左旋组氨酸对匹罗卡品致痫大鼠海马_省略_表达和神经细胞凋亡影响的实验研究_翟煌
实验研究
文章编号:１００６－６２３３(２０１６)０１－０００１－０４
左旋组氨酸对匹罗卡品致痫大鼠海马区神经肽Ｙ表达
和神经细胞凋亡影响的实验研究
?
翟一煜１?一霍小林２?一王永利３?
?
(１.天津医科大学基础医学院生理学与病理生理学系?一天津一３０００７０２.中
国
科
学
院
电
工
研
究
所?一北京一１０００００
３.天津医科大学总医院神经外科?一天津一３０００７０)
摘一要:目的:实验研究左旋组氨酸对匹罗卡品致痫大鼠海马区神经肽Ｙ表达和神经细胞凋亡
影响?方法:统计分析６０只Ⅱ级健康纯系雄性ＳＤ大鼠的相关资料?结果:研究组和对照组大鼠建模成功率７８.３％(１８/２３)二７７.３％(１７/２２)之间的差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)?研究组大鼠的潜伏期显著长于对照组(Ｐ<０.０５)?痫波频率低于对照组(Ｐ<０.０５)?大发作次数少于对照组(Ｐ<０.０５)?成功建模动物模型后１ｄ二２ｄ二３ｄＣＡ１区二ＣＡ３区二齿状回神经肽Ｙ阳性细胞计数均低于对照组(Ｐ<０.０５)?凋亡染色阳性细胞计数均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?结论:左旋组氨酸能够有效降低匹罗卡品致痫大鼠海马区神经肽Ｙ表达和神经细胞凋亡数值?具有抗痫作用?
关键词:一左旋组氨酸?一匹罗卡品致痫大鼠?一海马区神经肽Ｙ表达?一神经细胞凋亡
文献标识码:一Ａ一一一一一一一一一一一一一ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６－６２３３.２０１６.０１.００１
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｆＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆＬ－ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｉｎＹＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｔｈｅＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓａｎｄＮｅｕｒｏｎａｌＡｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｏｆＰｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄＳｅｉｚｕｒｅｓＲａｔｓ
ＺＨＡＩＹｕ?一ＨＵＯＸｉａｏｌｉｎ?一
ＷＡＮＧＹｏｎｇｌｉ
(ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＦａｃｕｌｔｙ?
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０?Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ:ＴｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆＬ－ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｏｎＹｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｉｎｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｉｚｕｒｅｓｒａｔｓ.Ｍｅｔｈｏｄ:Ｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ６０ｃａｓｅｓｏｆＣｌａｓｓＩＩｈｅａｌｔｈｙｐｕｒｅｍａｌｅＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙａｎａｌｙｚｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔ:Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｃｅｏｆｍｏｄｅｌｉｎｇｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｔｕｄｙｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ(Ｐ>０.０５)?Ｔｈｅｌａｔｅｎｃｙｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５)?ｅｐｉｌｅｐｓｙｗａｖｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ(Ｐ<０.０５)?ｔｈｅｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｔｔａｃｋｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ(Ｐ<０.０５)?ｔｈｅｍｏｄｅｌｅｄａｆｔｅｒｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｏｆ１ｄ?２ｄ?３ｄＣＡ１ａｒｅａ?ＣＡ３ｒｅｇｉｏｎ?ｔｏｏｔｈＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ－ｓｈａｐｅｄｂａｃｋｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｃｏｕｎｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ(Ｐ<０.０５)?ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｓｔａｉｎｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌ
ｃｏｕｎｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ:Ｌ－ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｃａｎｅｆ￣
１ 一一第２２卷一第１期２０１６年１月一一一一一一一一一一一一河一北一医一学ＨＥＢＥＩＭＥＤＩＣＩＮＥ一一一一一一一一一一一一一一Ｖｏｌ.２２?Ｎｏ.１Ｊａｎ.?２０１６
一一一一
?
??基金项目:国家自然科学基金?(编号:５０３０７０１３)通讯作者
网络出版时间：2016-03-02 10:07:29
网络出版地址：https://www.360docs.net/doc/b212362488.html,/kcms/detail/13.1199.R.20160302.1007.002.html
ｆｅｃｔｉｖｅｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅＬ－ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｉｎＹｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｖａｌ￣ｕｅｏｆｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｉｚｕｒｅｓｒａｔｓ?ｉｔｈａｓａｎｔｉ－ｅｐｉｌｅｐｔｉｃｅｆｆｅｃｔ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:一Ｌ－ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ?一Ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｉｚｕｒｅｓｒａｔｓ?一Ｙｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ?一Ｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ
一一为临床有效治疗癫痫提供科学依据?本研究对６０只Ⅱ级健康纯系雄性ＳＤ大鼠的相关资料进行了统计分析?实验研究了左旋组氨酸对匹罗卡品致痫大鼠海马区神经肽Ｙ表达和神经细胞凋亡影响?现报道如下?
１一材料与方法
１.１一实验动物及分组:购买北京军事医学科学院实验动物中心提供的６０只Ⅱ级健康纯系雄性ＳＤ大鼠?体重２４０~２６０ｇ?平均体重为(２５０?１０)ｇ?所有大鼠均接受常规饲养二自由进食等?随机将这些大鼠分为研究组(ｎ＝３０)和对照组(ｎ＝３０)两组?给予研究组匹罗卡品联合左旋组氨酸治疗?给予对照组单纯匹罗卡品治疗?给予两组腹腔注射３５０ｍｇ/ｋｇ体重剂量匹罗卡品?以对颞叶癫痫模型进行诱导?依据Ｒａｃｉｎｅ标准中动物行为特征分癫痫为５个级别?如果大鼠嘴部和面部运动具有节律性?代表为咀嚼二头部阵挛?则评定为Ⅰ级?如果大鼠点头?则评定为Ⅱ级?如果大鼠前肢出现阵挛现象?则评定为Ⅲ级?如果大鼠身体出现上举现象?则评定为Ⅳ级?如果大鼠身体出现上举伴跌倒现象?则评定为Ⅴ级?癫痫模型成功诱导标准为Ⅲ级以上?将没有达到标准的大鼠剔除?另行补充?
１.２一方一法
１.２.１一药品和试剂:购买Ｓｉｇｍａ公司生产的左旋组氨酸(Ｌ－Ｈｉｓ)二匹罗卡品(ＰＬＯ)等?购买广州市鸿洲实验器材有限公司生产的磷酸盐缓冲液?购买德国宝灵曼公司生产的原位细胞凋亡检测试剂盒?购买天津市化学试剂厂生产的水合氯醛(ＡＧＡＣ)及分析纯?
１.２.２一皮质脑电图检测:给予大鼠模型腹腔注射３００ｍｇ/ｋｇ水合氯醛进行麻醉?将脑电记录电极安置其中?固定后将骨孔从大鼠颅骨双侧额叶皮质二顶叶皮质相应部位打开?骨孔直径为１ｍｍ?将银二氯化银球形记录电极分别插入?在大鼠前卤后２ｍｍ安置参考电极?术后进行５ｄ的休养?然后开始皮质脑电图检测?将记录装置连接起来?对脑电路记录的正确可靠情况进行认真检查?给予对照组大鼠腹腔注射３５０ｍｇ/ｋｇ匹罗卡品建模?然后对其２ｈ皮质脑电图进行连续记录?给予干预组大鼠腹腔注射３００ｍｇ/ｋｇ左旋组氨酸?１ｈ后给予其腹腔注射２５０ｍｇ/ｋｇ匹罗卡品建模?将２ｈ内皮质脑电图变化数据连续记录[１]?１.２.３一皮质脑电图分析指标:腹腔注射匹罗卡品到痫波首次出现的时间段为潜伏期?为时程为１ｍｉｎ的脑电图中尖波/棘波数值计数?每隔１２ｍｉｎ１次?２ｈ共将采集１０个数值?每分钟痫波频率即为该组数据平均数?大发作标准为连续痫波时间在１０ｓ以上?将数据详细记录?将每组数据平均值及标准差计算出来[２]?
１.２.４一神经肽Ｙ检测:应用链霉卵白素－过氧化物酶(Ｈｉｓｔｏｎｔａｉｎ－ＳＰ)试剂盒?运用第二代ＬＡＢ－ＳＡ技术检测神经肽Ｙ?运用亲和纯化的二抗和Ｈｉｓｔｏｎｔａｉｎ－ＳＰ轭合物对已经在组织细胞抗原上结合的一抗进行检测?通过酶催化底物对所形成的抗原/抗体/酶复合物进行反映?从而将抗原的位置及分布确定下来[３~５]?１.２.５一病理组织取材方法:成功建模动物模型后１ｄ二２ｄ二３ｄ将每组１０只建模大鼠分别抽取出来?给予其腹腔注射３５０ｍｇ/ｋｇ水合氯醛试液进行麻醉?开胸在４?的环境下行升主动脉灌流２５０ｍＬ４％多聚甲醛＋２５０ｍＬ生理盐水?取出脑?将其固定在４％多聚甲醛溶液中?将海马取出来?将最大剖面冠状切开?将厚度为６μｍ的石蜡切片制备出来?进行细胞凋亡染色?染色过程中严格依据凋亡检测试剂盒设计程序进行[６]?
１.２.６一凋亡染色分析:凋亡细胞的细胞核在凋亡染色后的颜色为棕色或棕褐色?光学显微镜下对ＣＡ１区二ＣＡ３区二齿状回进行观察?高倍视野(１０?２０)下将６个区域从１３０μｍ?１３０μｍ网格中随机选取出来?区域面积为０.０１６９ｍ２?计数神经肽Ｙ阳性细胞数及染色凋亡的阳性细胞?对颗粒细胞层ＮＰＹ阳性反应密度比值进行检测?检测过程中用图像分析系统?将每组数据平均值及标准差值计算出来?
１.３一统计学分析:用软件ＳＰＳＳ２０.０对数据进行统计分析?用( ｘ?ｓ)表示实验数据?单因素用方差分析(Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ)?检验水准α＝０.０５?
２一结一果
２.１一两组大鼠建模成功情况比较:研究组和对照组大鼠建模成功率７８.３％(１８/２３)二７７.３％(１７/２２)之间的差异不显著(Ｐ>０.０５)?具体见表１?
２.２一两组潜伏期二痫波频率及大发作次数比较:研究组大鼠的潜伏期显著长于对照组(Ｐ<０.０５)?痫波频率显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?大发作次数显著少于对照组(Ｐ<０.０５)?具体见表２?
２ 一一第２２卷一第１期
２０１６年１月一一一一一一一一一一一一
河一北一医一学
ＨＥＢＥＩＭＥＤＩＣＩＮＥ一一一一一一一一一一一一一一
Ｖｏｌ.２２?Ｎｏ.１
Ｊａｎ.?２０１６一一一一
表１一两组大鼠建模成功情况比较ｎ(％)组别只数建模建模成功剔除研究组３０２３１８(７８.３)５(２１.７)对照组３０２２１７(７７.３)５(２２.７)一一注:与对照组比较??Ｐ<０.０５
２.３一两组大鼠各时间点海马各区神经肽Ｙ阳性细胞计数变化情况比较:研究组大鼠成功建模动物模型后１ｄ二２ｄ二３ｄＣＡ１区二ＣＡ３区二齿状回神经肽Ｙ阳性细胞计数均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?具体见表３?
表２一两组潜伏期二痫波频率及大发作次数比较( ｘ?ｓ)
组别只数
潜伏期
(ｓ)
痫波频率
(/ｍｉｎ)
大发作次数
(次)
研究组３０４７５?１１２.５?１３６.７?２４.６?２１.８?３.５６?对照组３０１１７.６?３７.１３３８６.６８?６０.３８９４.２?２３.２一一注:与对照组比较??Ｐ<０.０５
表３一两组大鼠各时间点海马各区神经肽Ｙ阳性细胞计数变化情况比较(个? ｘ?ｓ)
组别只数时间只数ＣＡ１区ＣＡ３区齿状回
研究组３０１ｄ１０２４.３０?３.３５?３１.４０?２.１３?１９.１０?１.７９?
２ｄ１０２５.２０?１.１４?３４.５０?５.５２?２０.４０?０.８４?
３ｄ１０２５.６０?３.０５?３２.６０?１.９５?１９.８０?２.１７?对照组３０１ｄ１０３７.６０?４.９８４９.２０?１０.３８３１.２０?３.８３
２ｄ１０５５.２０?４.０９６４.６０?１１.１０３１.６０?１.１４
３ｄ１０６０.００?１.００８０.６７?８.３９２９.３３?１.５３
一一注:与对照组比较??Ｐ<０.０５
２.４一两组大鼠各时间点海马各区凋亡染色阳性细胞计数变化情况比较:研究组大鼠成功建模动物模型后１ｄ二２ｄ二３ｄＣＡ１区二ＣＡ３区二齿状回凋亡染色阳性细胞计数均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?见表４?
表４一两组大鼠各时间点海马各区凋亡染色阳性细胞计数变化情况比较(个? ｘ?ｓ)
组别只数时间只数ＣＡ１区ＣＡ３区齿状回
研究组３０１ｄ１０２３.３０?６.８３?２４.５６?５.４１?２１.８３?４.０５?
２ｄ１０１９.４６?４.９３?２１.６６?７.４３?１７.３７?４.９５?
３ｄ１０１５.７４?６.９２?２０.１３?５.２０?１６.４７?５.５７?对照组３０１ｄ１０４４.２?１.３０４７.４?２.３０３３.４?２.０７
２ｄ１０３６.８?０.８４２８.２?３.４２２９.６?１.１４
３ｄ１０４０.５?２.１２３７?７.０７３２?１.４１
一一注:与对照组比较??Ｐ<０.０５
３一讨一论
本研究结果表明?研究组和对照组大鼠建模成功率７８.３％(１８/２３)二７７.３％(１７/２２)之间的差异不显著(Ｐ>０.０５)?研究组大鼠的潜伏期显著长于对照组(Ｐ<０.０５)?痫波频率显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?大发作次数显著少于对照组(Ｐ<０.０５)?成功建模动物模型后１ｄ二２ｄ二３ｄＣＡ１区二ＣＡ３区二齿状回神经肽Ｙ阳性细胞计数均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?凋亡染色阳性细胞计数均显著低于对照组(Ｐ<０.０５)?充分说明了左旋组氨酸能够有效降低匹罗卡品致痫大鼠海马区神经肽Ｙ表达和神经细胞凋亡数值?同时显著延长大鼠的潜伏期?降低大鼠的痫波频率?减少大鼠的大发作次数?具
３
一一第２２卷一第１期
２０１６年１月一一一一一一一一一一一一河一北一医一学
ＨＥＢＥＩＭＥＤＩＣＩＮＥ一一一一一一一一一一一一一一
Ｖｏｌ.２２?Ｎｏ.１
Ｊａｎ.?２０１６一一一一
有抗痫作用?值得临床推广?
参考文献:
[１]一葛宇星.ＣｌＣ－２对慢性颞叶癫痫大鼠海马ＣＡ１区α５亚基－ＧＡＢＡ＿ＡＲ介导紧张性抑制的影响[Ｄ].复旦大学?２０１２.
[２]一程蕊.ＮＡＰ对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用
[Ｄ].山东大学?２０１２.
[３]一张帆.重组腺相关病毒神经肽Ｙ基因转染对海人酸致痫
大鼠海马突触重建的影响及其机制研究[Ｄ].河北医科大学?２０１３.
[４]一董长征.重组腺相关病毒神经肽Ｙ基因转染对红藻氨酸
致痫大鼠癫痫发作的影响及其机制探讨[Ｄ].河北医科大学?２０１３.
[５]一孟春想.柴胡皂苷ａ对难治性癫痫大鼠痫性发作及Ｐ－ＧＰ
表达的影响[Ｄ].南方医科大学?２０１２.
[６]一黄彦思?林云宾?冯婉萍?等.癫痫儿童智能和适应能力分
析及抗癫痫药物治疗的影响[Ｊ].河北医学?２０１５?２０(８):１３９０~１３９４.
文章编号:１００６－６２３３(２０１６)０１－０００４－０４
高发区贲门癌ＫＡＩ１/ＣＤ８２的表达及意义
?
刘淑慧１?一周宋霞１?一谢澳斯２?一黄燕鹏２?一陈广灿２?
?
(１.汕头大学医学院病理教研室?一广东一汕头一５１５０４１
２.汕头大学医学院第一附属医院胃肠外科?一广东一汕头一５１５０４１)
摘一要:目的:探讨ＫＡＩ１/ＣＤ８２蛋白在贲门癌组织中的表达及其与贲门癌临床病理特征的关
系?方法:应用免疫组织化学法检测４６例贲门癌组织和相应标本的４６例非肿瘤性粘膜组织ＫＡＩ１/ＣＤ８２蛋白的表达?结果:ＫＡＩ１/ＣＤ８２蛋白在癌组织中表达较非肿瘤性粘膜明显增强(Ｐ<０.０５)?ＫＡＩ１/ＣＤ８２蛋白表达与贲门癌患者的年龄显著性相关(Ｐ<０.０５)?与其它临床病理特征没有显著性关系(Ｐ>０.０５)?结论:ＫＡＩ１/ＣＤ８２蛋白的表达可能参与了贲门癌的发生发展?检测ＫＡＩ１/ＣＤ８２表达有助于进一步了解贲门癌发生发展的机制?
关键词:一贲门癌?一免疫组织化学法?一非肿瘤性粘膜
文献标识码:一Ａ一一一一一一一一一一一一一ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６－６２３３.２０１６.０１.００２
ＣｌｉｎｉｃａｌＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＫＡＩ１/ＣＤ８２ｉｎＧａｓｔｒｉｃＣａｒｄｉａＣａｎｃｅｒ
ＬＩＵＳｈｕｈｕｉ?一ＺＨＯＵＳｏｎｇｘｉａ?一ｅｔａｌ
(ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｈａｎｔｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?ＧｕａｎｇｄｏｎｇＳｈａｎｔｏｕ５１５０４１?Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ:ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＡＩ１/ＣＤ８２ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｄｉａｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅａｎｄ
ｉｔｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｃｌｉｎｉｃａｌｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒ.Ｍｅｔｈｏｄ:ＫＡＩ１/ＣＤ８２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ４６ｃａｓｅｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｒｄｉａｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｎｏｎ－ｔｕｍｏｒｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｓｂｙｔｈｅｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ.Ｒｅｓｕｌｔ:ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＫＡＩ１/ＣＤ８２ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｄｉａｃａｎｃｅｒｔｉｓ￣ｓｕｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｎ－ｔｕｍｏｒｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｓ(Ｐ<０.０５).ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＡＩ１/ＣＤ８２ｈａｄｎｏｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｇｒａｄｅ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＡＩ１/ＣＤ８２ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｉｅｎｔａｇｅ(Ｐ<０.０５)ａｎｄｈａｄｎｏｒｅｌａ￣ｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｏｔｈｅｒｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ:ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＡＩ１/ＣＤ８２ｍａｙｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｒｄｉａｃａｎｃｅｒ.ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＫＡＩ１/ＣＤ８２ｗｉｌｌｈｅｌｐｔｏｌｅａｒｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇａｓｔｒｉｃ
ｃａｒｄｉａｃａｎｃｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.
４ 一一
第２２卷一第１期２０１６年１月
一一一一一一一一一一一一
河一北一医一学
ＨＥＢＥＩＭＥＤＩＣＩＮＥ
一一一一一一一一一一一一一一
Ｖｏｌ.２２?Ｎｏ.１Ｊａｎ.?２０１６
一一一一
?
?
?基金项目:广东省医学科研基金项目资助?(编号:Ｂ２０１５１１)通讯作者
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。
海马神经干细胞激活疗法简介
海马神经干细胞激活疗法简介世界卫生组织最新的一份统计调查报告显示，全世界86%的患有心理障碍、精神障碍疾病的患者久治不愈，其首要原因就是他们在接受治疗的初期就没能得到迅速精准的诊断，在这种病因不明、病理不合、病灶不准的情况下，该患者所接受的一切个性化诊疗都缺乏了严谨科学的准绳，以至于治疗的方向南辕北辙，治疗的最佳时机不断延误，治疗的成果微乎其微，患者们非但病情得不到有效缓解，而且还要饱经痛苦，高频率的遭受病情的恶化和反复! 国际脑组织权威机构研究发现：人体大脑海马区的功能性休眠、损伤、病患以及萎缩，都能导致各类心理障碍、精神障碍疾病的产生!而不同程度、不同位置的人体大脑海马区的病患，所诱发的疾病种类也各不相同!因此，如果能够成功精确的检测出人体大脑海马区的健康状态，并且有针对性对其进行康复性治疗，那么各种心理障碍、精神障碍类的疾病就毋庸置疑的拥有了彻底痊愈、不再反复的条件!而辽宁省精神卫生防治基地的“海马神经干细胞激活疗法”正是在这样一种需求背景下应运而生。 辽宁省精神卫生防治基地介绍该疗法体系传承自国医精华，结合现代西方医学尖端科技，利用国际先进的诊疗仪器产生电流，通过激活大脑海马区萎缩的神经干细胞产生神经递质受体，并利用中、西药的神经递质受体酶激活神经递质受体，通过药物
平衡患者体内分泌紊乱的神经递质，自神经类疾病的源头疏理，纠正脑细胞的功能元，营养大脑长期处于休眠状态的脑细胞，改善其活性，提高其自身代谢力，最终实现脑细胞的正常兴奋态，使患者的神经干细胞在平衡的神经递质环境中恢复到正常，达到彻底痊愈。 随着我国经济的高速发展和社会压力的加剧，精神疾病状况也愈发严峻。根据最新精神疾病流行病学调查，我国精神疾病总患病率高达15%，世界卫生组织(WHO)保守估计，我国各类精神疾病患者已达一亿人以上，精神病在我国疾病总负担中排名首位，约占中国疾病总负担的20%。在各类精神疾病中，抑郁症患者约有3000万。研究精神疾病、寻找战胜精神疾病的方法是全世界医学界的共同目标。 “海马神经干细胞激活疗法”是从中医学、基因学、病理学、心理学等众多学科角度科学诠释了精神疾病的发病机理以及针 对性的治疗措施，能够有效的从源头上根治精神疾病，是广大心理障碍、精神障碍疾病患者的首选技术，它的疗效值得肯定，它的出现使各种失眠、抑郁、神经衰弱、精神障碍等精神类疾病，真正实现了彻底痊愈、不再反复。
大鼠 海马 电生理学杂记
神经系统由大量的神经元构成。这些神经元之间在结构上并没有原生质相连，仅互相接触， 其接触的部位称为突触 细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。 树突棘是树突表面的棘状突起，也就是形成突触的部位 一般认为，NMDA受体主要分布在神经细胞的突触后膜。在兴奋性神经元，NMDA受体主要 分布在树突棘头的突触后膜，且主要分布在突触后致密区（postsynaptic density, PSD） 突触可塑性：突触在形态和传递效能上的改变 突触后致密区（PSD）：在电镜下所见的突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的物质，见 于cns中所有树突棘突触的突触后膜上。主要功能是细胞粘附性的调节，受体集聚的控制和 受体功能的调节。 旷场试验：用来观察小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为 反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反应其紧张度。 开场实验，open field test，这个测的是5min内，动物在一个开阔环境中的行为学变化，我 们用一个强光打在开场中央，开场有方形和圆形两种。圆形是一个大缸，白色的，具体尺寸 我忘记了。需要用的指标是：跨格数、站立数、排便数和梳理数（也就是理毛次数），前两 个指标为主。这个实验可以用中央场次数作为焦虑样行为的观察指标。 运动能力(locomotion， open field test 主要是评价动物的焦虑状态，它主要以动物进入中央区的时间百分率来评价焦虑状态，它也可以度等。 物在一个开放的新的地方会很小心，rodent动物喜暗而避明的特性会让自己躲在暗处，也会 对开阔地方有探索行为（好奇心），同时又有害怕紧张担心和焦虑心理，具有一定的新奇性 同时又具有一定的害怕。如果动物焦虑少，停留在中间等位置时间长久一些，不然反之。比 较这些特性可以比较动物的焦虑程度。具有抗焦虑作用的药物会让动物有更多的对开阔地方 有探索行为，焦虑紧张的动物更喜欢停留在开场的边缘和暗处。 LTP定义：给突触前纤维一个短暂的高频刺激后，突触传递效率和强度增加几倍且能持续数 小时至几天保持这种增强的现象。按LTP的时程分①PTP，强直后增强，一般5分钟后衰减； ②STP，短时程增强，持续半小时左右；③，LTP长时程增强，持续一小时以上 CaMKII这个蛋白是个很特殊的蛋白，在脑内含量非常高，大约占总蛋白量的1-2%。在突触 部位的含量很高，并且是PSD（postsynaptic density）主要蛋白。但这个蛋白最特殊之处是 其具有自身调节能力，仿佛自己本身就是一个具有学习记忆的功能。 因为把随着神经等器官、组织的兴奋所产生的动作电位作为其活动指标是最容易记录的现 象，所以常常用记录动作电位来深入研究神经系统等的机能。 高频刺激可引发突触后细胞的持久增强反应——最初被称为“持久增强作用”（
胎鼠海马神经元培养及其鉴定
［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大
神经元细胞培养
神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1
乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备
-94- Clinical Journal of Chinese Medicine 2011 V ol.(3) No.19 家尤昭玲[3]治疗先兆流产时亦主张补肾健脾宁心，宁心之品多选用苎麻根、莲子心。苎麻根甘咸入心，能布散其光明，而不为郁热，此安胎良药也。莲子心味甘涩，性平，入心、脾、肾经，具有补脾益肾、养心安神的功效，还能收敛浮躁的心火，让人宁静且容易入睡。正如《女科集略》云：“受妊之后，宜令镇静，则血气安和。”又如《竹林寺女科秘要》所云：“胎气宜清不宜热，宜静不宜动。” 先贤所论安胎诸法，悉从其亲身实践总结而来，然如景岳所说：“胎气不安，证本非一，治亦不同。……去其所病，便是安胎之法。”同时又指出：“安胎之方不可执，当随证、随经、因其病而药之，乃为至善。”参考文献： [1]盛爱华,黄爱武.健脾补肾法配合黄体酮治疗先兆流产80例[J].浙江中医杂志,2007,42( 11):644 [2]夏桂成.中医妇科理论与实践[M].北京:人民卫生出版社,2003:308-312 [3]付灵梅,尤昭玲,陈宗光.补肾健脾宁心方治疗脾肾亏虚型先兆流产30 例中国实验方剂学杂志[J].2011,17(2):232~234 作者简介： 冯光荣（1979-），女，河南郑州人，郑州市妇幼保健院副主任中医师，博士，主要研究方向不孕症的治疗。 编号：EA-11071239（修回：2011-10-11） 乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备 Hippocampus neurons primary cultured and the AD cell model established 姜海英杨进刘涛 （南京中医药大学基础医学院，江苏南京，210029） 中图分类号：R574.62文献标识码：A 文章编号：1674-7860（2011）19-0094-02 【摘要】采用乳鼠海马做神经元细胞的原代培养和鉴定，并利用Аβ25-3损伤处理细胞，制备ＡＤ损伤细胞模型，为后继研究中药脑脊液和血清对神经元保护试验的奠定前期基础。 【关键词】乳鼠海马；神经元细胞；AD损伤模型； 【Abstract】Using the hippocampus neurons of the new born mice within 2～3 days to do the primary cell culture and do the appraisal . Using Аβ25-35 (aging treateded , final concentration 5μmol/L) on primary cultured hippocampus neurons to establish the AD cell model in order to study the protection of chinese medicine。 【Keywords】Rat hippocampus; Neurons cell; The AD cell model 通常做海马神经元原带培养，采用胎鼠细胞是最佳来源，但代价比较昂贵，取材比较繁琐困难。大鼠繁殖周期比较短，实验中，我们采取1～2天的乳鼠来培养，这样既保存了母鼠，还可以扩大海马组织来源，同时较胎鼠而言，乳鼠体积较大，可采取断颈处死的方法，取海马、剥离筋膜组织容易操作。 1 实验材料和仪器 Aβ25-35，B27、neurons培养基、胰蛋白酶（Sigama），12%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司），NSE试剂盒、SW-CJ-2FD型超净工作台、CO2细胞培养箱、倒置相差显微镜。 2 细胞培养和鉴定 2.1 细胞培养 收获乳鼠后，置于75%的酒精中清洗，去除身上的垫料杂质，注意避免乳鼠呛到酒精。用酒精棉球反复擦拭后，至于灭菌的脱脂棉中，于无菌操作台中备用。同时注意保温，避免乳鼠产生过多的应激反应。 酒精棉球反复擦洗，无菌操作台断颈处死乳鼠。揭开脑壳，剥离脑膜，露出完整的脑组织。这对于完整分离海马很关键，海马的形状很容易分辨，取出海马组织，至于冷生理盐水中。全部材料取出后，在生理盐水中，小心用灭菌的吸管和镊子分离海马无关组织。反复沉淀清洗，仔细去除血管、筋膜及非海马结构（取材干净非常关键）。多次沉淀清洗的过程中，可以将渗入的血细胞和其他杂质细胞去除掉。然后置于0.125%的胰酶中消化，用弯头吸管边消化边吹打，吹打动作要轻柔。夏天可以在室外操作，消化时间大约20～30min（冬季至于37℃培养箱内消化25min）。由于脑组织细胞结构疏松，很容易将组织细胞吹散。在此过程中，用吸管将悬浮的筋膜组织去除干净，加入含血清的全培养液终止消化。 200目的尼龙筛，剪成3～5m2见方的正方形，在高温灭菌前，折叠成漏斗状，置于5ml或10ml离心管中。每只试管中可以放置多个。尼龙膜在高温灭菌的过程中，形状被固定，在过滤的过程中，由于组织粘附滤膜，会堵塞网口，导致过滤失败。该方法操作简单，有粘附组织存在时，用单陪冲洗，关键可以随时更换，经济实用。用三层尼龙网过滤时，既可以有效去除细胞和组织团块，避免其对细胞贴壁的影响，同时可以有效地降低污染。 将细胞用尼龙网滤过之后，1000转/min离心10min，用含10%血清的高糖DMEM全陪吹散细胞。计数细胞密度，接种密度在2×106。经验值为5～6只乳鼠可以接种一块6孔板。在细胞接种前，6孔板中置放涂布10%无菌多氨酸的盖玻片，紫外照射。 因为不贴壁的细胞数量较多，因而细胞至于培养箱中后，
电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究进展
电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的 研究进展 （作者： _________单位：____________ 邮编：___________ ） 【摘要】目前，电针对脑缺血模型大鼠海马细胞影响的研究报道很多，对海马与学习记忆关系的研究已成为国内研究的重 点。本文就电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作简要综述。 【关键词】电针海马物质 海马的生理功能目前仍在探讨之中.大量的动物模型研究表明，海马与学习记忆有关。当脑缺血等致海马受损时，可引起学习记忆功能的严重障碍。电针刺特定穴位可影响脑功能障碍大鼠海马物质的表达。现就目前电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作一综述。 1电针对海马细胞凋亡相关蛋白表达的影响 1.1 Bel ]2是功能最为明确的细胞凋亡拮抗基因Bcl[2蛋白基本生物学功能为延长细胞的生命期限、增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性。Bax与Bcl]2作用相反，能够促进凋亡，Bcl〕2表达水平较高时，形成Bcl[2/Bcl[2同源二聚体，抑制细胞凋亡；Bax表达水平较高时，形成
Bax/Bax同源二聚体，加速细胞凋亡；BcL2和Bax水平相当 时，则形成Bcl[2/Bax异源二聚体，终止细胞凋亡。近年的研究提示 Bcl[2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，还与 Bax/Bcl_2比率有关，当比率增大时，细胞趋于凋亡[1 ]o caspase ]3 激活是触发凋亡的关键（有“分子开关”之称是凋亡的最终执行蛋白。Bcl]2家族基因在调节线粒体通透性上发挥重要作用，Bcl]2或其他 抗凋亡Bcl_2家族成员下调，或促凋亡Bcl_2家族成员如Bax在线粒体膜上过度表达和移位，均导致线粒体通透性增加，使细胞色素C 从线粒体释放入胞浆，与Apaf”、dADP形成复合体，再与胞浆中的caspase ]9前体形成凋亡小体，导致caspase[9被裂解激活，随后再裂解caspase家族其他成员包括caspase[3,引发凋亡。赵建新等[2] 报告电针刺激脑缺血小鼠“肾俞”膈腧”百会；各观察时点均可上调小鼠海马细胞Bcl[2表达，下调Bax表达，降低凋亡率。故电针可起到抑制凋亡、保护神经元的作用电针可显著上调内源性海马Bcl[2表达，降低Bax表达，有可能进一步抑制caspase [3的激活，或影响神经生长因子、过氧化物歧化酶、CHAT等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用，有待今后动物实验验证。Noxa为BH3only 亚家族成员]3]，脑缺血研究发现，Noxa在脑缺血引起的细胞凋亡中起重要作用[4 ]。朱燕珍等]5]报告，电针刺激血管性痴呆模型大鼠“大椎百会：海马CA1区的Noxa阳性细胞数增加，Caspase ]3 阳性细胞数增加，提示Noxa调节的线粒体凋亡途径促进血管性痴呆的发展；电针治疗抑制
应激对成年海马神经发生的影响
应激对成年海马神经发生的影响【关键词】神经 近年来越来越多的研究表明成年中枢神经系统（CNS）的神经干细胞能不断地增殖分裂产生新的神经元，即在成年CNS仍存在神经发生（neurogenesis）。侧脑室的室管膜下区和海马齿状回的颗粒细胞下层是脑中两个主要的神经发生的区域。海马齿状回部位终生保持了生成新神经元的能力，在正常成年动物，每天有数以千计的新神经元形成。神经发生受到包括应激在内的多种因素的影响，这些区域的新生神经元会迁移，侧脑室的室管膜下区，大概在28d后几乎都迁移到嗅球，而海马齿状回的颗粒细胞下层的新生细胞部分迁移到颗粒细胞层，分化为颗粒细胞，产生树突、轴突，形成突触联系，整合到海马功能的神经环路中，参与海马的学习记忆等功能活动。我们结合近年来研究进展就应激对成年海马神经发生的影响作一综述。 1 海马区的神经发生 从结构上讲, 海马可分为海马回和齿状回(dentategyrus, DG) 两个部分。前者包括CA1、CA2、CA3、CA4 四部分, 主要由一些锥体神经元组成；后者则基本由颗粒细胞构成。早在20世纪60年代，采用[3H]胸腺嘧啶核苷标记方法就发现在成年大鼠海马、大脑皮质以及嗅球存在着神经发生现象。但是由于没有有力的证据证明新产生的细胞是神经元而非胶质细胞，并且具有神经元的相关功能，神经发生这一说法备受争议，在随后的20年间神经发生这一现象似乎被遗忘了。直到90年代随着技术方法的改进，成年脑神经发生进一步得到证
实。大鼠、猴子以及人类的神经细胞均具有终身增殖的能力，其增殖主要位于两个重要的脑区：海马齿状回和室管膜下区。各种细胞类型的分子克隆和免疫识别的新进展也证明了在成年哺乳类脑内存在着神经发生。新神经元产生于哺乳类和人类脑的两个脑区，即室下区和齿状回的颗粒下区。齿状回内新产生的颗粒神经元对学习与记忆很重要。新神经元来源于前体细胞，在细胞培养和组织原位中也转化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞。 早期研究利用[3H]胸腺嘧啶核苷标记分化细胞，其在细胞周期的S期能掺入进复制的DNA中通过放射自显影检测出来。后来用人工合成的BrdU（5溴3脱氧尿嘧啶核苷）取代了[3H]胸腺嘧啶核苷，BrdU是胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，胸腺嘧啶的碱基嘧啶环与5位C原子连接的甲基被Br取代，当细胞处于DNA合成期而同时有BrdU 存在时，BrdU就掺入到新合成的DNA中，BrdU用免疫细胞化学方法就能检测。这种技术通过改变BrdU注射和动物处死之间的时间差可以对新生细胞的增殖、分化、存活进行定量分析。由于BrdU有潜在的毒性作用，后来人们又找到其它的标记物，如增殖细胞核抗原（PCNA，DNA 聚合酶的辅因子）和Ki67（反映肿瘤增殖的标记物）作为反映细胞增殖的良好指标[1]。 在海马的齿状回颗粒下区，神经前体细胞增殖分裂产生新的颗粒细胞，新产生的细胞在分化成熟期进入颗粒细胞层，其轴突越过海马裂与CA3区锥体神经元树突发生突触联系，整合到海马的基本突触回路中，参与海马的功能活动。有报道显示，在哺乳动物的其它脑区，
成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定
昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
阿尔茨海默病的脑神经元凋亡机制_杨小慧
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７，２７（４） ｍｉＲ－２８９与ＣａＭＫⅡ ｍＲＮＡ的ＣａＭＫⅡ ３＇非编码区的序列碱基配对，抑制了ＣａＭＫⅡ ｍＲＮＡ在运输过程中的表达。该抑制作用一直持续到在突触的神经刺激下ＲＩＳＣ组分在蛋白酶体作用下降解。ｍｉＲＮＡ还参与了树突棘发育过程的调控［１７］。一个特定的ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ－１３４，抑制了Ｌｉｍｋ１蛋白ｍＲＮＡ的表达；Ｌｉｍｋ蛋白可调控树突棘的发育，而ＦＭＲＰ的缺失导致树突棘形态异常，两者的关系目前未明。３． 问题与展望 一直以来，Ｘ脆性综合征的研究重点是了解ＦＭＲＰ的功能。在不同的发育时期、不同的细胞内位置，ＦＭＲＰ执行的功能是不同的。这主要由于与ＦＭＲＰ结合的蛋白质分子及ＲＮＡ分子的不同［６，１０］，其中包括非编码ＲＮＡ。这些非编码ＲＮＡ引起了越来越多研究者的重视，可以预计将有更多的与Ｘ脆性综合征及ＦＭＲＰ相关的非编码ＲＮＡ会被发现。非编码ＲＮＡ与ＦＭＲＰ相互作用机制的问题也有待解决，如ＲＭＲＰ与ｍｉＲＮＡ之间的关系，是ＦＭＲＰ利用ｍｉＲＮＡ作为指向靶ｍＲＮＡ的工具，还是ＦＭＲＰ作为ＲＩＳＣ的组分参与了ｍｉＲＮＡ的翻译抑制，抑或二者都有？另有研究表 明，非编码ＲＮＡ可调控蛋白质功能［２］，我们猜想是否存在能调控ＦＭＲＰ的非编码ＲＮＡ呢？这些问题的解决将加深我们对Ｘ脆性综合征发病机制的理解，进而找出基因治疗的方法。 参 考 文 献 ［１］Ｏ＇ｏｎｎｅｌｌ ＷＴ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２５： ３１５－３８［２］Ｃａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，２９： ７７－１０３［３］Ｈａｎｄａ Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００３，３１（２１）： ６２４３－６２４８［４］Ｖｅｒｄｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（３０）： ６７２－６７６［５］Ｊｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００４，６（１１）： １０４８－１０５３［６］Ｂａｇｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００５，６（５）： ３７６－３８７［７］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００３，１１２（３）： ３１７－３２７ ［８］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（３９）： ３３４０３－３３４１０［９］Ｇａｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００４，３２（８）： ２１２９－２１３７［１０］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２００６，１６： ２６５－２６９［１１］Ｗａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２２： １０２３２－１０２４１［１２］Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００４，１１６（２）： ２８１－２９７ ［１３］Ｃａｕｄｙ ＡＡ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００２，１６（１９）： ２４９１－２４９６［１４］Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００２，１６（１９）： ２４９７－２５０８［１５］Ｊｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，７（２）： １１３－１１７［１６］Ａｓｈｒａｆ ＳＩ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００６，１２４（１）： １９１－２０５［１７］Ｓｃｈｒａｔｔ ＧＭ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４３９（７０７４）： ２８３－２８９ 文章编号： １０００－１３３６（２００７）０４－０３０７－０３ 阿尔茨海默病的脑神经元凋亡机制 杨小慧 戴雪伶 姜招峰１ （ 首都师范大学生命科学学院，北京 １０００３７；１ 北京联合大学应用文理学院，北京 １０００８３ ） 摘要 ：阿尔茨海默病（ＡＤ）是一种中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为认知功能障碍、行为异常及日常生活能力下降，主要神经病理改变有神经元变性、丢失引起的脑萎缩，细胞外的老年斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ，ＳＰ）和细胞内的神经元纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅ，ＮＦＴ）。细胞凋亡与ＡＤ有密切的关系，β淀粉样蛋白（Ａβ）在此过程中可能有重要的作用。近年来的研究还指出，细胞周期的异常可能是ＡＤ发生的较早期事件，这种异常的细胞周期也可导致细胞的凋亡，最终引发ＡＤ。该文介绍细胞周期异常和Ａβ介导的细胞凋亡机制作一综述。 关键词：阿尔茨海默病；细胞周期；细胞凋亡；Ａβ；神经元中图分类号：Ｑ５１ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种中老年常见的中枢神经系统病变，有三大病理特征：淀粉样斑块沉积（ＳＰ）、神经元纤维缠结（ＮＦＴ）和神经元大量丢失。本文重点讨论可能引发神经元丢失的机制。神经细胞的凋亡在神经退行性疾病中起着主导性的作用。神经细胞是一种长期存活、不可复原和已停 收稿日期：２００７－０３－０２ 北京市教委科技发展重点项目和北京市自然科学基金重点项目（ＫＺ２００３１１４１７０１５） 作者简介 ：杨小慧（１９８３－），男，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｘｈ８３８１７＠１６３．ｃｏｍ；戴雪伶（１９８２－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｌｄａｉ２００４＠１２６．ｃｏｍ；姜招峰（１９５６－），男，博士，教授，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｆｅｎｇ＠ｂｕｕ．ｃｏｍ．ｃｎ
海马细胞培养与鉴定
3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打
↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。
人不同胎龄胎脑海马神经干细胞发育规律初探
文章编号:1000-5404(2004)22-2061-03论著人不同胎龄胎脑海马神经干细胞发育规律初探 尹晓娟,杜 江,封志纯 (第一军医大学附属珠江医院儿科,广州510282) 提 要:目的 探讨人不同胎龄胎脑海马部位神经干细胞的发育规律。方法 收集胎龄16～32周的水囊引产胎儿100例,采用免疫组织化学和光镜技术对人胎脑海马部位神经干细胞的分布、形态、存在方式以及数量进行检测。结果 不同胎龄胎脑海马均存在神经干细胞,神经干细胞位于海马多形细胞层、锥体细胞层、颗粒细胞层及分子层,以多形细胞层、锥体细胞层及颗粒细胞层多见。细胞呈圆形、椭圆形、三角形及星形,以圆形和椭圆形多见,未见明显突起。细胞胞浆丰富,核呈圆形及椭圆形,染色质疏松,2～6个核仁不等。多数单个散在分布于其它神经元间,可见对称分裂现象,但有的神经干细胞呈簇状及群状分布,各组神经干细胞随着胎龄的增加呈减少趋势。结论 人不同胎龄胎脑海马广泛存在神经干细胞,各胎龄神经干细胞在分布部位、形态、存在方式及数量上存在一定的差异,海马可能是神经干细胞新的生发区。 关键词:神经干细胞;神经巢蛋白;人脑;海马 中图法分类号:R321;R322.81;R329.2文献标识码:A Development of neural stem cells in human hippocampus in the fetal brain at different developmental stages YIN Xiao-juan,DU Jiang,FE NG Zhi-chun(Department of Pediatrics,Zhujiang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510282,Guan gdong Province,China) Abstract:Objective To study the development of neural stem cells fr om human fetal brains at different devel-opmental stages.Methods A total of100cases of embr yos at16-32gestational weeks by induction of labor with water ba g were collected for the determination of the distribution,forms,existing modes,and the number of neural stem cells in the hippocampus by SABC immunohistochemical method and light microscopy.R esults Neural stem cells wer e found in the hippoca mpus at different fetal ages and located in the polymorphic layer,pyramidal,granular and molecular la yers of hippocampus,mainly in polymorphic layer,pyramidal layer,and granular layer.Neural stem cells in hippocampus were round,ellipse,triangle,and stellate,particularly round and ellipse.No obvious enation was found.Neural stem cells had plenty of cytoplasm.The nuclei were round and ellipse with rare chromatin and nu-cleoli from2to6.Most of neural stem cells were distributed among other neurons,and symmetric cleavage was found in some of them,but some neural stem cells were distributed in cluster and nest.The number of neural stem cells in hippocampus were different between gr oups and gradually decreased with the increasing gestational age.Conclusion Neural stem cells exist widely in the hippocampus at different gestational ages.Ther e are differences in distribu-tion,for ms,existing modes,and number of neural stem cells in hippocampus at different gestational ages.Hipp-ocampus may be the ne w originating region of neural stem cells. Key words:neural stem cell;nestin;human brain;hippocampus 神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发现彻底打破了神经不能再生的传统观念,不仅将神经科学研 基金项目:广东省科技联合攻关项目(B30502) Supported by t he Key Sc i&T ech Research Proj ect of Scie nt ific Co mm ittee of Guangdong Pro vince(B30502) 作者简介:尹晓娟(1966-),女,湖南省邵阳市人,博士研究生,主治医师,主要从事新生儿疾病、遗传性疾病及胚胎神经发育方面的研究,现在 在第三军医大学西南医院儿科,重庆400038。电话:(023)66359952 通信作者:封志纯,电话:(020)61643369,E-mail:zhjfe ngzc@sohu.co m 收稿日期:2004-03-04;修回日期:2004-07-03究推向了前沿,为神经发育和神经组织移植等领域开辟了广阔前景,同时给临床颅脑损伤或其它神经系统退行性疾病等治疗带来新的希望。国外研究表明,哺乳动物成年脑在未受损部位出现了间断性神经生发,诱导因素能使在体的脑组织发生内源性神经再生[1]。目前采用神经干细胞植入脑组织已经在临床取得了肯定的疗效,但激活脑内源性的神经干细胞实现自我修复仍然处在实验研究的初期[1,2]。迄今对于神经干细胞的原位调节仍然是一无所知,这负面影响了细胞移 2061 第26卷第22期2004年11月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACTA ACADE MIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol.26,No.22 Nov.2004 DOI:10.16016/j.1000-5404.2004.22.032