维生素D3的含量检验方法
维生素D3的含量检验方法
含量检验操作规程,保证分析结果的准确性。一、目的:建立维生素D
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二、依据:GB/T 5413.9-1997
三、范围:本规程适用于本公司维生素D
含量检验操作
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四、职责:质量检验员对本标准的实施负责
五、正文:
1、试制和溶液
1.1 高峰氏淀粉酶(Taka-Diastase)
1.2 异丙醇:色谱纯
1.3 焦性没食子酸的乙醇溶液15g/L
1.4 氢氧化钾溶液:质量比100:50
1.5 石油醚:沸程30~60
1.6 甲醇:重蒸后使用。
1.7 正己烷:色谱纯。
1.8 环己烷:色谱纯
1.9 维生素D3标准储备液:含维生素D3100ug/ml(称取10mg维生素D3,用甲醇定容于100ml量瓶中)
1.10 维生素D3标准工作液:取维生素D3标准储备液1ml于100ml量瓶中,用甲醇定容。
2、实验室常用仪器。
2.1 高效液相色谱仪:具有可变波长的紫外分光检测器、数据处理系统或记录仪。
2.2 平底烧瓶:250ml
2.3 分液漏斗:500ml
2.4 旋转蒸发器。
3 分析步骤
3.1 试样处理
准确称取10g样品,放入250ml平底烧瓶中,加入1gTaka淀粉酶(3.1),再加入30ml45~50℃的蒸馏水,混合均匀后,用氮气排除瓶中空气,盖上瓶塞,置45℃烘箱内30min,于上述样品中加入100ml没食子酸的乙醇溶液(3.3),充分混匀后加入50ml氢氧化钾溶液(3.4),在蒸汽浴上回流30min后,立即冷却到室温。将冷却后的皂化液转入500ml分液漏斗中,用100ml水分几次冲洗平底烧瓶,洗涤液并入分液漏斗中;于分液漏斗中加入100ml石油醚(3.5),盖好瓶塞,倒置分液
漏斗并剧烈振摇1min,静置分层,将水相放入另一500ml分液漏斗中。重复上述萃取过程二次,合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗至中性,通过无水硫酸钠过滤干燥,在40℃和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近干后,用石油醚转移至10ml量瓶中,定容。吸取7ml醚液至一试管中,用氮气将醚液吹干,加入1ml 正己烷,即得供试品溶液。
3.2测定
3.2.1测定液的制备
仪器条件
色谱柱:30cm×40mm,硅胶柱
流动相:环己烷(3.7)与正己烷(3.8)按体积比1:1混合,并按体积
分数0.8%加入异丙醇(3.2)
流速:1ml/min
波长:265nm
柱温:20℃
灵敏度:0.005AU/MV
注射体积:200ul
制备:注射50ul维生素D标样和200ul样品溶液(试管B),根据维生素D
标样的保
留时间收集维生素D与试管C中,将试管C用氮气吹干,准确加入0.2ml甲醇(3.6)溶解。
3.2.2 测定步骤
仪器条件
色谱柱:25cm×4.6mm,C18或等同性能的色谱柱
流动相:甲醇
流速:1ml/min
柱温:20℃
波长:265nm
灵敏度:0.005AU/MV
注射体积:50ul
注射50ul维生素D标准溶液,注射50ul样品溶液(试管C中),得到标样和样品溶、液中维生素D峰面积或峰高
4、计算:
Cs ×10/75 ×100 ×40
m ×1000
样品中维生素D(IU/100g) =
Cs = × C sd
式中:Cs —进样液中维生素D 的质量浓度,ug/ml
m —样品的质量,g A S —进样液中维生素D 的峰高(或峰面积) A Sd —标样中维生素D 的峰高(或峰面积) C sd —标样中维生素D 的质量浓度,ug/ml
计算结果精确到小数点后一位。
A S A Sd