灵芝漆酶基因的克隆

摘要：综合运用苯胺蓝平板脱色法和愈创木酚法对实验室各菌种是否会产木质素降解酶进行简单定性分析。而后，运用基因组步行技术去克隆到一个全新的灵芝漆酶结构基因和其对应的全长cDNA,并对其序列进行分析。

关键词：定性分析，基因组步行，漆酶结构基因

漆酶（英文名称:Laccase CAS 编号：80498-15-3）是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。

漆酶其独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用,作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有两种:漆酶电极和漆酶酶标。

本文利用漆酶Cu离子结合区氨基酸序列高度保守特点，设计简并引物，综合运用基因组步行等分子生物学技术从灵芝中克隆到一个全新的漆酶基因。

1.实验材料

1.1 酶和试剂

①限制性内切酶、限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Ex．Taq DNA聚合酶。

②4种dNTP和One Step RT．PCR Kit，TRIzol试剂，Oligotex mRNA Mini Kit，DNA纯化试盒。

③愈创木酚、苯胺蓝。

2.1.2 菌株

①毛绒鬼伞 0901

②大肠杆菌 XL10-Gold

③载体 pMD18-T

2.1.3 主要仪器

①UV 754 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；

②YXQ-LS-SH 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

③QYC 211 摇床：上海福玛实验设备有限公司；

④AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

⑤SHP-150型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；

⑥DZF-6050 真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；

⑦HH-S28s 数显恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司；

⑧超低温冰箱：上海精密科学仪器有限公司；

⑨台式高速离心机：上海化工机械厂；

⑨LG2020 电泳成像系统：河南兄弟仪器设备有限公司；

⑩全自动PCR仪：上海山富科学仪器有限公司。

2.2实验方法

2.2.1 试剂配制

以下试剂配制均参考《现代分子生物学实验技术》(第二版)

PDA苯胺蓝培养基：含苯胺蓝0.1g/L，琼脂20g/L。

PDA愈创木酚培养基：含愈创木酚0.04%，琼脂20g/L。

DEPC水：吸出1mL放在1000mL双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000mL容量瓶中静置24小时用于处理仪器，高压灭菌用于配置试剂。

75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)

1MTris-Cl：121.14gTris-base溶于800mL水中，用冰乙酸调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。

0.5M EDTA：EDTA 186.1g溶于800mL水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。

10mg·mL-1溴化乙锭：在10mL水中加入100mg溴化乙锭，溶解后分装成1mL小份，4℃保存。5XTBE：Tris-base 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH8.0)20mL，加水至1000mL。

凝胶加样缓冲液：溴酚蓝0.4%，蔗糖60%。

2.2.2木质素降解酶的简单定性

PDA苯胺蓝平板退色试验[1]将试验菌接种于PDA苯胺蓝培养基平板，28℃下避光培养，记录蓝色培养基中有无退色现象的产生，有则记为+，反之记为-。+表示该菌株能产LiP 和MnP。

PDA愈创木酚平板显色试验[2]将试验菌接种于PDA愈创木酚培养基平板上后，置28℃下培养，每天记录有无红棕色变色圈的产生，有红棕色圈者记为+ 反之记为-。+表示该菌株能产Lac。

2.2.3 毛绒鬼伞（0901）菌丝体的培养、诱导及预处理

用接种环挑一环试管种接入盛有25 ml PDA液体培养基的250 ml三角瓶，置恒温摇床中，28℃，240 r／min振荡培养约4 d，菌丝体足量后加入250ul 100 mmol／L的2，5-二甲苯胺诱导漆酶基因的表达，24 h内收集菌体，用DEPC处理的dH O配制的PBS缓冲液清洗3次，滤干后迅速置于液氮中冻存10 min，备抽总RNA和总DNA[3]．

2.2.4 总DNA、总RNA 的抽提和mRNA 的纯化

分别参见TRIzol试剂和Oligotex mRNA Mini Kit操作手册[4]．

2.2.5 基因组步行

具体操作步骤详见Clontech公司Universal GenomeWalkerT Kit User Manua1

2.2.6 SMART TM RACE[5]

SMART TM 3'-RACE的原理

利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。(见Figure 1)

Figure 1.

SMART TM 5'-RACE

先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物

UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。

Figure 2.

实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为：

第一，在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每一步都可能导致失败；

第二，扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假

阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。

2.2.7 DNA的纯化。消化，连接和转化

见相应的试剂盒操作手册和文献[6]进行．

2.2.8 DNA测序

3实验结果

3.1 木质素降解酶简单定性结果

试验菌各接种至愈创木酚平板和苯胺蓝平板当天即记录平板的变色现象，记录如下表1

表1 木质素降解简单定性鉴定记录表

编号现象

培养基类型

愈创木酚 1

苯胺蓝 4

注：+表示出现相应变色反应；记录时间为每隔24h。

参考文献

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【清华】16柠檬酸循环习题与答案

16 柠檬酸循环习题与答案习题 1．丙酮酸脱氢酶复合物包括多少种酶？这些酶的作用分别是什么？ 2. 尽管 02没有直接参与柠檬酸循环，但没有 02的存在，柠檬酸循环就不能进行，为什么？ 3. 通过将乙酰CoA 乙酰基上的两个C 原子进行14C 标记来进行柠檬酸循环的研究。请问 14 C02 放射性强度比率如何。 (假设在第二次和第三次循环中加入的乙酰 CoA 不带任何放射性) 4. (a )假如将甲基碳用14C 标记的丙酮酸添加到线粒体的悬浮液中，那么一轮柠檬酸循环后， 14C 出现在草酰乙酸的什么位置？ (b) 为了使所有14C 以14 CO 2释放掉，需要进行多少轮柠檬酸循环(除了第一轮丙酮酸是标记的以外，以后进入柠檬酸循环的丙酮酸都不是标记的)？ 5. 如果各反应物浓度为：[NAD j/[NADH] = 8, [ a -酮戊二酸]=0.1mmol?L -1 ，[异柠檬酸]=0.02mmol?L -1。CO ?为标准状态，△ G °"=- 7.1 kJ?mol -1。计算在 25C 、pH7.0 时，异柠檬酸脱氢酶催化反应的△ G /。 6．虽然在标准状态下，由苹果酸脱氢酶催化的苹果酸氧化生成草酰乙酸是个吸能反应 (△ G °/= + 29.2 kJ?mol -1 ),但该反应在生理条件下容易进行。 (a) 说明反应容易进行的道理。 (b) 如果[NAD +]/[NADH] = 8, 25C 、pH7时能够使反应向草酰乙酸方向进行的 [苹果酸]/[ 草酰乙酸 ]最低比值为多少？ 7. 用捣碎的肌肉组织进行的早期实验表明，柠檬酸循环是需氧途径，通过此循环代谢的物质最终氧化成 C02。但是加入循环中间产物会导致消耗比预期多的氧气。当琥珀酸、苹 2)是否可能通过在肝脏组织匀浆液中加入草酰乙酸的方法来降低丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制效应？ 9、在不消耗柠檬酸循环中的任一成分的情况下，丙酮酸可以转换为转换中的平衡反应式，并给出辅助因子和需要的酶。 10. 脂肪可以降解为乙酰 CoA ，然后乙酰 CoA 进入柠檬酸循环。而葡萄糖可以由柠檬酸循环的中间产物草酰乙酸合成。为什么当人们锻炼后大量消耗了体内糖储备后，必须要通过吃饭补充经过一轮，两轮和三轮柠檬酸循环后，释放出来果酸和草酰乙酸加入肌肉匀浆液中时也有类似的现象。试解释在有足够的丙酮酸存在下，为什么这些中间物的加入会导致比预期多的氧气消耗。 & (1)在琥珀酸脱氢酶反应中，以 1/v 对1/[s] 作图(v=速度，[s]=底物浓度)，画出以下情况的反应曲线：(a )没有抑制物, (b )存在丙二酸 a -酮戊二酸。写出

现代简约室内家居毕业设计论文

美术与设计学院毕业创作（设计）说明类别《室内空间设计》姓名：学号：作品名称：专业/届别：指导老师：职称：

中文摘要本次设计为149平的家具设计图，是表达业主一种的生活态度。现代简约家居设计，是年轻喜爱的简约而很有个性、功能性的一种设计风格，该方案所选用的设计风格为现代简约风格，就是通过对比度，和空间的明亮感给人一种温馨时尚的浪漫气息。本次设计根据业主要求，以人为本不仅从居住的舒适性方面进行考虑，更考虑业主一天劳累奔波，通过颜色明亮让他回到家可以更快的缓解工作压力，忘却不悦越心情,符合业主的心里，摒弃一切复杂的装饰。关键词：家居设计、现代简约风格、简约时尚目录摘要.................................................................................I 前言 (1) 第一章室内设计的概述 (2) 第二章设计风格与构思 (3) 设计风格 (3) 设计构思 (4) 第三章设计作品陈述 (5) 客厅设计 (5) 主卧室设计 (5) 书房设计 (6) 餐厅设计 (7)

第四章总结 (8) 参考文献 (9) 附录 (10) 致谢 (15) 绪论（前言）在经济迅猛发展的今天，人们对居住空间的使用功能与审美功能提出了更新、更高的要求，人们可以根据自身喜好充分运用各种内饰与材料来创造个性化的室内空间。如今消费者更多追求的是环保化、个性化、简洁化的设计风格。并且追求的是一种对当今文化内涵的诠释，一种个性的表现。人们对自己的生活环境需求在不断提高。渴望得到一种简洁大方，崇尚舒适的空间，以此来转换精神的空间。本课题主要是通过对业主生活需求，从外型上，功能上，颜色布局和材料的选择配上合理设计，让业主业主不仅能感受到时尚现代简约而不简单的设计，又能让业主感受到家的温馨和港湾，让业主能回到家感受到宽敞明亮，忘却工作上的疲惫和都市的喧哗。第一章室内设计概述室内设计也称为室内环境设计，室内环境是与人们生活关系最为密切的环节。室内空间是根据空间的使用情况、所处的环境和相应的要求，运用科学的技术手段和设计方案，改造出功能合理、居住舒适、满足人们物质和精神需求的室内空间环境。这一空间环境具有利用价值，更能满足人们的功能要求，也反应了历史、建筑特色等因素。环境设计不仅给我们提供功能适宜空间，更重要的是提高了人们的生活

木聚糖酶的基因克隆及表达

木聚糖酶的基因克隆及表达木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。见表2。 3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高

小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性

植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@https://www.360docs.net/doc/c25694624.html, 收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性① 　张国李滨邹琦② (山东农业大学生命科学学院植物系泰安 271018) 摘要 Rubisco 活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco 活性的酶, 我们利用PCR 技术, 从小麦(Triticum aestivum )叶片cDNA 文库中克隆得到Rubisco 活化酶基因cDNA 片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot 表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco 活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco 活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco 活化酶, 小麦, 衰老 Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi ② (Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University , Tai’an 271018) Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from wheat (Triticum aestivum ). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence Rubisco 是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP 的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco 的活性, 如:底物RuBP 本身就是Rubisco 的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco 易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco 成为光合速率的限制因子, 因而也成为提高作物光合效率的研究目标。 Salvucci 等(1985)发现了Rubisco 活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase 活性; 也有人认为RCA 是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco 的活化状态实际是Rubisco 的失活速率和RCA 活化Rubisco 速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人

现代简约风格毕业设计论文

本次设计在设计中运用简洁的造型、明快的基调、和谐的陈设搭配,将人与家居环境融合起来,并体现现代家居生活的品质,以舒适作为室内装饰的出发点,舍弃复杂的造型和繁复的装饰,使总体空间大气、优雅而又整洁、宁静。色彩在室内装饰中是另一个重要的元素,虽然色彩的存在离不开具体的物体,但它却具有比较形态、材质、大小更强的视觉感染力,视觉效果更直接,根据空间使用者的职业和年龄,以及空间的氛围需求选择不同的色彩,以此创造相应的室内空间个性。在这个设计方案中现代简约风格在设计中得到了淋漓尽致的诠释。这种风格的家居没有花哨的装修,没有让人眼花缭乱的物件,摒弃了一切繁复的装饰。关键词室内装饰简洁色彩一、设计定位本次设计的案例中没有浓烈的色彩,没有烦琐装饰的居室风格。人在其中,能获得一种解放,一种不被环境包围的释然。于是,人和家具便脱离了空间的概念和谐相处,这就是现代简约居室的魅力。简约的居室一定不是花哨的,给人的感觉不是浓妆艳抹,而是宁静利索。简约的用色定义并不是只用单一种颜色,但是一般来讲,简约空间里的主题颜色不要超过两种,最好是一种,作为点缀的颜色面积一定要小,在整体设计中起到画龙点睛

的作用,但最好不要“喧宾夺主”。家装提倡天然的装饰材料,没有艳丽的色彩,没有过多的修饰,整体设计横平竖直,还原材料的本体。天然石材如大理石、花岗岩等,天然木材,这些材料来源于自然,拉近了人和材料、人和自然的距离,给人一种亲切感,整体极简现代。以自然为本、力求简洁是本案的设计定位。二、设计过程及分析根据以上原则,方案初步在设计初期的展开过程中,首先对原始图框进行深入的分析,划分所需的功能区域,整体地对平面设计功能做出一个结构功能划分图。 1.客厅由此确定了整个起居室的大致功能的布置,根据人的视觉及风水学的要求,摆放家具,并留出宽阔的位子方便人的流动。此次设计的客厅简洁大方,大气中也能透着家庭的温馨,米黄色的背景搭配黑色胡桃木的装饰体现了主人多元化的审美观。以简约为主的装饰。直接体现家庭成员利落的生活态度。仅有的一件装饰品便是墙上的装饰画,它的应用充分反映出主人的喜好和品位,并将客厅的色彩和比例元素纳入其中,整体关系协调,使客厅的气氛得到了升华。规划出一个全家人都喜欢的居家风格,让客厅成为全家人最喜欢的聚会场所,因此客厅的装饰变的尤为重要。

第九章20酵解和柠檬酸循环

人血浆中的葡萄糖大约维持在5mM。而在肌肉细胞中的游离葡萄糖浓度要低得多。细胞内的葡萄糖浓度为什么如此之低？临床上常用静脉注射葡萄糖来补充病人食物来源，由于葡萄糖转换为葡萄糖-6-磷酸要消耗ATP的，那么临床上却不能直接静脉注射葡萄糖-6-磷酸呢？答:因为进入肌肉细胞的葡萄糖常常被磷酸化，葡萄糖一旦磷酸化就不能从细胞内逃掉。在pH7时，葡萄糖-6-磷酸的磷酸基团解离，分子带净的负电荷。由于膜通常对带电荷的分子是不通透的，所以葡萄糖-6-磷酸就不能从血流中进入细胞，因此也就不能进入酵解途径生成ATP。把C-1位用14C标记的葡萄糖与能进行糖酵解的无细胞提取物共同温育，标记物出现在丙酮酸的什么位置？答: 被标记的葡萄糖通过葡萄糖-6-磷酸进入酵解途径，在果糖-1.6二磷酸被醛缩酶裂解生成甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮之前标记始终出现在C-1。因为磷酸二羟丙酮含有最初葡萄糖分子的C-1至C-3原子，因而它的C-1带有标记。然后磷酸二羟丙酮异构化变为甘油醛-3-磷酸，最终14C出现在丙酮酸的甲基上。增加以下各种代谢物的浓度对糖酵解有什么影响？（a）葡萄糖-6-磷酸（b）果糖-1.6-二磷酸（C）柠檬酸（d）果糖-2.6-二磷酸答：（a）最初葡萄糖-6-磷酸浓度的增加通过增加葡萄糖6-磷酸异构酶的底物水平以及以后的酵解途径的各步反应的底物水平也随之增加，从而增加了酵解的速度。然而葡萄糖-6-磷酸也是己糖激酶的一个别构抑制剂，因此高浓度的葡萄糖-6-磷酸可以通过减少葡萄糖进入酵解途径从而抑制酵解。（b）果糖-1.6-二磷酸是由磷酸果糖激酶-1催化反应的产物，它是酵解过程中主要的调控点，增加果糖-1.6-二磷酸的浓度等于增加了所有随后糖酵解途径的反应的底物水平，所以增加了酵解的速度。（c）柠檬酸是柠檬酸循环的一个中间产物，同时也是磷酸果糖激酶-1的一个反馈抑制剂，因而柠檬酸浓度的增加降低了酵解反应的速率。（d）果糖-2,6-二磷酸是在磷酸果糖激酶-2（PFK-2）催化的反应中由果糖-6-磷酸生成的，因为它是磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的激活因子，因而可以增加酵解反应的速度。在严格的厌氧条件下酒精发酵过程中，使用放射性标记的碳源进行示踪原子实验。（a）如果葡萄糖的第1个碳用14C标记，那么14C将出现在产物乙醇的哪个位置上？（b）在起始的葡萄糖分子的哪个位置上标记14C ，才能使乙醇发酵释放出的二氧化碳都是14C标记的 14CO2。答：（a）14CH3-CH2-OH（b）3,4-14C-葡萄糖当肌肉组织激烈活动时，与休息时相比需要更多的ATP。在骨骼肌里，例如兔子的腿肌或火鸡的飞行肌，需要的ATP几乎全部由嫌氧酵解反应产生的。假设骨骼肌缺乏乳酸脱氢酶，它们能否进行激烈的体力活动，即能否借助于酵解反应高速率生成ATP？

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析周xx,xx 班级摘要广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。材料与方法青杄植物材料实验结果通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得生物信息学分析组织特异性表达胁迫处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析讨论目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。林学院第五届学生学术论坛

柠檬酸合酶试剂盒说明书(25管24样)(分光光度法)

货号：QS1005-25 规格：25管/24样柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义： CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。测定原理： CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水试剂组成和配制：试剂一：液体25mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体5mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：液体0.5mL×1支，-20℃保存；试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入800μL无水乙醇，用不完的试剂4℃保存一周；试剂六：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加入400μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；试剂七：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入800μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： ①称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 ②将匀浆600g，4℃离心5min。 ③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 ④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。 ⑤在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、将试剂四、五、六和七在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析周xx,xx班级摘要广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析讨论目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。林学院第五届学生学术论坛

柠檬酸合酶(CS)活性检测试剂盒说明书可见分光光度法

柠檬酸合酶（CS）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。货号：BC1060 规格：10T/5S 产品简介： CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。 CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸光值。试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。产品内容：提取液：液体5mL×1瓶，-20℃保存；试剂一：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体0.1mL×1支，-20℃保存；试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存；试剂四：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入1mL双蒸水，用不完的试剂仍4℃保存；试剂五：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入500μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入1.5mL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；操作步骤：一、样本前处理组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2将匀浆液600g，4℃离心5min。 3将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS。 5在沉淀中加入200μL试剂一和2μL试剂二，反复吹打充分混匀，用于CS测定。 6柠檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热10min左右（保证无沉淀）。 3、操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入试剂名称（μL）测定管对照管试剂三860930 试剂四3535 试剂五35- 样本3535 试剂六35-将上述试剂按顺序加入1mL玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，记录412nm波长下10秒时的初始吸光度A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，412nm下记录2分10秒时的吸光度A2，上清液、沉淀的测定管、对照管均需测量(每个样本需测4管)。计算上清液的测定管ΔA1=A2-A1，上清液对照管的ΔA1’=A2-A1，沉淀的测定管ΔA2=A2-A1，沉淀的对照管ΔA2’=A2-A1，计算ΔA上清=ΔA1-ΔA1’，计算ΔA沉淀=ΔA2-ΔA2’。注意事项： 1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。 2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。 3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 CS活性计算：

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.360docs.net/doc/c25694624.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.360docs.net/doc/c25694624.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）：李文利， E-mail： biolwl@https://www.360docs.net/doc/c25694624.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.360docs.net/doc/c25694624.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.360docs.net/doc/c25694624.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析尹恒余琴鸯安利佳李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024 摘要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分，在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因，命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp，编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明，该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸，缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明，该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处，预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明，该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下，表达量出现显著变化。关键词：谷子；干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明，泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族，包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域，在SCF 型E3介导的蛋白降解中，起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合，通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结构域的下游，常常伴随一些重要的次级元件，如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因，占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白，根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发

柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)试剂盒使用说明

柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒使用说明分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。货号：BC1060 规格：50管/48样产品内容：试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：液体1mL×1支，-20℃保存；试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×2支，4℃保存，临用前加入800μL无水乙醇，用不完的试剂4℃保存一周；试剂六：粉剂×4支，-20℃保存，临用前加入400μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；试剂七：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加入800μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；产品说明： CS（EC2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水操作步骤：一、样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：（1）称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。（2）将匀浆600g，4℃离心5min。（3）弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。（4）上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。（5）在步骤（4）中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、将试剂四、五、六和七在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。 3、样本测定试剂名称（μL）测定管试剂四780

基因克隆的几种常见方法

基因克隆的几种常见方法基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/c25694624.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/c25694624.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶 Abstract Citric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate 1. 课题背景 1.1柠檬酸简介[1]