流式中参数的意义

流式中参数的意义

前向角散射，即FSC与细胞直径平方正相关（大小），所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。

侧向角散射，即SSC是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息

FL2-A ，FL2-W 中A和W的含义

FL2-H1024，FL2-H256 中H的含义，1024和256又代表什么呢。

名词“道数”是怎么定义的？

w好像代表脉冲宽度，但是脉冲宽度反映的是细胞什么特性呢？

H-脉冲高度反映细胞什么特性呢？

好像你做的是细胞周期分析，

如果是，FL2－A代表的是荧光峰面积，反映了细胞DNA含量（前提是用Rnase处理去掉了RNA）；

FL2－W代表的是荧光峰宽度，这个值可以区分单个细胞和双联体细胞；

下面的1024和256是定义数据文件大小的（记得培训时工程师这么说的）

－H好像没有什么特殊含义，就是指这个通道了，

一般检测那个通道的荧光就是选择哪个－H，比如FSC－H，SSC－H，FL1－H等等

流式涉及的调节参数太多了，主要的有：

1.电压

2.阈值

3.荧光补偿

4.通道选择：需要哪些通道、选择面积/高度/宽度、线性/Log

5.停止条件选择

太多太多了

FL2-A代表FL2 AREA，FL2-H即FL2 HEIGHT，通过这两个参数，可以将粘连体排除出去，因为粘连体跟多倍体有相同的FL2-A，但是FL2-H远远大于正常细胞。

正确的设置是将FL2-A设置在200附近。当然，不设在200也可以，但是那样会对日后的分析造成困难。200道是对周期分析最佳的参数。

FSC是前向角散射，一般代表细胞的体积，值越大代表细胞越大。

SSC是侧向角散射，一般代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。

我初接触流式，很多东西都不是很清楚，查了园子里的资料也是一知半解的：

1.流式中FL1，FL2，FL3，FL4分别是指的什么？

2.PI单染观察细胞周期可以选其中的哪些呢？为什么？

3.如果FL选用不恰当，对结果会有影响吗？表现在那些方面呢？

我回答第一和第三个问题：

一，FL1，FL2，FL3，FL4指的是第1，第2，第3，第4个荧光，FL是fluorescence荧光的意思

三，对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物质标记的抗体。厂家根据需要开发了各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测,各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系，看能否检测。在附表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检

测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一下：

1 流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接法，即二抗

上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影响检测结果

2 厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、western 等，首选前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非常理想。

3 单抗和多抗均可应用。

4 绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC 标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法得出了满意的结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不能一起检测。

5 如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。我自己比较倾向于多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。

Annexin V/PI双染色法

基本原理

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

试剂与仪器

孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2

标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml

流式细胞仪

实验步骤

1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。

3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。

4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上

象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

细胞周期的流式检测

注意：所有操作在冰上进行。

1.收集细胞到15ml的管中，离心。再用10-12mL PBS洗细胞

2.沉淀细胞并重悬。

3.用5mL PBS洗细胞，重复步骤2。

4.在1mL 固定溶液里彻底重悬细胞。（1×PBS；0.5% Paraformaldehyde多聚甲醛,溶液在-70℃冻存，只能冻溶一次。该步骤用于GFP样品））

5.孵育不超过60 min。

6.离心

7.用10-12mL PBS洗细胞，再用5ml洗细胞，离心

8.加300ul含8%的小牛血清重悬打匀

9.加5ml70%乙醇，逐滴加入，放-20度下午测

在FCM分析细胞周期的方法是:收集细胞,PBS洗涤,70%冰乙醇固定,加入PCB溶液室温低渗处理后,离心去上清,加入RNaseA消化后,加入PI.上流式检测.

pc缓冲液是0.2 mol Na2HPO,192 ml, 0.1mol柠檬酸8ml 0.2 M ph=7.8，用作DNA抽提缓冲液，主要是使小的DNA片断出细胞。这样会更利于检测调亡峰。

，过夜！－20度！几个月没问题，超过半年没试过！

2，就是PC buffer！不能代替！抽提和破膜是两个概念！抽提时间30min，有的书上要冰浴，有的不要

我的步骤：

1）应用冰冷的1×PBS洗涤收集的细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清。

2）以0.5 ml 1×PBS重悬细胞，迅速打入3.5 ml 70％预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜（一个月之内检测均有效）。

3）离心乙醇固定过的细胞，弃上清，1×PBS洗涤细胞3次以去除残留的乙醇。

4）应用含有0.2 mg RNase A的1 ml PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重悬细胞，37℃染色15 min。

5）应用流式细胞仪测定细胞周期。

M期细胞比例增大可能说明细胞在有丝分裂过程存在阻碍，也可能是由于S期减少，细胞增殖速率下降，总之，还要具体看情况而定！

PCR-RFLP的SNP分型：选择合适的酶

做snp有一段时间了，受于实验室和经费的限制，只能选择比较原始的检测方法。不过现在条件比师兄那个时候的要好多了，起码能够可是用tagman 技术，应用探针来分型了，最多的时候我一天轻轻松松做了接近2000个样本的SNP分析。当然这个数目对于用酶切的方法来说就有点夸张了。

不过tagman探针对于我们没课题的人来说还是挺贵的，一对探针要3800，我们1500的样本量，加上MIX，还有排枪用的枪头，384孔板，贴膜，这样检测一个点大概要5000块钱。问题是现在想单个点发文章有点难了，最近又在一条通路上选了一些功能区的点，一共选了9个，如果都用tagman，没意义的话，那压力就太大了。因而我还是选择尽量用限制性内切酶来分型，这个确实便宜，如果能够选到便宜的酶，1500个样不用1000块钱的成本就能检测完。

最近也是边学边做，分享一下引物设计和酶选择的一些方法：

1．比较省心的方法。

最省心的方法无非就是找到文献引物和酶，直接验证一下然后用，即省心又有说服力。这个也很简单，到PubMed中搜索你关注的SNP，把相关的文章都看看，很容易找到的，但是如果你选的SNP没人做过PCR-RFLP，只能自己设计引物选酶了，请往下看。

2．傻瓜式的在线引物设计和酶选择

这个网站的地址是：https://www.360docs.net/doc/be2393810.html,/public_html/primer2.html

不仅能设计出来引物，而且酶都给选好了，直接找便宜的用就可以了。

PS：这个网站最近上不去了，不知道为什么。

3．SNP-cutter

这也是一个在线的SNP酶切设计工具，很简单，只要输入rs号，设置相关参数，输入自己的邮箱，提交，很快结果就会大到你的邮箱了。不过有错配的时候不太好用。

网址是：https://www.360docs.net/doc/be2393810.html,/SNP_cutter.htm

4. watcut

这个是我比较喜欢的，打开网页之后选择SNP-RFLP analysis，输入rs号，点击submit，OK，就看到了这个SNP的突变位点以及可以切得酶，如果没有能切得酶，还会帮你分析错配后的结果，比较省心。

5．在线引物设计primer3。

结合watcut用时最舒服的，用watcut选好酶，然后用primer3。方法简单，输入你查到的SNP序列，突变用[A/T]这样的符号标志，提交，引物就出来了。很方便。

mRNA、cDNA序列、ORF序列、CDS序列、Promoter、STS、ETS

mRNA（messenger RNA）信使RNA，是由编码区（CDS）、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，真核生物mRNA的5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴，但NCBI中mRNA序列实际上是cDNA序列，即经过反转录得到的与RNA序列互补的DNA序列，一般不包括3’多腺苷酸尾巴。一个cDNA序列被称为一个转录子，第一个碱基所在的位置为转录起始位点（TSS），cDNA都是由外显子组成，但编码蛋白质的外显子只有一个，即CDS（coding sequence），这段序列也就是一个ORF区，也就是这个cDNA 的ORF序列。参与特定基因转录及其调控的TSS上游序列称为启动子（Promoter），如原核生物在转录起始位点上游-10有一段TATAA T的保守序列，有助于局部解链，在-35有一段TTGACA序列提供RNA聚合酶识别信号，真核生物上游-25到-30TATA决定起始位点，-75位置CAAT与RNA聚合酶，这些都是启动子，启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。

克隆可以简单理解为复制品，例如假设通过提取mRNA，反转录后得到cDNA序列，然后将这段序列转入载体，再通过划线不断的繁殖，就会得到许多装有这段cDNA序列的克隆，实验室为了方便，在给得到的这些克隆起名时，一般会取cDNA序列的名，但实际上在这个克隆里面不仅包括了这个cDNA，还包括了载体的DNA。

STS（sequence-tagged site）序列标记位点，是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA序列，一般长度为200-500bp，一个DNA序列要成为STS，首先序列必须已知，能用PCR方法检测，第二STS必须在基因组上具有唯一的定位点。通过STS可以判断在不同条件下测序得到的DNA序列的准确性。

EST（expressed sequence tag）表达序列标签，是从一个随机选择的cDNA克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA序列。全基因组测序发现基因即昂贵又费时，因为基因组中只有2%序列编码蛋白质，因此可以对真正编码蛋白质的mRNA构建cDNA

文库，对cDNA进行测序，得到EST序列，从而发现新基因。

下面以大鼠CTGF基因为例子，小写字母是转录子前后200bp启动子相关序列，大写字母表示的是cDNA序列，也就是转录子，其中蓝色标记的部分为CDS序列，湖蓝色的为转录起始位点，即TSS，加粗带下划线的为起始密码子agtgtgccagctttttcagacggaggaatgtggagtgtcaaggggtcaggatcaatccggtgtgagttgatgaggcaggaaggtggggagg aatgcgaggaatgtccctgtttgtgtaggactccattcagttctttggcgagccggccgcccggagcgtataaaagccagcgccacccgccc agtctcacacagctcttCTCTCCAAGAAGACTCAGCCAGACCCACTCCAGCTCCGACCCTAGGA GACCGACCTCCTCCAGACGGCAGCAGCCCCAGCCCAGTGGACAACCCCAGGAGCCAC CACCTGGAGCGTCCGGACACCAACCTCCGCCCCGAGACCGAGTCCAGGCTCCGGCCG CGCCCCTCGTCGCCTCTGCACCCCGCTGTGCGTCCTCCTGCCGCGCCCCGACCATGCTC GCCTCCGTCGCGGGTCCCGTTAGCCTCGCCTTGGTGCTCCTCCTCTGCACCCGGCCTGC CACCGGCCAGGACTGCAGCGCGCAGTGTCAGTGCGCAGCTGAAGCGGCGCCGCGCTG CCCCGCCGGCGTGAGCCTGGTGCTGGACGGCTGCGGCTGCTGCCGCGTCTGCGCCAA GCAGCTGGGAGAACTGTGCACGGAGCGTGATCCCTGCGACCCACACAAGGGTCTCTT CTGCGACTTCGGCTCCCCCGCCAACCGCAAGATTGGCGTGTGCACTGCCAAAGATGGT GCACCCTGTGTCTTCGGTGGGTCCGTGTACCGCAGCGGCGAGTCCTTCCAAAGCAGTT GCAAATACCAGTGCACTTGCCTGGA TGGGGCCGTGGGCTGTGTGCCCCTGTGCAGCAT GGACGTGCGCCTGCCCAGCCCTGACTGCCCCTTCCCGAGAAGGGTCAAGCTGCCCGG GAAATGCTGTGAGGAGTGGGTGTGTGATGAGCCCAAGGACCGCACAGTGGTTGGCCC TGCCCTAGCTGCCTACCGACTGGAAGACACA TTTGGCCCTGACCCAACTATGA TGCGA GCCAACTGCCTGGTCCAGACCACAGAGTGGAGCGCCTGTTCTAAGACCTGTGGGATG GGCATCTCCACCCGGGTTACCAATGACAA TACCTTCTGCAGGCTGGAGAAGCAGAGTC GTCTCTGCATGGTCAGGCCCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAAACATTAAGGTAAATAA ATACTCTGCCCCCAGACACTCA TTTTCACAGAA TGACAGGAAAGAGAACCAGAGCTGG CTGTCTCGCCGCCCTTCTTATTA TAGGCCTGTTGTCTCCAGAAATA TCTAACCATGGAGC TGTCTGGCTAGAATGAGAGA TGCTGTAACAGCAGCTGCCAGTTTTCCACTACAAAATTC CCCGGGGTGTTAGTTAA TACGAGACACTCCAAACGAAGCCA TGGCTATTTTTGGAAAA CTGGCGAATGAAACTCCCAGTCTCTCTCCCCTCAGAATATAAACACAAGTCAGATGAC ATAGGGCTAGTCTACAGAGGGTTGAGGAAGGCCACTCCCGTTGTAGTAATTGCGGTGT CTCTTCTCGTCTTCCCTTAGAAGGGCAAAAAGTGCATCCGGACGCCTAAAATTGCCAA GCCTGTCAAGTTTGAGCTTTCTGGCTGCACCAGTGTGAAGACCTACCGGGCTAAGTTC TGTGGGGTGTGCACGGACGGCCGCTGCTGCACACCGCACAGAACCACCACACTGCCG GTGGAGTTCAAGTGCCCCGATGGCGAGATCATGAAAAAGAACATGATGTTCATCAAGA CCTGTGCCTGCCA TTACAACTGTCCCGGGGACAATGACA TCTTTGAGTCCTTGTACTAC AGGAAGATGTATGGAGACA TGGCGTAAAGCCAGGGAGTAAGGGACACGAACTCA TTT AGACTATAACTTGAACTGAGTTACA TCTCA TTTTCTTCTGTAAAAAAACAAAAAGGATT ACAGTAGCACATTAATTTAAATCTGGGTTCCTAACTGCTGTGGGAGAAAACACCCCAC CGAAGTGAGAACCGTGTGTCA TTGTCATGCAAATAGCCTGTCAATCTCAGACACTGGT TTCGAGACAGTTTAGACTTGACAGTTGTTCACTAGCGCACAGTGACAGAACGCACACT AAGGTGAGCCTCCTGGAAGAGTGGAGA TGCCAGGAGAAAGACAGGTACTAGCTGAGG TCATTTTAAAAGCAGCGATATGCCTACTTTTTGGAGTGTGACAGGGGAGGGACATTATA GCTTGCTTGCAGACAGACCTGCTCTAGCAAGAGCTGGGTGTGTGTCCTCCACTCGGTG AGGCTGAAGCCAGCTATTCTTTCAGTAAGAACAGCAGTTTCAGCGCTGACA TTCTGATT CCAGTGACACTGGTCGGGAGTCAGAACCTTGTCTATTAGACTGGACAGCTTGTGGCAA

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流式：数据的显示和分析

2．1．3 数据的显示和分析数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。

除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。

数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。

Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

一、原理

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。