CTAB法提取DNA

CTAB法提取DNA

试剂配置：

母液：

1)1M Tris-Hcl PH=8.0

称取12.11克Tris溶于70ml的水，再定容至100ml（灭菌后用浓Hcl调PH，约用10ml）2)250 mM的EDTANa2

称取9.305克EDTANa2溶于约70ml的水，用3M的NAOH调PH至8.0（可适当加热助溶），待调节好PH后定容至100ml

3)2M NaCl

称取NaCl 5.85克溶于约40ml的水，完全溶解后定容至50ml

将1）2）3）灭菌后，Tris-Hcl用浓Hcl调PH

DNA提取缓冲液（CTAB缓冲液100ml）：

100Mm Tris-Hcl PH=8.0 10ml 1M Tris-Hcl PH=8.0母液

250mM EDTANa2 10ml 250 mM的EDTANa2母液

2M NaCl 10ml 2M NaCl母液

2.5%PVP 称取2.5克PVP溶于约30ml的水

2.0%CTAB 称取2.0克CTAB溶于约30ml的水

均溶好后定容至100ml，使用前加入1%β-巯基乙醇

步骤：

1）称取0.1g(约3-4片)新鲜叶片，液氮中研磨成粉末，加入600ulCTAB缓冲液轻轻摇匀，65°C水浴保温50min左右

2）加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1,20个样需配40ml,即38.4氯仿＋1.6异戊醇），盖上瓶盖，温和摇动，使成乳状液

3）4°C 12500rpm 10min ,离心管中出现三层，小心吸取含有DNA的上清液，弃去中间的细胞碎片和变性蛋白以及下层有机相

4）根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇重复抽提1-2次

5）收集上清液，加入500ul异丙醇，颠倒混匀5-10min（或涡旋3min左右）

6）12500rpm 离心10min，弃上清；加0.5ml的70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，12500rpm 离心4min，除去乙醇，即为DNA粗制品；晾干后，将DNA制品溶于30ul的ddH2O，完全溶解后即可，取2ul电泳检测