H5N1亚型禽流感病毒NS1基因_省略_表达及其ELISA检测方法的建立_杨涛

中国兽医科技2005,35(8):585-589

Chinese Jo ur na l of V eter inary Science and T echno log y

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及

其ELISA检测方法的建立

杨涛1,刘明1,张云1,刘春国1,杜绍范2

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;

2.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161)

摘要:采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Go ose/H LJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pM AL-c2X上,转化DH5A大肠埃希氏菌感受态细胞,经Bam HⅠ和H in dⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒转化T B1大肠埃希氏菌后,经0.3mmo l/L的IPT G诱导,融合蛋白MBP-NS1得到大量表达,融合蛋白以可溶形式存在,分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明,融合蛋白M BP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应,而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白M BP-N S1为包被抗原的间接ELISA检测方法,为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。

关键词:禽流感病毒;NS1基因;原核表达;酶联免疫吸附试验

中图分类号:S852.659.5:Q786文献标识码:A文章编号:1000-6419(2005)08-0585-05

Prokaryotic expression of NS1gene of H5N1avian influenza virus

and development of direct ELISA

YANG Tao1,LIU Ming1,ZH ANG Yun1,LIU Chun-g uo1,DU Shao-fan2

(1.N atio nal K ey L abor ator y of V eter inar y Biotechnology/H ar bin Veter inar y Resear ch I nstitute,

Chinese A cademy of A gr icultur al Sciences,H ar bin150001,China;2.Co llege of A nimal S cience and

Veter inary M edicine,S heny ang A gr icultural Univ er sity,S heny ang110161,China)

Abstract:T he NS1g ene of H5N1subtype influenza A virus A/Goose/H LJ/p46/2003w as am plified by RT-PCR technique,then cloned into prokaryotic expressio n vector pM AL-c2X.The recombinant plas-m id pc2X-N S1w as amplified and ex tracted after being transformed into E.coli DH5A com petent cells. Restriction analysis w ith Bam HⅠand H in dⅢand sequences analysis indicated that the r ecombinant plas-m id carrying NS1w as inserted w ith co rrect open r eading frame.The fusio n pro tein of MBP-NS1w as pro-duced after induction w ith0.3mmo l/L IPTG of E.coli TB1competent cells transfo rmed w ith pc2X-NS1. The fusion protein is soluble and is about67ku.The w estern-blotting test indicated that the fusion pr otein reacted w ith the convalescents sera of duck ex perimentally infected w ith H5N1influenza virus,but not w ith those of the duck immunized w ith the inactiv ated viruses.The prelim inary indir ect ELISA method w as dev elo ped by using the pur ified fusion protein of MBP-NS1as antig en.The results make it possiblity of sero logical diagnosis to disting uish ducks infected w ith H5N1influenza v ir uses from those immunized w ith o il adjuvant inactivated influenza vaccines.

Key words:influenza virus;NS1g ene;prokaryo tic expression;ELISA

收稿日期:2005-04-22

基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目(2003A A241110);国家重点科技攻关计划项目(2004BA519A19)

作者简介:杨涛(1979硕士。刘明为通讯作者,T el:0451-********,E-mail:liuming04@126.co m

高致病性禽流感(H PAI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的H5亚型或H7亚型禽流感病毒(AIV)引起的。A型流感病毒基因组由8条负链RNA节段组成,共编码10种蛋白。H A、NA和M1蛋白参与组成病毒的囊膜;M2蛋白构成病毒囊膜的质子通道;PB2、PB1、PA和NP蛋白与8条病毒RNA节段共同组成病毒核蛋白复合体。上述8种蛋白与病毒基因组共同组成流感病毒粒子。但是,由流感病毒中最小的RNA节段所编码的NS1和NS2蛋白只在病毒感染的细胞中存在,在病毒粒子内不存在[1]。NS1蛋白(分子质量25ku)主要在细胞核内,NS2蛋白(分子质量12ku)主要在胞浆内。因此,抗NS1蛋白的抗体只能在流感病毒活毒感染的动物体内检测到,而用灭活病毒免疫的动物不会产生针对NS1蛋白的抗体,据此可以区分灭活疫苗免疫动物和活病毒感染动物。Birch-M achin等[2]和Ozaki等[3]报道了应用ELISA检测NS1蛋白抗体来区分流感病毒自然感染马与灭活疫苗免疫马。刘金华等[4]和赵思婷等[5]分别对鸡源和鸭源的H9N2亚型AIV的NS1基因进行了克隆与表达。目前国内在这方面的研究尚处在N S1蛋白的表达阶段,未见AIV NS1蛋白表达后应用于ELISA鉴别诊断方面的报道。笔者在对2003年以来我国及周边地区流行的H5N1亚型AIV的NS1序列比较分析的基础上[6],选择其中1株有代表性的毒株对其NS1基因进行了基因克隆与原核表达,初步建立了以重组NS1蛋白为包被抗原的ELISA检测方法。

1材料与方法

1.1病毒和血清

病毒A/Go ose/H LJ/P46/2003(H5N1)株简称P46,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所按常规方法分离鉴定。P46感染康复鸭血清制备:2周龄健康雏鸭8只(购于哈尔滨市郊区某鸭场,该鸭场从未接种过禽流感疫苗)。攻毒前对试验鸭检测H I 抗体均为阴性。对试验鸭滴鼻点眼感染107EID50 P46,0.5mL/只。感染后1周内75%试验鸭死亡;攻毒后2周,2只康复鸭血清H5亚型特异的H I抗体效价在1B16以上。灭活疫苗免疫鸭血清:取2周龄健康雏鸭4只,用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产的禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1亚型)进行免疫,免疫后分别在第2周、第4周采血检测,血清H5亚型特异的H I抗体效价在1B32以上。

1.2质粒和菌种

pM AL-c2X麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白表达试剂盒购自NEB公司,DH5A、T B1大肠埃希氏菌株由笔者所在实验室保存。

1.3主要试剂

病毒RNA提取试剂T RIzo l、cDN A反转录试剂禽源反转录酶AMV购自Inv itro gen公司;PCR 扩增所用的Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶Bam HⅠ、H in dⅢ购自大连宝生物工程有限公司;X mnⅠ购自NEB公司;碱性磷酸酶标记的羊抗鸭Ig G购自深圳晶美公司;质粒(小量)抽提试剂盒、胶回收(小量)试剂盒,购自上海华舜生物工程有限公司。

1.4H5N1株NS1基因的RT-PCR扩增与克隆

1.4.1引物设计参照已知序列设计1条A IV反转录通用引物,序列如下:

U n-i12:5c-A GCAAAAGCAGG-3c

根据GenBank中的已知N S基因序列设计1对NS基因RT-PCR扩增引物,序列如下:

NS-27:5c-A T GGAT CC CAACACT GT GTCG-

AGCTT TCAGGTAGACTGCTT T C-3c 下划线部分为引入的Bam HⅠ酶切位点。

NS-722R:5c-GCG AAGCT T CAAACT TCT G-

T CTCAAT TGTT CT-3c

下划线部分为引入的H in dⅢ酶切位点。

以上引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

1.4.2病毒RNA的提取及基因的RT-PCR扩增按T RIzo l试剂说明书,从感染P46的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA。以Un-i12为引物,采用禽源反转录酶AM V,按试剂盒说明书进行反转录合成病毒cDNA。以cDNA为模板对N S1基因进行RT-PCR扩增。PCR反应程序:94e预变性4min,94 e变性30s,54e退火30s,72e延伸1min,循环扩增30次;72e延伸10min。PCR产物采用上海华舜公司胶回收试剂盒回收,用于连接反应。

1.5重组表达质粒的构建

表达载体pMAL-c2X用X mnⅠ和H in dⅢ双酶切;扩增的NS1基因片段先用T4DNA聚合酶进行3c末端平滑化处理,再用H in dⅢ酶切。用T4 DNA连接酶连接酶切后纯化的PCR产物与双酶切纯化的pMAL-c2X载体,转化DH5A大肠埃希氏菌感受态细胞,然后取出100L L菌液,涂布于含有氨苄青霉素(50IU/mL,下同)的LB平板上,37e培养16h。挑取LB平板培养基上的白色孤立菌落6个,分别接种于5mL含有氨苄青霉素的液体LB培养基中,37e培养12h,用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒。

586中国兽医科技第35卷

1.6重组表达载体的鉴定

对提取的重组质粒用限制性内切酶H in dⅢ和Bam HⅠ进行双酶切,用10g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定。取含酶切后电泳阳性重组质粒的菌液1mL,送上海博亚公司进行序列测定。

1.7NS1蛋白在大肠埃希氏菌中的表达

取阳性质粒转化T B1大肠埃希氏菌感受态细胞,然后取出100L L菌液,涂布于含氨苄青霉素的LB平板上。37e培养16h。挑取LB平板培养基上的孤立白色菌落,接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37e培养过夜,取0.1mL菌液(剩余菌液加入150m L/L的甘油,-20e冻存)加入10mL的LB培养基中,37e振荡培养至D600n m 值等于0.5时,加IPT G至终浓度为0.3mm ol/L,

继续培养6h,分别在诱导前和诱导后第2、4、6h取0.5mL菌液;以6000r/m in离心2min,去上清液,将沉淀加入100L L的1@SDS上样缓冲液中,-20 e保存备用。

1.8表达产物的检测

1.8.1SDS-PAGE电泳保存的样品经振荡悬浮后,置沸水中煮5m in,然后以6000r/m in离心2 min,取15L L样品于100g/L分离胶进行SDS-PAGE电泳。

1.8.2Western-blotting检测对保存的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后进行电转印,电转条件为36mA2h。将转印后的硝酸纤维素膜放入含50 g/L脱脂奶粉的PBS封闭液中4e封闭过夜;将硝酸纤维素膜剪成条分别与P46感染康复鸭血清和禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1)免疫的鸭血清室温作用2h,用PBST(含0.5mL/L吐温-20、pH7.4的PBS缓冲液)洗涤3次,再与碱性磷酸酶标记的羊抗鸭IgG二抗室温作用2h,PBST洗涤3次,最后用NBT/BCIP底物显色,拍照记录。

1.9NS1融合表达蛋白的纯化

取1mL菌液加入100m L的细菌培养基中,进行大量诱导表达,然后按pMA L融合蛋白表达及纯化试剂盒说明书操作,采用淀粉琼脂糖亲和色谱柱对融合表达的NS1蛋白进行亲和纯化。

1.10NS1抗体的ELISA检测

对P46感染康复鸭血清和禽流感油乳剂灭活疫苗(H5N1)免疫鸭血清的NS1抗体进行ELISA 检测。取亲和纯化的重组NS1蛋白以10L g/mL浓度(每孔50L L)包被酶标板,置4e冰箱过夜;弃去包被液,加含50g/L脱脂奶粉的PBS缓冲液(每孔

100L L),37e封闭2h;用PBST洗涤3次,每次5m in;将上述2种血清用含50g/L脱脂奶粉的PBS 缓冲液1B10稀释,每孔加50L L,每个样品平行加样2次,37e作用1h;重复前步洗涤程序以后,每孔加50L L用含50g/L脱脂奶粉的PBS缓冲液1B200稀释的碱性磷酸标记的羊抗鸭IgG二抗, 37e作用1h;重复前步洗涤程序后,每孔加入含1mg/mL的pNPP底物缓冲液50L L,37e避光显色20min,加0.5mo l/L N aOH终止反应,用酶标仪测D405nm值。

2结果

2.1NS1基因的RT-PCR扩增

RT-PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶电泳,扩增的片段大小约700bp,与预期大小相符(见图1)。

图1NS1基因的RT-PCR扩增产物

Fig.1RT-PCR products of NS1gene

1.DN A分子质量标准;

2.P46病毒株NS1基因扩增产物

1.DL2000DNA M arker;

2.NS1pr odu cts of P46strain

2.2重组质粒pc2X-NS1的鉴定

从重组质粒转化的大肠埃希氏菌中提取质粒,经限制性内切酶B am HⅠ和H in dⅢ酶切,以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳,得到2个片段,大小分别在6650bp和700bp左右,与预期大小相符(见图2)。

图2重组质粒pc2X-NS1的酶切鉴定

Fig.2Identif ication of the recombinant plasmid of pc2X-NS1 1.DN A分子质量标准;2~7.重组质粒pc2X-NS1;8.空质粒pM A L-c2X

1.DL15000DN A M ar ker;2-7.pc2X-NS1;8.pM A L-c2X

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第8期杨涛等:H5N1亚型禽流感病毒N S1基因的原核表达及其EL ISA检测方法的建立

对重组质粒pc2X -N S1的测序结果表明,NS1基因被成功地克隆到了融合表达载体pM AL -c2X 上的X mn Ⅰ和H in d Ⅲ酶切位点之间,MBP 基因和

NS1基因的阅读框正确结合,克隆的NS1基因全长678bp 。经序列测定,NS1基因的序列与此前的已知序列完全一致(见图3)

。

图3 流感病毒A/Goose/Heilongjiang/P46/2003NS1基因核苷酸及推导的氨基酸序列

Fig.3 The nucleotide sequence of NS1gene of A/Goose/Heilongjiang/P46/2003and the deduced amino acid sequence from the

NS1gene

2.3 重组蛋白SDS -PAGE 及Western -blotting 检测

用100g/L 分离胶进行SDS -PAGE 分析,发现诱导2、4、6h 后都有融合蛋白表达,融合蛋白相对分子质量约66ku,诱导4h 后目的蛋白的表达量最大(见图4)。Western -blotting 分析结果表明,融合蛋白M BP -NS1能够与P46活病毒感染鸭的阳性血清发生特异性反应(见图5),而不与禽流感油乳剂灭活疫苗(H 5N1)

免疫鸭血清发生特异性反应。

图4 NS1基因经IPTG 诱导后表达产物的SDS -PA GE 分析Fig.4 The SDS -PAGE analysis of the expression of MBP -NS1

in E.coli TB1pos-t induction

1.pc2X -NS1TB1诱导2h ;

2.pM AL -2X TB1诱导2h;

3.pc2X -NS1TB1诱导4h;

4.蛋白质分子质量标准;

5.pc2X -NS1T B1诱导6h 1.pc2X -NS1T B1induced for 2h ;2.pM AL -2X T B1indu ced for 2h;3.pc2X -NS1T B1indu ced for 4h; 4.Protein molecular w eight M

ark er; 5.pc2X -NS 1T B1indu ced for 6h

图5 MBP -NS1蛋白的Western -blotting

Fig.5 The Western -blotting analysis of the fusion protein

MBP -NS1

1.蛋白质分子质量标准;

2.M BP -NS1蛋白

1.Protein molecular w eight M arker;

2.Fusion protein M BP -NS1

2.4 NS1融合表达蛋白的纯化

融合蛋白经过纯化后,纯度可达95%以上(见图6)。

2.5 NS1抗体的ELISA 检测

经ELISA 检测,P46感染康复鸭血清的D 405nm

均值为0.890;禽流感油乳剂灭活疫苗(H 5N1)免疫鸭2周和4周血清的D 405nm 均值分别为0.230和0.252。表明融合蛋白与活病毒感染康复鸭的血清发生反应,而不与灭活疫苗免疫鸭血清发生反应,借此可用于鉴别诊断活毒感染鸭与灭活疫苗免疫鸭。

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图6亲和层析纯化后的NS1蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.6The SDS-PAGE analysis of purif ied fusion protein MBP-NS1

1.蛋白质分子质量标准;

2.亲和层析纯化后的M BP-NS1蛋白;

3.未纯化的M BP-NS1蛋白

1.Protein m olecu lar w eigh t M arker;

2.Purified fu sion protein M BP-NS1;

3.U npurified fusion protein M BP-NS1

3讨论

3.1H5N1亚型AIV的暴发严重影响了养禽业的发展。目前,疫苗免疫接种是预防禽流感传播的重要措施,但疫苗免疫动物与自然感染AIV的动物同样会在体内产生高水平的H I抗体,给禽流感的流行病学监测带来困难,也使禽类出口受到限制。因此,研制可以区分疫苗免疫与自然感染病毒动物的鉴别方法已经成为当务之急。针对这一问题,笔者以经过纯化的融合蛋白M BP-N S1蛋白为包被抗原,初步建立了ELISA检测方法,为今后建立完善的区分疫苗免疫与自然感染动物的ELISA鉴别诊断方法奠定了基础。

3.2原核表达系统以其成本低和表达量高等优点,被广泛应用于诊断试剂、亚单位疫苗的生产和蛋白功能的研究等方面。本试验N S1蛋白在大肠埃希氏菌中的表达量占菌体总蛋白的20%以上,以可溶形式存在,而且pMA L-c2X载体是一种高效的融合有麦芽糖结合蛋白标签,便于用亲和层析法纯化,因此在实际应用中将会大大减少生产时间和成本。3.3根据NS基因序列的同源性可将N S基因分为A和B两群,群内基因的同源性在80%以上,群间的序列同源性只有60%左右[7]。Ludw ig等[8]研究发现,A型流感病毒中含有基因群A的流感病毒可存在于感染的禽类和哺乳动物中,而含有基因群B的流感病毒仅在禽类中发现。本试验表达的NS1基因虽然属于基因群A,但是通过试验发现该重组蛋白也可用于B基因群流感病毒感染禽类的抗体检测,这样便省去了需要表达不同亚型NS1蛋白的繁琐工作。本试验建立的ELISA鉴别诊断方法是通过实验动物初步建立的,还需进一步在养殖场家禽的大批量检验中验证和完善。

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