人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

［基金项目］云南省自然科学基金资助项目（2009CD168）

［作者简介］颜汝平（1971～），男，山东泰安市人，在读博士研究生，主要从事膀胱癌的免疫治疗临床与研究工作.［通讯作者］王剑松．E-mail:jiansongwang@https://www.360docs.net/doc/aa11698587.html,

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

颜汝平1），周海滨1），李翀2），王剑松1），王伟1），赵献1

）（1）昆明医学院第二附属医院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所，云南昆明650101；2）中国科学院

生物物理研究所免疫与感染重点实验室，北京100101）

［摘要］目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell ，PBM C ），经体外诱导

培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell ，DC ）．方法

取健康人新鲜外周血，经密度梯度离心法分离，获得单

个核细胞，在含10%胎牛血清的RPM I-1640培养基中培养．置37℃、5%CO 2培养箱内静置培养2h 后除去悬浮细胞．培养液中加入rhGM -CSF 和rhIL -4继续培养贴壁细胞5d ，然后加入T NF-α促进其分化成熟．倒置显微镜下观察DC 形态，流式细胞仪（flow cytometer ，FCM ）对其进行表型鉴定．结果显微镜下观察DC 细胞

形态不规则，表面有大量的毛刺状突起；成熟DC 细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高．结论

用rhGM -CSF 、rhIL -4和T NF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞．

［关键词］树突状细胞；人外周血；细胞培养

［中图分类号］R392.2［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2010）11－0021－04

Inducing Culture in vitro and Phenotypic identification of

Dendritic Cells from Peripheral Blood of Healthy People

YAN Ru －ping 1），ZHOU Hai －bin 1），LI Chong 2），W ANG J ian －song 1），WANG Wei 1），ZHAO Xian 1）

（1）Dept.of Urology ，The 2nd Affiliated Hospital of Kunming Medical University ，Yunnan Institute of

Urology ，Kunming Yunnan 650101；2

）Key Laboratory of Immunology and Infection ，Institute of Biophysics ，Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100101，China ）

［Abstract ］Objective To isolate the PBM C from peripheral blood of healthy hum an,and get mature dendritic cell （

DC ）by inducing culture in vitro ．Methods PBM Cs were isolated from fresh peripheral blood of healthy people by the method of density-gradient centrifugation ．T he cells were cultured in RPM I-1640supplem ented with 10%fetal bovine serum at 37℃in a 5%CO 2humidified atm osphere for 2hours ，and then the suspended cells were removed ．T hen recombinant hum an granulocyte －macrophage colony －stimulating factor （rhGM -CSF ）and recombinant human interleukin-4（rhIL -4）were added into medium ，and the adherent cells were cultured to continue for 5d ．T umor necrosis factor-α（T NF-α）was added to prom ote DCs ’m aturation and differentiation ．Then the m orphological features were observed with inverted m icroscope and the phenotypes of cells were detected by flow cytometer （FCM ）．Results Under the m icroscope ，the dendritic cells were in irregular shape with slender synapses on their surface ．T he expressions of CD83and CD80on m ature dendritic cells were significantly higher on 8d than that on 4d ．Conclusion M ature dendritic cells can be cultured from

昆明医学院学报2010，（11）：21～24Journal of Kunming Medical University

CN 53-1049/R

第31卷

昆明医学院学报

22

peripheral blood of healthy people in vitro by utilizing rhGM-CSF，rhIL-4and TNF-α

［Key words］Dendritic cell；Peripheral blood；Cell culture

成熟树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前所知的功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC），能在体内外直接激活初始型T细胞，在免疫学、肿瘤学以及其它各学科中的作用日益受到关注[1]．DC广泛分布于全身组织和脏器，血液中数量极微，约占人外周血PBM C 的1%，直接分离和纯化困难，进而限制了其研究和应用．因此，从人外周血中分离、扩增获得足量DC，可以进一步研究其生物学特性和应用于临床．本实验从健康人外周血中分离出PBM C，体外经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合诱导成功培养获取了成熟DC．

1材料与方法

1.1材料

人新鲜外周静脉全血：购自北京市中心血站（来源于健康人）．

1.1.1主要试剂RPM I1640培养基和10%FCS （美国GIBCO公司），人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），PBS缓冲液（HyClone公司），Hanks液（Invitrogen公司）；rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α（R&D system公司）；PE标记的抗人CD80单抗、PE标记的抗人CD1a、FITC标记的鼠抗人CD83单抗（北京中杉金桥公司）．

1.1.2主要仪器和设备FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）；倒置相差显微镜（L eica公司）．1.2方法

1.2.1密度梯度离心法分离人PBMC取5个50mL的无菌离心管，每个加入10mL人新鲜外周静脉血，然后加入等体积的Hanks液稀释混匀．另取5个50m L无菌离心管，每个加入10 mL淋巴细胞分离液，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分离液上（稀释血液与分离液的比例为2:1），形成清晰界面．将5个离心管置水平离心机1500 r/min离心15m in，离心后从离心管底部到液面分为四层，依次为红细胞沉淀层、淋巴细胞分离液层、白雾状淋巴细胞层、血浆层．用吸管轻轻吸取5个离心管中白雾状淋巴细胞层细胞，移入另一离心管中，加入5倍体积的Hanks液充分混匀，1500r/m in离心5m in，弃上清液；沉淀细胞用PBS液离心（1000r/m in离心5m in）洗涤2次后，弃上清液，获得PBM C．

1.2.2DC细胞的体外培养和诱导分化用37℃、无血清的RPM I-1640液体培养基充分吹打重悬离心沉淀细胞，使成均匀细胞悬液；细胞计数，调整细胞浓度为1×105/m L移入75cm2培养瓶内，置37℃、5%CO2培养箱内静置培养；2h后吸去细胞悬液，去除未贴壁的细胞，贴壁细胞在含有rhGM-CSF100ng/mL，rhIL-4100ng/m L，10% FCS的RPM I-1640培养液中继续培养；第2天和第4天分别半量换液，培养第5天起加入T NF-α20ng/m L，促进DC成熟．

1.2.3DC表型鉴定倒置显微镜下每日观察细胞生长情况及形态变化，分别取培养第4天、第8天的细胞，PBS洗涤两次，调整细胞数为5×106/mL，取100μL细胞悬液加入流式检查专用试管中，分别加入PE标记的鼠抗人CD80单抗、PE标记的鼠抗人CD1a、FITC标记的鼠抗人CD83单抗，混匀后室温孵育30m in，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪（FCM）检测分析，无关抗体作阴性对照．

1.3统计学方法

采用SPSS统计程序进行统计分析，所得数据取平均值，以（x±s）表示，两组均数间比较采用t检验或t'检验．

2结果

2.1倒置显微镜下DC形态

从外周血获取的人PBM C体外培养2h后，获得贴壁细胞．加入rhGM-CSF、rhIL-4培养24 h，可见有细胞聚集现象．初时集落较小，由3～5个细胞组成，以后其直径逐渐增大，集落中的细胞数可达9～10个．第4天可见细胞大多呈悬浮生长并聚集成团，集落中的细胞边缘呈毛茸状，具有DC的特殊形态（见图1）．第5天加入T NF-α后，细胞逐渐从聚集状态变为分散状态，相差显微镜下可看到细胞形态不规则，表面有大

颜汝平，等．人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定23

第11期量的毛刺状突起，为典型的树突状细胞形态（见图2）．

2.2DC 表型鉴定

培养4d 、8d 的悬浮细胞经FCM 检测，三种人DC 表型的表达情况见表1．

图2成熟DC （×400）Fig.2Mature DC （×400）

箭头所示成熟

DC

图1成熟前DC （×400）

Fig.1Premature DC （×400）

培养天数n DC 表型

CD1a CD83CD804d 518.69±8.73

14.74±4.069.82±4.618d

5

78.07±9.43**

46.82±14.15*

60.11±20.50*

表1

培养4d 、8d DC 表型的表达情况［（x ±s ），%］Tab.1Phenotype of DC cultured for 4days and 8

days ［（x ±s ），%］

与4d 比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01.5

rhGM -CSF 、rhIL-4诱导出非成熟DC ，其中rhGM -CSF 是DC 生成所必需，rhIL-4可以抑制巨噬细胞生成、获得纯净的DC ，维持诱导培养DC 的强抗原提呈能力．第2阶段加入TNF-α成熟诱导因子，促进DC 的成熟．已经证明的促进DC 成熟的因子有：（1）细菌菌体或其产物，如L PS ；（2）某些病毒或核酸；（3）某些有炎症介质作用的细胞因子，如TNF-α；（4）某些刺激信号；（5）单核细胞条件培养液；（6）氧自由基供体过氧化氢[4]．其中TNF-α是目前应用最多的促DC 成熟因子．

本研究采用密度梯度离心法从人外周血获取了PBM C ，方法操作简单．在加入rhGM -CSF 、rhIL -4和T NF-α诱导培养DC 时，使用相差显微镜动态观察了树突状细胞形态的变化过程：由起初的细胞聚集到悬浮成团，再到分散状态；由DC 的毛茸状到不规则细胞表面的毛刺状突起．

由于尚没有鉴定DC 生物特异性的分子标志，目前只能通过DC 的形态学特点、组合性细胞表

面标志、在混合淋巴细胞反应（

M LR ）中能刺激初始T 细胞增殖三个方面加以综合判断．DC 的一些相对特异性标志如：人DC 的主要特异性标志CD1a 、CD11c 、CD83等已经得到人们的公认和应用．Coventry 等[5]认为，CD1a 主要表达于人胸腺细胞、树突状细胞（包括Langerhans 细胞），是鉴定人外周血与骨髓中DC 的最好标记，是DC 的特异性标志．本实验中，DC 从早期培养到诱导成熟，CD1a 的表达呈升高趋势．Rouard 等[6]认为，随着时间的延长，在DC 细胞的成熟过程中，CD1a 的表达将逐渐降低，本实验观察的时间短，未见到CD1a 表达的降低．Prechtel 等[7]研究发现，CD83是DC 成熟的标志，体外培养的DC 在早期不表达粘附分子CD83，当其成熟时才表达CD83．本实验研究也表明，在体外培养的DC 细胞，未接受T NF-α刺激成熟前CD83处于低表达的水平，T NF-α刺激后CD83表达由（14.74±4.06）%增高至（46.82±14.15）%，差异有统计学意义（P ＜0.05）．成熟DC 的共刺激因子CD80（B7-1）也高表达，由由第4天的（9.82±4.61）%上升到第8天的（60.11±20.50）%．

本实验成功用rhGM -CSF 、rhIL-4和TNF-α从健康人外周血中诱导、扩增获得大量成熟DC ，为进一步研究DC 的抗原递呈功能、研制和开发

3讨论

自1992年以来，人们已经成功地从人脐血、

外周血、骨髓中培养出DC ，与脐血、骨髓来源相比，成人外周血来源DC 培养方法具有取材容易、成熟阶段易于调控等优点[2]．DC 的培养分为启动培养和分化培养2个阶段[3]：第1阶段应用

第31卷

昆明医学院学报24chemother ，1993，37：1380－1382.

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（2010－09－24收稿）

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（上接第7页）

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（2010－09－18收稿）