生化实验步骤

一、Purpose

1.In order to understand the function of differential expression proteins in leaves of seedlings, the proteins Of leaves at the seedling stage of hybrid Shanyou63 were studied by using approach of plant proteomics.

2.In order to learning the methods of Two-Dimensional Electrophoresis, TCA/acetone method to extract proteins, The methods of SDS-PAGE.

3. Familiar with the operation and equipment in the laboratory.

4. Familiar with high performance liquid instruments

5 Familiar with the flow and operation method of HPLC

二、Principles

1. TCA method

TCA method is also called precipitation method refers to the cohesion protein molecules from the solution .This phenomenon is known as protein precipitation

2. 2-DE

A direction to SDS-polyacrylamide gel to separate proteins in accordance with the molecular weight ,A direction to IEFF isoelecctric focusing elecctrophoresis to separate the different proteins in accordance with the isoelectric point . So that can separate the different proteins

3 .HPLC

High-performance liquid chromatography (sometimes referred to as high-pressure liquid chromatography), HPLC, is a chromatographic technique used to separate a mixture of compounds in analytical chemistry and biochemistry with the purpose of identifying, quantifying and purifying the individual components of the mixture. Some common examples are the separation and quantitation of performance enhancement drugs (e.g. steroids) in urine samples, or of vitamin D levels in serum.

HPLC typically utilizes different types of stationary phases (i.e. sorbents) contained in columns, a pump that moves the mobile phase and sample components through the column, and a detector capable of providing characteristic retention times for the sample components and area counts reflecting the amount of each analyte passing through the detector. The detector may also provide additional information related to the analyte, (i.e. UV/Vis spectroscopic data, if so equipped). Analyte retention time varies depending on the strength of its interactions with the stationary phase, the composition and flow rate of mobile phase used, and on the column dimensions. HPLC is a form of liquid chromatography that utilizes small size columns (typically 250 mm or shorter and 4.6 mm i.d. or smaller; packed with smaller particles), and higher mobile phase pressures compared to ordinary liquid chromatography.

With HPLC, a pump (rather than gravity) provides the higher pressure required to move the mobile phase and sample components through the densely packed column. The increased density arises from the use of smaller sorbent particles. Such particles are capable of providing better separation on columns of shorter length when compared to ordinary column chromatography.

三、The experiment steps

2-DE

1.样品制备（Sample preparation）

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）

1）取叶片2-3g，液氮研磨；Take 2-3 g blade, grind in liquid nitrogen

2）取50ml离心管，加入20ml TCA抽提液，震荡15-30分钟，－20 o C的冰浴Take 50 ml centrifugal tube, add 20 ml TCA, shake well,store at －20 o C for one night

3）离心，（4o C，11000rpm, 15min），弃上清；

centrifuge (4o C，11000rpm, 15min), abandon the liquid;

4）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%?-巯基乙醇的丙酮溶液，－20 oC的冰浴,2小时；

suspende in acetone solution（(including 10% TCA and 0.07% ?-sulphur ethanol)，store at －20 oC for 2h

5）离心（4oC，11000rpm, 15min）centrifuge 4oC，11000rpm, 15min), abandon the liquid; 6）重复（4）、（5）3次Repeat (4), (5) 3 times

7）真空干燥沉淀；Vacuum drying precipitation

8）用裂解液溶解沉淀，dissolve precipitation With cracking liquid

9）centrifuge (4oC，40000g, 1h), Take the liquid

10）紫外吸收法定量蛋白Using ultraviolet absorption method quantify the protein

11），分装至Eppendof管里保存在-78oC备用（紫外吸收法定量蛋白:蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收值）

Packi With Eppendof tube, stored at-78oC . Set aside

2.第一向等电聚焦（IEF）

1）胶条水化Strip hydration

2）取出水化上样缓冲液（I）（不含DTT，Bio-Lyte），一小管（1ml/管），室温溶解。Take out the hydration sample buffer (I) (excluding DTT, Bio-Lyte)（stored,at -20℃）, a small tube (1 ml/tube), dissolve at room temperature.

3）然后加入0.01g DTT，2.5ml Bio-Lyte，充分混匀。

Add 0.01 g DTT, 2.5 ml Bio-Lyte , fully mix.

4）取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。

Take out 400 ml the hydration sample buffer, add 100 ml samples, fully mix.

5）从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。Take out IPG precast strip (17 cm pH 4-7) （stored,at -20℃）, place at room temperature for 10 minutes.

6）加入样品。Add the sample

7）.去除预制IPG胶条上的保护层。

Remove the protective layer of prefabricated IPG glue.

8）将IPG胶条放入胶条槽中，胶面朝下，胶条的阳性端与正极对应。

Put the IPG strip into the slot of glue, the face of the glue down,the positive of the glue Point to the positive of the power

9）在IPG胶条覆盖矿物油，盖上盖子Cover mineral oil on the IPG strip, Close the lid

10）设置等电聚焦程序。

Set and isoelectric focusing program. (200，300，400，500，and 600V for 30 min，respectively，800V for 14 h．and l 000Vfor4h．)

11）第一向胶条的平衡（IPG strip equilibration）

3.第二向SDS电泳（SDS-PAGE）

1）.制胶Made the gel,10%

2）. 取出的IPG胶条，室温放置10分钟。

take out of the IPG strip,place at room temperature for 10 minutes.

3）用去离子水润洗IPG胶条

wash IPG strip with deionized water

4）．转移IPG胶条

Transfer IPG strip

5）.加入5ml胶条平衡缓冲液I。

Add equilibration buffer I

6）.将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

slowly shaking the sample hydration pan on the level table concentrator for 15 minutes

7）. 彻底倒掉水化盘中的胶条平衡缓冲液I,用滤纸吸取多余的平衡液

strip out thoroughly the equilibration buffer I, absorb redundant balance buffe I with the filter paper

8）.加入胶条平衡缓冲液，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

Add equilibration buffer II.

9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

With the filter paper absorb excess liquid, put the second gel had been treated on the desk,the long glass down, the short glass up , the top of the gel to yourselves.

10）加热琼脂糖封胶液进行溶解

Heating agarose sealing glue to dissolve

11）.彻底倒掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液

strip out thoroughly the equilibration buffer II , absorb redundant balance buffe I with the filter paper

12）把IPG胶条放在凝胶的长玻璃板，胶面朝上.

put the IPG strip on the long glass,the plastic face up.

13）将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

put the SDS-PAGE gel transferred to the encapsulating compound frame, the short glass face youself. Add the low melting point agarose to seal the glue.

14）.用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。

Use tweezers gently push the strip down, to completely contact with the polyacrylamide gel surface

15）.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

Place for five minutes

16）.将凝胶转移至电泳槽中。

Transfer the gel to the electrophoresis slot

17）.接通电源，设置程序

Switch on the power, set up the pogram

18）.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

After the electrophoresis, gently pry the two layers of glass, remove the gel, and cut the Angle for a sign

4.检测染色（Detection/Staining）

1）染色Staining，8 h

2）脱色fade ，many times,

3）用Image Scanner 扫描图像，分辨率300dpi，24位全彩

With the Image Scanner scan images, resolution 300 dpi, 24 a full color

5.高效液相色谱仪操作步骤：HPLC

1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜.

Filtering mobile phase, choose t the membrane filter according to the differen need .

2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

Ultrasound degassing 10-20 minutes to the mobile phase after filtering

3)．打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道和检测系统。Open the HPLC workstation (including computer software and chromatography), connect the mobile phase pipe and detection system.

4)．进入hplc控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

Come into the HPLC control interface the main menu, click on the manual to come into the manual menu

5)．冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

Wash the pump,extract directly in the outlet of the pump, with needle. wash the injection valve, need to be in manual of the menu, first click on purge, then click start, the cleaning speed, no more than 10 ml/min.

6)．调节流量，一般不要超过2000 psi。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

adjust the flow, generally no more than 2000 psi. Click on the injure, choose appropriate velocity, click on, walk the baseline, observe the baseline.

7)．设计走样方法。点击file，选取se-lect users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

Set uo the program. Click on the file, select the se-lect users and methods, can choose all kinds of existing its shape method. If you need to build a new method, click on the new method. Select the need accessories, including injection valve, pump, detector etc, according to the needs.

Choose finished, click on the protocol. A complete its shape methods need to include: sample before the firm flow, general 2-5 minutes; baseline to zero; The sample loading-inject transformation; go out of form time, along with different samples and different.

8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

Sample and sample after operation. Selected its shape method, click start. Sample, all samples all needs to filter. Methods after finished, click on the postrun, can record data and do markers. Go through all the samples, then use the method above walk a baseline, wash off surplus thing. 9)．关机，先关计算机，再关液相色谱。

Shutdown, first tun off the computer, then tun off liquid chromatography

10)．填写使用记录，由负责人签字。

Fill in the use record ，sign by the chief.

四Solutions

1.还原剂（reducing agents ）最常用的是二硫苏糖醇（DTT）、8M 尿素，2%CHAPS，15mM DTT 和0 .5%IPG 缓冲液

Reducing agents：7M urea;2%CHAPS ;15mM DTT ,0 .5%IPG buffer solution

2.分离胶缓冲液【（1.5M Tris- HCl, pH8 .6 和0.4%（w/v）SDS）：90.85gTris 和2g SDS 溶于400ml 去离子水中，用6N HCL调节pH 到8.6 ，最后用去离子水将体积补足到500ml，加入50mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于4 C 储存两周。】

Separation Gel Buffer :1.5M Tris- HCL, pH8 .6 and 0.4%（w/v）SDS

90.85g Tris and 2g SDS were dissolved in 400ml of deionized water, pH to 8.6 using 6N HCL to adjust, deionized water to make up the volume to 500ml by adding 50mg of sodium azide and filtered. This solution store at 4℃two weeks.

3.覆盖液Drystrip Cover fluid（缓冲液饱和Buffer saturated的异丁醇isobutanol）【混合20ml 上述分离胶缓冲液和30ml 异丁醇，等几分钟后去掉异丁醇层。】

Drystrip Cover Fluid : 20 ml separation gel buffer with 30 ml isobutanol were mixed, wait

a few minutes, remove isobutanol layer.

4.平衡缓冲液【(0.05 M Tris -HCl , pH 8.8 ，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和2% (w/v) SDS )180

g 尿素urea, 150 g 甘油glycerol, 10 g SDS 和16.7 ml 分离胶缓冲液溶Separation Gel Buffer 于去离子水deionized water中，最终将体积补足到500ml】、

equilibration buffer：0.05 M Tris -HCl , pH 8.8, 6 M urea, 30% (w/v) glycerin and 2% (w/v) SDS

180 g urea , 150 g glycerin , 10 g SDS and 16.7 ml separation rubber buffer soluble in deionized water, the volume will complement to 500 ml

5.溴酚蓝bromophenol blue溶液aqueous solution【0.25% (w/v) 溴酚蓝bromophenol blue 溶于分离胶缓冲液Separation Gel Buffer中，25 mg 溴酚蓝溶于10 ml 分离胶缓冲液中，4℃储存】

Bromine phenol blue solution

0.25% (w/v) bromine phenol blue soluble in separation rubber buffer, 25 mg bromine phenol blue soluble in 10 ml separation rubber buffer ,store 4℃】

6.丙烯酰胺acrylamide/甲叉双丙烯酰胺溶Ultra Pure 【（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺acrylamide和0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将300 g 丙烯酰胺和8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足1000毫升。过滤后，4°C储存，两个星期。】

Acrylamide/Ultra Pure (30.8% T, 2.6% C) : 30% (W/V) acrylamide and 0.8% Ultra Pure solution.

300 g acrylamide and 8 g Ultra Pure was dissolved in deionized water, add deionized water to 1000 ml.

After filtering, store at 4 ° C two weeks.

7. 10%（w/v）过硫酸铵溶液【1g 过硫酸铵溶于10ml 去离子水中】

10% (w/v) ammonium persulfate solution

1 g of ammonium persulfate dissolve in 10 ml of deionized water

8.取代液【（50%(v/v)甘油glycerol 和0.01%溴酚蓝bromophenol blue水溶液aqueous solution）混合250 ml 甘油（100%）和250ml 去离子水deionized water，再加入50mg 溴

酚蓝bromophenol bluemixing，搅拌mixing 几分钟minutes。】

Replace aqueous solution:50%(v/v)glycerol and 0.01% bromophenol blue aqueous solution Mix 250 ml of glycerol (100%) with 250ml deionized water, then add 50mg bromophenol blue, stirring a few minutes

9. 低熔点琼脂糖溶液【含有0.5%(w/v)低low熔点melting point琼脂糖agarose的电极electrode缓冲液buffer solution。】

Low melting point agarose solution: Contains 0.5% (w/v) Low melting point agarose solution of electrode buffer

10. ACR-Bis: ACR0.2g, Bis0.08g,volume to 10ml

11.10%NP-40:1g NP-40 volume to 10ml

12.8mol/L urea: urea4.8g volume to 10ml

13. 10%SDS: 10gSDS, volume to 10ml

NP-40,2 ml;Am pH3.5-10,100; β-mercaptoethanol 500μL

五、Instruments and Materials

1. Instruments水浴锅water bath，量筒graduate，100ml容量瓶100ml volumetric flask，250ml 容量瓶250ml volumetric flask，10ml试管test tube ，250ml烧杯beaker，石棉网asestos net，，研钵mortar,滤纸filter paper, 漏斗funnel 。Electronic balance 电子天平, centrifugal machine离心机, constant temperature drying oven 恒温干燥箱, constant temperature water bath 恒温水浴锅, centrifuge tube离心管,remove liquor gun 移液枪,ice bag冰袋,glass pipe玻璃管(200 mm 长, 20 mm i . d .) oscillator 震荡仪,IPGphor 仪

2. Materials

Parafilm保鲜膜, liquid nitrogen液氮,hydrochloric acid （HCL）；sodium hydroxide(NaOH), alcohol；70%ethanol；KAC 醋酸钾, isopropanol 异丙醇,离液剂chaotropic agent（Mainly Include主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea））；表面活性剂（sufactants）也称去垢剂NP-40,CHAPS, DTT, IPG, SDS, Tris, 溴酚蓝bromophenol blue,去离子水deionized wate,,异丁醇isobutanol, 丙烯酰胺acrylamide,甲叉双丙烯酰胺溶Ultra Pure,过硫酸铵ammonium,琼脂糖agarose ACR Bis

六、rusults

紫外吸收法定量蛋白，测得蛋白浓度为0.7mg/ml，双向电泳显示有蛋白，由于所提蛋白质量过大，未进行HPLC。

quantify the protein with the ultraviolet absorption method and protein concentration were measured for 0.7 mg/ml, two-dimensional electrophoresis showed that the protein were extracted , because the protein quantity is too high , the HPLC can’t be carried out..

七、discussion

通过这次实验，学习和了解到了相关的实验知识和技能，达到了一定的实验目标，但是，实验结果不是很理想。

Through the experiment, I know and recognize the relevant experimental knowledge and skills, but not to completely achieve the goal, the experimental results is not very good.For that,I am sorry for that.

八、records

4.18~21 ，提取蛋白Extracting protein

4.25-

5.3双向电泳2-DE

5.4分析实验结果Analyze the results

2015高级生物化学及实验技术试题答案

高级动物生化试题问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA）结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。

他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问

生化实验指导

实验1 氨基酸纸层析一、实验目的通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸层析的基本原理及操作方法。二、实验原理层析法又称色谱法。是一项重要的分离技术。利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。层析的种类：根据原理分为： a 分配层(纸层析) b 吸附层析 c 亲和层析 d 离子交换层析根据支持物分为： a 纸层析 b 柱层析 c 薄层层析 d 凝胶过滤层析分配层析的原理：各种物质在两种互不溶解的溶剂中的分配系数不同，从而达到分离的目的。分配层析用于分离在水和有机溶剂中都可溶的混合物。一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数。物质在流动相里的浓度物质在固定相里的浓度纸层析: 分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移（Rf ）值表示：色斑中心至上样原点中心的距离 K D = 图1 氨基酸纸层析示意图 R f =

溶剂前缘至上样原点中心的距离载体：滤纸固定相：滤纸吸附的水流动相：水饱和酚极性：谷氨酸＞丙氨酸＞脯氨酸对于水－饱和酚的溶剂体系，氨基酸极性越小，KD 值越大，Ｒｆ值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离远，反之迁移距离小。三、实验材料仪器 ⑴层析缸；⑵层析滤纸；⑶电吹风机；⑸喷雾器；⑹毛细管。试剂 ⑴氨基酸标准液（6mg/mL）；⑵氨基酸混合液（6mg/mL) ⑶展层剂：水饱和苯酚溶液。 ⑷显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液四、操作步骤 1、层析滤纸的准备用铅笔在层析滤纸上距离一端2-3cm处划线并标记点样位置。 2、点样(少量多次) 用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.5cm，干燥后再点样，重复3次。 3、展层将滤纸放入层析缸，使滤纸浸入液面以下，但不要使液面没过点样线。展层50-60分钟，取出，用铅笔绘出前沿线。 4、显色滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，吹干。

八种常用生化实验步骤

实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。学习PCR反应的基本原理和基本技术。了解引物设计的一般要求。二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl

生物化学实验4

食品生物化学实验要求 1. 学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不许进入实验室。每大组实验人数 28-29 人， 4 人一小组。 2. 实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中，掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3. 实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作，如有损坏，照价赔偿。 4. 卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。一、 10 食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（ 4 学时） 2. 蛋白质的功能性质（ 4 学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（ 4 学时） 4. 或果胶的提取（ 4 学时） 5. 酶的性质实验（ 4 学时）实验总课时： 16 学时二、食品生物化学实验指导书实验一淀粉的显色、水解和老化一、实验目的和要求 1 、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2 、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3 、淀粉的老化原理和方法二、实验原理 1 、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。

近年来用先进的分析技术（如X 射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α - 葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟 6 个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm 绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是 200 ～ 980 或相对分子质量范围是 32 000 ～ 160 000 时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度 20 ～ 28 ，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色葡萄糖单位的聚合度 3.8 7.4 12.9 18.3 20.2 29.3 34.7 以上包合物的颜色无色淡红红棕红紫色蓝紫色蓝色淀粉跟碘生成的包合物在 pH=4 时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2 、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（ C 6 H 12 O 5 ）m → (C 6 H 10 O 5)n → C 12 H 22 O 11 → C 6 H 12 O 6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，工业生产中常常使用玉米淀粉水解来加工结晶葡萄糖。 3 、淀粉的老化淀粉加入适量水，加热搅拌糊化成淀粉糊（α - 淀粉），冷却或冷冻后，会变得不透明甚至凝结而沉淀，这种现象称为淀粉的老化。将淀粉拌水制

生化制品技术实验指导

《生化制品技术》实验大纲一、实验目的本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。二、适用专业及层次适用于生物制药技术专业学生三、实验内容和学时分配

实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。二、实验原理乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。三、实验器材烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。四、试剂和材料脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。五、操作步骤

1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白（1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。（2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。（3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素（1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。（2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。（3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。（4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。（5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L 盐酸调整pH至3±0.1。（6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相

生化实验

1．火（1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火（2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。（3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。 2．烧伤（1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。（2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。氨基酸的分离鉴定纸层析法纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。在操作过程中，手不要摸滤纸。点样直径不超过3mm 。点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。蛋白质及氨基酸的呈色反应双缩脲反应紫红色肽键可用于蛋白质的定性或定量测定一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。茚三酮反应除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。黄色反应含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

生化制品技术实验指导教学内容

生化制品技术实验指导

实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。二、实验原理乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH 调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。三、实验器材烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。四、试剂和材料脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。五、操作步骤 1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白

（1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。（2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。（3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素（1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。（2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。（3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。（4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。（5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以 0.1mlo/L盐酸调整pH至3±0.1。（6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相比较。求出实际获得率（%）。

生化实验基本原理及技术

生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。

第一單元生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)

生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分光路徑(light path)的條件下測定波長吸光值

生化大实验实验报告

生化大实验实验报告姓名：学号：专业：班级：实验班级：单位：指导老师：

实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、实验原理：多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。二、实验目的：通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机；四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。五、结果和分析：实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；

食品生物化学实验

食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中，掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作，如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时）实验总课时：16学时

二、食品生物化学实验指导书实验一淀粉的显色、水解和老化一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖

生化实验整理

1.氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的 ?了解层析技术的一般原理 ?掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分二、实验原理层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用R f来表示分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用R f值表示：在一定条件下，某种物质的R f值是常数。R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关氨基酸显色反应——茚三酮反应原理：质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质

生化实验五大技术

生化实验五大技术一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:

可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球

《生物化学》实验指导(8个实验)

生物化学实验指导吕杰编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室

内容介绍《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。

目录实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)

实验一氨基酸纸层析一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？

生化实验报告资料

生物化学实验报告姓名：吴瑞学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。

生物化学实验思考题

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生物化学实验考试试题

细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用层析技术 1.什么叫层析技术？层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则

生化与分子生物学实验指导

生化与分子生物学实验指导-（)

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实验一氨基酸纸层析法一、实验目的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。二、实验原理纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法,是用滤纸为支持物,所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成,滤纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相,有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的,称上行法；由上向下移动的,称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf 值表示：在一定条件下某种物质的Ｒf 值是常数。Ｒf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只用一种溶剂展层,就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再用另一溶剂展层,从而达到分离目的,这种方法称为双向纸层析法。氨基酸无色,可利用茚三酮显色反应,将氨基酸层析点显色作定性、定量用。所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质。三、药品器材 1器材层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪刀、层析缸、毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。 R ｆ = 原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离