中, (AG/TC)n基元类型出现频率最高(58/87, 66.67%), 这与上述各作物报道的二核苷酸重复基元结果相似[9,17,21]。就AG/TC基元类型出现频率较高这一现象,

第12期魏利斌等: 芝麻EST-SSR标记的开发和初步研究2083

Kantety等[21]做了详细的描述, 他们根据阅读框推测AG/TC基元可被翻译为Glu、Arg、Leu和Ala等氨基酸, 且Arg和Leu在蛋白质中所占比例较高, 分别为8%和10% [24]。

在EST-SSR标记的有效扩增率研究方面, 许多报道[19-20,22,25]均指出, 所设计引物的有效扩增率应在60%~90%之间, 且可能会因所设引物跨越mRNA 剪切位点以及扩增产物包含的内含子太大, 造成一部分引物不能扩增出产物。本文所设计的引物88%均可扩增出清晰的条带, 扩增率较高, 这可能是所设计引物中仅有少数跨越mRNA剪切位点所致。

一般来说, EST-SSR标记在揭示作物多态性方面要低于基因组SSR标记[25-28], 但也有不同的报道, Saha等[29]用高杆酥油草开发的EST-SSR标记对黑麦草和高秆酥油草两亲本进行多态筛选, 多态率为66%; Wang等[8]用雷蒙德氏棉EST-SSR标记检测海、陆四倍体栽培棉种间的多态性, 多态率为43%。Gupta等[30]报道其合成的EST-SSR标记在18个外源种中检测到81.25%的多态性。相比较而言, 本实验利用芝麻EST开发的EST-SSR标记在芝麻品种间得到的多态性较高(54%)。此外, 有学者[31-33]指出EST-SSR标记揭示的多态性会随着重复基元的长度和类型的变化而变化。Yi等[34]指出重复基元大于18 bp的EST-SSR比小于18 bp的EST-SSR揭示的多态水平要高(42.9%/17.7%), 并且二核苷酸重复基元的EST-SSR揭示的多态水平高于其他类型的重复基元。本文较高的多态水平可能与实验中相对严谨的搜寻标准(≥18 bp)和存在较多的二核苷酸重复基元类型有关(25/50)。

用多态信息含量(PIC)来描述EST-SSR位点的变异程度, PIC值越高, 说明该标记可提供的信息越多。一般来说, EST-SSR标记的PIC值会随着物种、标记数目以及供试材料的不同而变化。本研究得到的PIC平均值为0.390(0.105~0.844), 这些标记将在芝麻遗传多样性分析、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等方面的发挥作用。

根据遗传相似性聚类结果分析, 36个芝麻材料在地理来源和聚类结果之间相关性较小。这与前人[1-4]的研究结果一致。他们基于RAPD、ISSR和AFLP 标记均发现不同地理来源的芝麻品种交错分布在整个聚类树中。本研究中, 国内芝麻品种代表了供试材料的多样性也可能是这个原因。我们认为在芝麻进化方面, 生态和地理因素并没有产生关键作用, 因此建议芝麻的种质收集策略应集中在大量材料的收集方面, 一味追求收集不同地理来源的芝麻品种不可取。

芝麻EST-SSR标记在不同油料作物间可能因为供试材料与芝麻不属于同一科, 致使本文所设标记的可转移性较低, 但其可作为通用性标记在这些作物中应用。

4结论

开发了芝麻的EST-SSR标记并初步证明其可利用性。从EST中开发EST-SSR标记不仅速度快、成本低, 而且理论上可为功能基因提供“绝对”的标记。本文中的EST-SSR源于芝麻种子形成过程中的cDNA序列, 所以还可进一步用于种子油分合成的基因组和分子育种等研究。

References

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