饲用水产微生态制剂的研究进展、存在的问题和对策

饲用水产微生态制剂的研究进展、存在的问题和对策

曾媛媛1杨进2艾春香1

1厦门大学海洋与环境学院福建厦门361005

2厦门利洋水产科技有限公司福建厦门361012

水产微生态制剂(Microecologics of aquaculture)指直接从水环境中和水产动物本身分离的正常微生物或其代谢产物，在微生态学理论的指导下,运用生态平衡失调原理,经特殊工艺制成的制剂，按组成可分为益生菌(Probiotic)、益生元(Prebiotics)和合生元(Symbiotic)3大类[1]，它的无毒、无残留、无副作用、不产生抗药性、对环境无污染，对于水产健康养殖具有极其重要的意义，是最有希望替代抗生素d的绿色制剂。其作用主要包括：调整水产动物肠道菌群平衡，在肠道内建立有益菌群，与致病菌间就生存和繁殖的空间、时间、定居部位以及营养素等开展竞争，抑制有害菌的增殖；防止有毒物质胺和氨的积累，从而保护机体不受毒害；调节机体免疫系统，提高免疫力，抵御病原菌侵染；补充水产动物营养,如维生素、氨基酸等；促进水产动物消化吸收，提高饲料转化率，促进动物生长发育。目前，用于水产微生态制剂剂型主要有粉剂和水剂两种。本文简要概述饲用水产微生态制剂的研究进展、存在的问题及其对策，以期为规范、完善饲用水产微生态制剂的研发和推广应用提供参考。

1饲用水产微生态制剂的研究与应用

1.1菌种选择与制备

1.1.1菌种选择

菌种选择的首要原则是安全性，其次是高效性、稳定性、易培养[2]。菌种选择直接影响到水产微生态制剂的功效和安全性,其选择标准必须考虑生物安全、生产方法和过程，微生态制剂的保存方式等因素，清楚微生态制剂在宿主体内的具体位置发挥何种效应，产生何种结果[3];对于复合制剂，还要注意菌种的搭配和协同作用[4]。水产微生态制剂实际生产中选择的菌种首先根据不同的宿主和养殖环境，最好从水产动物的肠道或其它组织器官或养殖水环境中筛选出可以成为益生菌的潜在菌株(PP，即potential probiotic)[3]，它必须是水产动物体内的正常菌群，其进入水产动物肠道后能定植并迅速生长繁殖；有良好的益生功能，活力强大，能在低pH条件下存活并能植入肠粘膜,并对水产动物本身无“三致”作用(致畸、致残、致

突变)[5]。

水产微生态制剂菌种选择主要有下列步骤：收集背景资料，PP的获得，PP对外源致病菌株抑制能力的评估，PP致病性与安全性的评估，PP效果的评估，商业价值的分析[6]。筛选出的菌株在进行发酵前要经过一定的工艺处理，保证生产上菌种在高压高温下有一定的存活率，比如采用微囊包被技术，采用海藻酸钠与淀粉作为材料对一些活菌进行包埋，对活菌的生产能力影响不显著[7]。

目前除从水体环境和水产动物本身分离、培养获得有益菌菌种外，还可以利用分子生物学手段将微生物中无益或有害的基因剔除，获得对宿主无害的、有益产物高效表达的微生物；或者将耐高温、抗酸等功能基因融合或者插入到有益菌基因中，获得具有耐高温、抗酸等新功能的菌种，这不仅有利于菌种在宿主体内存活，也有利于抵抗饲料加工带来的不利影响。分子生物学技术在菌种筛选与菌种品质改良方面发挥着重要作用[8]。然而，基因改造过的菌种往往存在着安全隐患。比如抗药基因随质粒的迁移而在不同的生物之间进行转化、遗传，造成大量不同生物及其后代具有抗药性，会造成严重的生态后果。因此一定要加强对改造菌种的检测与控制。

目前，微生态制剂的菌种主要以芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、蛭弧菌和光合细菌等为主[9]，筛选出的优良菌种既要控制菌种保存的条件，同时也要加强对天然菌种的改造和控制，并强化对菌种安全性的检测，一般情况下可以采用慢性毒性实验或急性毒性实验的方法来检查菌种的毒性[4]。

1.1.2制备方法

生产工艺条件对水产微生态制剂功效发挥影响很大，如菌株在发酵时的条件以及发酵结束的时间，会影响菌体在干燥和贮藏时的存活率。生产制备技术对微生态制剂的功效也有较大的影响。目前常用的发酵技术，主要包括液体深层发酵和固体发酵,普遍采用的是液体深层发酵[2]，因为液体发酵可以减少杂菌的污染，效果相对稳定。同一种菌株在发酵时的条件比如温度、压强等以及发酵结束的时间，均影响菌体的最终产物，进而影响微生态制剂的应用效果[2]。贮存条件也是影响益生菌存活率和保存期限。活菌制剂最好在低温、低湿度、厌氧状态下保存[2]。

目前，水产微生态制剂大多数为复合型，是两种以上菌种复合而成的，既可以先将菌种混合再共同培养，也可以先单一菌种培养后再混合，复合制剂已成为目前的研究热点[4]。1.2饲用水产微生态制剂的应用

饲用水产微生态制剂，其菌体本身含有大量的营养物质----蛋白质、氨基酸和维生素以

及一些微量促生长因子，可为水产动物生长发育补充营养，如光合细菌；一些微生物在其发酵或代谢过程中，会产生促生长素之类的生理活性物质，产生各种酶类，提高水产动物消化酶活性，促进食物的消化吸收，提高饲料的转化率,如芽孢杆菌；水产动物消化道内的微生物菌群保证了宿主正常的代谢,为机体生长发育提供了丰富的维生素等物质,如酵母。随着饲用水产微生态制剂研发技术的完善，其得以广泛应用，并取得了可喜的效果。

投喂添加了微生态制剂饲料组的鲤鱼增重率比未添加组提高了31.71％[10]。将益生菌加入混合饵料中饲喂对虾，其体增重、成活率、单产、经济效益均显著升高[11]。凡纳滨对虾饲料中添加微生态制剂---菌株J-10可促进其的生长,最适添加量为质量分数0.15%~0.2%,过量添加反而会抑制凡纳滨对虾生长[12]。

微生态饲料添加剂代替抗生素添加到甲鱼饲料中，既起到了促生长、防病作用，又可提高甲鱼的品质。研究表明，饲料中添加复合微生态制剂及抗氧化剂的辅剂,甲鱼的增重率、血清杀菌活性显著提高[13]。投喂添加了活菌的配合饲料的牙鲆幼鱼消化道的蛋白酶活性大幅度提高，对其生长有显著的促进作用[14]。中国明对虾肠道菌能增加不同发育阶段幼体的变态率和成活率，抗病力和低盐耐受力有所提高，体重和体长显著增加，研究还发现肠道菌产生许多降解饵料的蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶[15]。

饲料中添加水产微生态制剂能有效地提高水产动物的免疫力[16]。银鲫配合饲料中添加微生态制剂，可显著提高其血液白细胞吞噬活性和血清溶菌酶活性[17]。投喂添加了芽孢杆菌饲料的鲤鱼，其胸腺皮质增宽，巨噬细胞和粒细胞数量多，脾脏白髓内淋巴细胞增多，且胸腺内T，B淋巴细胞多，在脾脏中有许多呈椭圆体和黑色素的巨噬细胞中心[18]。鳗鱼饲料中添加0.2%复合微生态制剂，促进了鳗鱼生长发育,提高机体的抗病力,提高饲料转化率,提高产品品质,进而提高养殖效益[19]。投喂添加了从正常鲤鱼肠道中分离出的益生菌制成微生态制剂饲养鲤鱼，其白细胞吞噬率和吞噬指数、巨噬细胞吞噬率和E玫瑰花环形成率均高于未添加组,添加组鲤鱼感染致病源后的成活率和特异性抗体校价等均显著高于未添加组[20]。不同剂量的微生态制剂(EM)添加在饲料中饲养大口鲇和鲫鱼40d.结果表明,添加组鱼的红细胞数和血红蛋白含量等血液指标均优于未添加组，且随EM添加剂量的增加而提高，表明EM能改善大口鲇和鲫鱼的血液指标，提高机体的新陈代谢，加快生长速度[21].

不同的微生态制剂对同一宿主的效果各异，表明宿主对益生菌有一定的选择性。采用3种不同微生态制剂分别配制的配合饲料饲喂的鲤鱼的结果表明，各实验组鲤鱼的脾脏与体重之比分别比未添加组提高了21.41%,10.37%,2.49%[22]。

微生态制剂与寡糖、中草药配合使用，具有良好的协同作用[23]。寡糖属于益生元，与

益生菌科学配伍可生产出合生元。饲料中常用的主要有果寡糖、低聚木糖与甘露糖等[24]。寡糖类物质的特异性受体能通过对肠道黏膜上皮的竞争，与病原菌的外源凝集素特异性结合，使病原菌不能在肠壁上粘附，随水产动物的粪便排出体外[23]。大多数寡糖有利于肠道细菌如双歧杆菌、乳酸菌和嗜乳酸菌等有益菌的代谢，而对梭状芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等有很好的抑制作用[25]。将从对虾肠道中分离到的益生菌和低聚糖添加到凡纳滨对虾饲料中，结果表明益生菌和低聚糖具有协同作用，能显著的提高凡纳滨对虾血清酚氧化酶活性和血细胞吞噬百分率，增强其对WSSV病毒的抵抗力[26]。采用U5(52)均匀设计将有机酸和微生态制剂配合添加到鲤鱼基础饲料中进行饲养实验表明，两者配合使用效果更好，微生态制剂0.17%-0.22%，有机酸0.28%-0.47%时鲤鱼生长性达到最佳的水平[27]。

2饲用水产微生态制剂的研究与应用中存在的问题

饲用水产微生态制剂作为一种绿色饲料添加剂，近几年来发展很快，但其应用效果存在着明显的不稳定和不连续性。这主要由于缺乏对水产动物正常及病态状态下肠道微生物菌群结构和特性的研究，对肠道微生物和寄主之间的互相作用方面的研究更少。只有更系统深入的研究肠道微生物菌群在水产动物生长发育和保健中所起的作用，才能做到有的放矢，研发出效果稳定的、高效的、安全的饲用水产微生态制剂。

2.1相关的制度、标准、质量评价指标体系不健全

国家有关饲料添加剂法律法规不完善,相关的质量标准和评价指标体系尚不健全,缺乏完善的行业标准，检测手段也不完善，产品的标准和检测方法很混乱，水产养殖用微生态制剂不标识主要成分，难以进行质量监验；任意扩大作用和用途，导致水产微生态制剂的研发、生产和推广应用存在一系列问题。我国开展水产微生态制剂的研究起始于上世纪80年代之后，相对国外来说很迟，立法滞后，迄今尚未出台饲料和饲料添加剂管理法，只有条例[27]；国家标准和地方标准不统一，有些概念模糊不清，惩罚不明[5]。同时国家对省级以下的饲料行政主管部门未明确行政职能，分工不明确，造成“有钱大家分，出事大家推”的局面。而生产微生态制剂的产家也在钻法律的空子，冒用、伪造生产许可证、批准文号，不按饲料、饲料添加剂类产品属性和特征等命名[27]，出厂才打生产日期,造成经营者可以随意涂改生产日期。加之国内生产厂家众多,有些厂家设备简单、生产规模小，主要采用复配、仿制甚至造假方式生产,再加上检测手段不完善等,造成市场上的水产饲用微生态制剂产品良莠不齐。2.2基础理论研究薄弱,水产微生态制剂作用机制尚不清楚

迄今，对水产微生态制剂评价基本停留在应用效果上，而对其基础理论，特别是作用机制研究非常薄弱，缺乏系统性和深层次的研究，在菌种选择、施用条件、施用方法和施用量、菌种间相互作用、配伍的和谐性、作用机理、对环境的影响形式和影响程度、菌体保活技术、菌体回收和消除技术等方面的研究严重滞后。此外，水产养殖用微生态制剂的生产工艺落后，质量可控性方面也缺少深入研究。很多菌种被作为水产动物幼体阶段的微生态制剂不是靠科学研究，而是凭借经验得出的。到目前为止大多数病例里都没有权威、正确的结论可以从里面得到[8]。目前，有关水产动物消化道微生物的组成、结构及其生理功能等的基础研究少，这不利于水产微生态制剂深度开发，导致整体研发水平不高、进展缓慢。由于水产微生态制剂的作用机制不明确，现有的绝大多数产品是以模仿为主，导致产品的同质化现象严重，产品质量难以有新突破，且不稳定，以致产品在国际市场根本没有立足之地。作为饲用水产微生态制剂保活技术也没有得到解决，严重地影响了其有效性。因为在渔用配合饲料中使用活体微生态制剂会受到很多因素的影响，如水产动物种类、不同的生长阶段和生理状况、饲料的加工过程和运输方法等，这些因素都影响活菌微生态制剂的使用效果。因此，在研究饲用水产微生态制剂，必须下大力气研究水产动物肠道菌菌群自身的特点及与寄主和环境之间的关系，以便科学设计出新一代多功能高效的饲用水产微生态制剂。

2.3菌种资源库尚未建立,筛选出的适宜研发水产微生态制剂的菌种较少

水产动物微生态学研究进展缓慢，对筛选、优化水产微生态制剂菌种工作重视不够，导致菌种库难以建立，这对快速开发效果稳定的水产微生态制剂极为不利。允许饲用的菌种很少，美国FDA规定允许饲喂的微生物有43种，我国农业部1996年公布允许使用的微生物只有12种[28]，其中适合在水产业中使用的菌种就更加少。开展微生物资源研究，建立菌种资源库，以便为开发新型微生态制剂提供优良菌种。然而，这个领域的研究较为薄弱，很大程度上仍就停留在试验和应用基础上[8]。

2.4研发和应用过程中忽略了饲料加工、运输、贮存环节以及水产动物内环境对水产微生态制剂的不良影响

微生态制剂主要是以活菌为主，不稳定，保存期不长，在饲料加工生产中的高温高压容易导致失活[29]，在内服过程中由于消化道pH原因也容易导致微生物失活；且从自然界分离培养的野生细菌有些有抗药性，如何将抗药性基因提取出来而不影响其它产物的分泌是一个复杂的过程。此外，复合制剂中各种细菌的配比、合生元的配比等均是问题。许多生产厂家考虑到在生产过程中菌种的损耗，怕影响效果，认为多多益善，制剂中的细菌数量远远大于

108cfu/g－1010cfu/g[29]，其超量添加的负面影响认识不足。

水产动物不同的生长发育阶段、投喂饲料的组成及投喂方式均会影响水产微生态制剂的应用效果[4]。因为不同水产养殖动物和同一动物的不同生长发育阶段消化系统的特点不尽相同，而益生菌发挥作用首先是通过益生菌在肠道的定植作用开始随后而发生作用的。第一步的定植作用就是益生菌对肠道的黏附，有些益生菌的黏附作用对水产动物的种类和部位是有选择性的。

2.5水产微生态制剂推广使用较为混乱

水产微生态制剂并非对所有水产动物、任何时候使用均有效，不同对象与使用条件产生的效果差异巨大。然而，目前水产微生态制剂的推介存在严重的不实现象，其市场较为混乱，生产者、经营者和推广者将其功效夸大其辞，忽视其本身存在的不足，导致其使用效果差异极大，这既影响了生产厂家的信誉，又扰乱了市场的正常运行，结果是导致水产微生态制剂推广应用的艰难。此外，不是所有的有益菌都是绝对安全的,有的益生菌含有1种或多种抗药因子,如果盲目应用会造成抗药因子向其它肠道菌转移的危险，制造出任何抗生素都无法消灭的超级细菌，给人类造成更大的威胁。

3对策

3.1完善法律法规、水产微生态制剂生产规程和质量评价标准体系

国家和地方饲料和饲料添加剂行政主管部门，尽快组织行政、科技和立法人员，加快立法，统一国家和地方的生产标准和质量评价标准体系，明确基层行政单位的职能，明确执法主体，理顺饲料行业的管理体制。对水产微生态制剂研发、生产和经营单位进行规范，坚定地推行HACCP管理体系[8],对生产企业应实行GMP管理，以提高产品质量。依据相关的法律法规和标准，严厉查处违法违规事件。

3.2加强水产微生态制剂的基础理论研究,探明其作用机制、适宜条件

国家应该从科研立项、产业发展、人才培养等方面着手开展水产动物微生态学以及水产微生态制剂作用机制和应用条件的研究，鼓励广大生产企业和科研院所、高等院校密切合作，加强产、学、研的有机结合，也鼓励国内的相关企业与国外或境外势力雄厚的相关企业强强联合，或直接引进国外的技术和人才，充分发挥双方的优势，缩短开发产品的时间，研发出高效、安全的水产新型微生态制剂，以推进该产业的健康持续发展。

3.3加强优良菌种筛选，建立水产微生态制剂菌种资源库

现在水产微生态制剂的菌种相对自然界广泛的微生物资源而言，是极少的，因此要重视

优良菌种筛选工作，以建立水产微生态制剂菌种资源库。

1)改变筛选菌种的方法

人们一直采用分离培养的方法来研究微生物的多样性,而事实上，多数微生物经常处于“活的未培养状态”(VBNC),通过实验室人工培养方法已经分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的1%-5%,而其余95%-99%的微生物类群仍然未被分离和认识。培养的方法只能反映极少数微生物的信息，难以全面地分析微生物的多样性，也埋没了大量极具应用价值的微生物资源。因此，在传统分离培育方法的基础上，利用现代分子生物学技术，立足于宏基因组学的微生物资源开发平台，将会加速菌种资源开发与利用。

2)加强菌种的研究，尤其要加强对菌种功能基因的研究

随着后基因组时代的到来，对功能基因的研究早已提上日程，建立水产微生态制剂菌种的基因文库和菌种库是必然的趋势，这有利于以后菌种的筛选和产品的开发。例如菌种的耐酸碱性和高温高压性对实际生产是大有好处的，开展菌种功能基因，提高菌种质量。

3.4利用现代生物学技术和手段,现代生产工艺和设备,提高产品生产能力和质量

目前微生态制剂的菌种大多是厌氧菌，大多生产中只在培养过程中保持良好的厌氧状态，若能在其它一系列操作过程中如培养基的配方、接种、培养保证厌氧状态，例如亨盖特的滚管技术和厌氧手套箱技术,这样产品益生菌的含量将会提高；或者采用厌氧菌、好氧菌和兼性菌按一定比例混合培养[30]。而在微生态制剂中加入促生长因子，可以延长制剂的保存时间。要大力提倡发展微胶囊技术，对微生态制剂采用微囊包装的工艺可以显著提高产品的保存期和抗酸能力[30。

分子生物技术在水产饲料生产中的应用是未来发展的潮流。目前国内市场上具有国际竞争的微生态制剂不仅稀少，且价位偏高。如果企业能利用分子生物学新技术及生产设备，缩短产品上市时间，不仅可以提高产品的竞争力，而且获得较高的利润。此外，还可以应用物理、化学技术等，充分利用这些技术提升产品的质量和企业的生产能力，可以获得市场。3.5加强水产微生态制剂新剂型研发和应用技术的研究,强化其抵抗因饲料加工、运输、贮存环节以及水产动物内环境不良影响的能力

这个领域的工作可以从如下几方面开展：

1)加强新的包囊技术研发，比如微囊包埋技术，以提高产品对，以提高产品对饲料加工、运输、贮存环节以及水产动物内环境等的适应力，扩大产品的应用范围。

2)通过分子生物学技术，提高菌种的耐热、耐酸、产酶能力等，即将耐热、耐酸、高产酶等功能基因整合到已有的安全菌种中，提高产品对各种环境的适应力。同时，改造生产微

生态制剂的设备及完善生产工艺，降低菌群的死亡，保证其质量。二者缺一不可，两手都要硬抓。

3)着力开发合生元，提高产品功效。向活菌制剂中加入寡糖、免疫多糖、双歧因子等物质，能够选择性的促进动物体内的某些有益的代谢和增殖，从而提高水产动物的健康水平[2]，减少水产动物内环境的不稳定性。

4)尽量早使用微生态制剂，减少或阻碍病原菌的定居[2]。在水产动物育苗期就应该开始使用微生态制剂，因为早期水产生物还未发育完全，免疫系统薄弱，抗病能力差，极易发生疾病。

3.6规范水产微生态制剂的市场,推进其安全、健康使用

在加强对水产微生态制剂的质量监督检查的同时，规范其市场，首先是大力提高微生态制剂销售、推广和服务人员的自身素质，推行持证上岗，并经常组织他们学习先进技术，参加产品博览会，了解各种新型水产微生态制剂性能和使用注意事项。其次是加大法律法规的宣传和执法力度，对不按规定推介、使用水产微生态制剂人员进行限制，确保水产微生态制剂市场正常运行。

4结语

综上所述，尽管目前饲用水产微生态制剂也存在种种缺点，然而加强其研发与应用是绿色水产养殖的必然的趋势，它既符合现代人绿色、环保和健康的理念，同时也是市场经济的需要，具有光明的前景。相信随着科学技术的进步，饲用水产微生态制剂必然会克服种种缺陷，成为未来水产绿色饲料添加剂的佼佼者。

参考文献（略）