利用SSR标记鉴定两系杂交稻“广两优7203”的种子纯度
初探种子纯度检验方法
初探种子纯度检验方法 近几年来，随着生化分析和分子生物学技术的迅速发展，作物种子纯度检验方法已由外观形态发展到生理生化水平和分子水平上的鉴定。 一、蛋白质电泳技术检验法 是指利用电泳技术对备检样品的种子或幼苗的蛋白质 进行分离、染色，形成蛋白质电泳谱带的差异，并与标准品种相比较，从而鉴定品种的真实性和纯度的一种方法。不同作物品种，基因不同，基因的直接表达产物---蛋白质在种类、数量、结构等方面亦不同。该法即是利用蛋白质的多态性来反映不同品种DNA组成上的差异，从而进行品种鉴定。该法快速、可靠，不受环境影响。 1.种子贮藏蛋白电泳法种子中所含的贮藏蛋白质可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一类蛋白质的比例因物种而异，但在品种鉴定上多是根据醇溶蛋白（禾谷类）和球蛋白（豆类）的多样性。不同蛋白质所带电荷不同，在电场中泳动的速度也不同，电泳之后，通过染色显示蛋白质条带的数目、位置和颜色深浅，便构成品种的"指纹" 特征，可用于品种鉴定。所用电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉胶电泳及等电聚焦电泳等。另外，蛋白质电泳图谱易受
种子（或幼苗）发育阶段及表达器官的影响，有时不够稳定，影响了图谱分析，从而影响了鉴定结果的准确性。 2.同工酶电泳法同工酶是指来源相同，催化相同反应而结构不同的酶分子类型，具组织、发育和品种间特异性。该法是指利用电泳技术（包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉胶电泳等）来分离各种酶的同工酶，通过比较同工酶谱，来确定作物种子的纯度。目前，在作物种子纯度鉴定中，最常用的、多态性较强的是脂酶和过氧化物酶，所用方法多为聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 2.1同工酶具组织、发育的特异性：不同组织、不同发育时期，同工酶的数量和组成不同。利用同工酶鉴定种子纯度所用材料多为幼苗，而将种子萌发为幼苗不光费时，还往往因为种子在萌发进程上的不一致而导致检验结果偏差较大。 2.2因酶易失活，故技术上有一定难度。 2.3谱带位点与凝胶浓度、提取液配方、电泳程序等有关。 二、形态捡验法 形态学方法是检验人员借助放大镜、解剖镜等工具，依据某一作物品种不同于其他品种的特定的外观形态特征来进行鉴定的方法。 1.田间小区种植检验法（成株期形态检验法）该法是将
水稻种子的纯度鉴定
题目：水稻种子纯度鉴定 指导教师：刘开庆、郭丽红 学院：昆明学院 专业班级：生科系07生科班 学号：S007084111 姓名：田洁 日期：2009年7月1日 [摘要]植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质营养，否则植物就不能很好的生长发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养做植物的营养实验，可以避免土壤里的各种复杂因素。 [关键词]微量元素；矿质元素；植物 引言 种子纯度是评定种子等级的主要依据，是种子检验工作的重点项目。近年来，电泳技术在种子纯度鉴定上开始应用。
用该项技术鉴定简便，快捷，准确且成本低。本实验正是运用酯酶同工酶技术进行鉴定。 正文 一．实验原理 同工酶是指植物体内肽链结构不同，分子大小不同，但活化部位相同，催化同一生化反应的酶谱带是指同一种酶的各种同工酶。在一定的电场作用下发生泳动，通过一定的化学染色而出现的图像。一个品种的遗传基础是一定的，其同工酶谱带应具有一定的特征。本实验的基本原理是不同的酯酶同工酶由于其分子量不同，分子结构不同和其所带的电荷数不同，在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下，呈现不同的泳动速度而相互分离，再根据酯酶同工酶催化反应和相同的特点，使用相同的特点，使用同一显色方法，获得供试样用品谱带，以供分析鉴别。 一.器材与试剂 1.试验仪器电泳仪，双垂直电泳槽及配套的平板玻璃，文具铁夹，冰箱，离心机，研钵，离心管，微量进样器，实验室常用器皿。 2.实验材料水稻种子 3实验试剂20%SDS ，30%Acr-Bis ，10%APS ，1.5mol/L Tris-HCl(ph=8.8) ，0.5mol/L Tris-HCl(ph=6.8 ，5*电极缓冲液，脱色液（200ml）*2 ，染色液（20 0ml），分离胶，浓缩胶分析天平， 三.实验步骤 1．样品提取 2．胶室的制作和凝胶的配制
SSR分子标记简介
微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为 居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点，并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外，本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状，并进一步提出其发展前景。 关键词：微卫星DNA；微卫星DNA标记；遗传多样性 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中，重复序列占有很大比重（＞50%）。按照重复序列在染色体上的分布方式，分为散布重复和串联重复（VNTR）两种类型。散布重复序列的拷贝数很多，在重复单位之间彼此常有序列的变化，难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中，卫星序列的重复单元大，一般分布在染色体的异染色质区，采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难；小卫星序列主要存在于染色体近端粒处，通常以15~75个核苷酸为核心序列，长度从几十到几千个碱基不等；微卫星序列一般较短，属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。 微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列（SSRs）或简单串联重复序列多态性（STRP）。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段（1-5个碱基）组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的，它极其丰富，分布在整个基因组中[1]。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG（这里N 代表G、C或T）的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现，并且通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2]。（AT）n和（A TT）n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列，它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区，而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中，约29kb中有20bp的微卫星序列[4]，例如鹰嘴豆中（TAA）n、（GA） 和（CA）n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5]；而动物中，约每6kb中就n 有20bp的微卫星重复序列。另外，研究还发现植物中最丰富的微卫星是（A）n，其次是（AT）n，再次是（GA）n。
第七章 田间检验与种子纯度的种植鉴定
第七章田间检验与种子纯度的种植鉴定 （本章属田间检验员专业技术知识） 本章讲4节：§1.品种特征特性 §2.田间检验 §3.田间小区种植鉴定 §4.种子质量纠纷田间现场鉴定 第一节田间检验及种子纯度种植鉴定依据的性状 （品种特征特性） 鉴定品种真实性和纯度，首先应了解被鉴定品种的特征、特性，来鉴别本品种和异品种。 品种性状可分为主要性状、次要性状、特殊性状和易变性状4类。 主要性状：指品种所固有的不易变化的明显性状，如小麦的穗形、芒长等。 次要性状(细微性状)：指细小、不易观察但稳定的性状。如小麦护颖的形状、颖嘴。 特殊性状：指某些品种所特有的性状。如水稻中的紫米（有籼粳之分）、香稻（气味）等。。 易变性状：指容易随外界条件的变化而变化的性状.如生育期(与积温有关：郑单958 95～120d)、分蘖多少（与种植早晚有关）。鉴定时应抓住品种的主要性状和特殊性状，必要时考虑次要性状和易变性状。 鉴定品种的具体性状都是依据器官的大小、颜色、形状等鉴定。 下面讲山东省大面积种植的主要农作物： 一、小麦（同p100） （一）．植株性状 1.芽鞘色：绿色和紫色（区分品种纯度明显的性状） 2.幼苗生长习性：匍匐；直立；半匍匐（冬麦越冬前观察）
3.幼苗颜色：淡绿、绿色、深绿色（分蘖盛期观察） 4.柱高：61～80cm为矮；81～100cm为中等；101～120cm为高秆。 5.株型：抽穗后根据主茎与分蘖的松散程度分为三类： 紧凑: 主茎与分蘖垂直夹角＜15℃ 松散：主茎与分蘖垂直夹角＞30℃。介于二者之间为中等。（二）．穗部性状 (1)穗长(cm不含芒)： 6.1～8.0为短；8.1～10.0为中等；10.1～12.0为长. （2）穗形：纺锤形（两头尖，中间稍大）；棍棒形（上大、下小）； 圆锥形（下大、上小）；长方形（上中下基本一致）； 椭圆形（穗短、中部宽、两端稍小）。 （3）芒：稃尖完全不延长为无芒。有直芒或曲芒为有芒。 （4）芒长：长芒＞40mm,短芒＜40mm. （5）穗粒数：＜25为少；26～35为中；36～45为多；＞45为特多。
种子检验
一、概念 1.种子检验：是利用规定的程序对种子样品的质量指标进行分析、鉴定，判断和评价种子批利用价值的活动。 2.播种品质：指影响播种质量的种子质量性状。 3.品种品质：指与品种的遗传基础有关的种子质量性状。 4.田间检验：是指在种子生产过程中，在田间对品种真实性进行，对品种纯度进行鉴定，对作物生长状况、病虫危害、异作物和杂草等情况进验证行调查，并确定其与特定要求符合性的活动。 5.田间小区种植鉴定： 6.原种： 7.育种家种子： 8.良种： 9.大田用种： 10.品种真实性：是指一批种子所属品种与文件(品种证书、标签等)是否相同，是否符合其实。 11.品种纯度：是品种在特征、特性方面典型一致的程度，用本品种种子数占供检本作物种子数的百分率表示。 12.扦样：是指利用专用的扦样器具，从袋装或散装的种子批中扦取适量有代表性、供分析检验用的样品的过程。 13.种子批：指同一品种、同一来源、同一年度、同一时期收获、质量基本一致，在规定数量之内的种子群体。 14.初次样品：又称小样，是指从一批种子的某个扦样点扦取到的一小部分种子。 15.混合样品：又称原始样品，指由同一种子批中所扦出的全部初次样品混合而成的样品。 16.送验样品：又称送检样品或平均样品，指从混合样品中分取、送到种子检验机构进行检验，数量符合要求的样品。 17.试验样品：简称试样，是由送验样品分出，供检验种子品质具体项目用的样品。 18.半试样：将试验样品分成为规定重量一半的样品。 19.发芽：在实验室内幼苗出现和生长达到一定阶段，其主要构造的状态，表明在田间适宜条件下能否进一步生长成为正常的植株。 20.发芽力：指种子在适宜条件下发芽并生长成正常植株的能力。通常用发芽势和发芽率表示。 21.发芽势：指在种子发芽试验初期长成的全部正常幼苗数占供检种子数的百分率。 22.发芽率：指在种子发芽试验末期长成的全部正常幼苗数占供检种子数的百分率。 23.正常幼苗：指生长在良好的土壤、适宜的水分、温度和光照条件下，具有继续生长成为正常植株潜力的幼苗。 24.不正常幼苗：指生长在良好的土壤、适宜的水分、温度和光照条件下，无继续生长成为正常植株的潜力的幼苗。 25.未发芽种子：在规定的条件下试验时，在试验末期不能发芽的种子，包括硬实、新鲜未发芽种子、死种子和其它类型。 26.新鲜未发芽种子：在发芽试验条件下，既非硬实，又不发芽而保持清洁和坚硬，具有生长成为正常植株潜力的种子。 27.种子含水量：种子中含有的水分重量占种子种子重量的百分数。 28.种子生活力：种子发芽的潜在能力或种胚所具有的生命力，通常是指一批种子中具有生命力种子数占种子总数的百分率。 29.种子活力：通常指田间条件下的出苗能力及与此有关的生产性能和指标。
SSR标记的原理
简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR) 1.简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 2.SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。 3.SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 4.SSR的分类 根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型： 完全型(perfect)。指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT
不完全型(imperfect)。指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATA T 复合型(compound) 。指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 3种类型中完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。 5.SSR在植物基因组中的分布 SSR广泛分布于各种真核生物的基因组中，大约每隔10～50kb 就存在一个SSR。哺乳动物中的SSR的数量大约为植物中的5～6倍。在植物中，平均23.3kb就有一个SSR；双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物，前者两个SSR之间的平均间距为21.2kb，后者为64.6kb；核DNA中的SSR数量多于细胞质DNA中的SSR，绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。 6.微卫星的利用价值 由于核心序列重复数的不同，等位的SSR位点可呈现出多态性（SSLP，simple sequence length polymorphism）。大多表现为共显性遗传，有的表现为显性遗传。由于SSR DNA两侧序列（离开20bp 以上）表现出保守特征，所以可设计出上下游PCR引物，扩增出包
SSR标记的原理步骤
SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。 微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。 SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。? 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性； (4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共同进行STMS引物的开发。 操作步骤 1、在25μl反应体系中，加入 模板DNA 1μl（20ng）； SSR引物1μl（0.15μM） 10×PCR缓冲液2.5μl MgCl2 2μl (25mM) dNTP 2μl (0.2mM) Tap 酶1单位 加ddH2O至25μl 2、反应在PE 9600热循环仪上进行。PCR反应先95℃变性4min,接着94℃45s、55℃30s 和72℃60s,35个循环,最后在72℃下延伸5min。PCR扩谱产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离。点样时,样品量为5μl,电泳缓冲液为1×TBE,电泳工作电流50mA,电压1500V,时间约2～3h。DNA染色采用银染法。电泳结束后,凝胶连同胶板一起,经过固定、染色、显影、固定等步骤染色。电泳和银染具体操作与AFLP相似。 3、数据分析： 用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。
种子企业应用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度
利用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度在企业中的应用黄殿成1王飞2刘建功1,2 刘金海1 周关印1,2 李根源1 张西岭1 (1中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455001；2中棉种业科技股份有限公司，郑州450001) 中文摘要：本文阐述利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理，剖析中棉种业科技股份有限公司利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的实践过程，指出利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度在企业中发挥的作用。 品种真实性和种子纯度是种子质量最重要的指标。传统的通过田间小区种植利用形态特征鉴定种子纯度的方法，具有周期长、易受环境和人为因素影响、属于事后控制等缺陷，与种子企业需要快速检验结果的要求不相适应，难以有效消除种子企业的质量风险。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的技术逐步成熟，中棉种业科技股份有限公司（以下简称中棉种业）在利用分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度的反复实践中，逐步形成了自己的检验规程，在企业经营中发挥了较好作用。 1 利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理 生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、串联排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成(如编码rRNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列不完全相同，可表现出多个位点的多态性。基于这一想法，人们发 1 基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP -201X-CCRI 通信作者：张西岭
EST-SSSR分子标记的建立
课程名称： 分子育种学 指导老师： 海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型 分工： 奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析 一、实验目的和要求 1、了解SSR 标记的开发策略； 2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理； 3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。 二、实验容和原理 1、实验容 通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA 真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。 微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。 重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略 SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列的SSR ，不包括含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。 建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性； （4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。 近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。
SSR标记实验步骤
SSR标记实验步骤 简介： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。 操作程序： 取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记
1、DNA提取 按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下： ①成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存； ②加入600ul 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30～60分钟； ③取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇； ④12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中； ⑤加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液； ⑥干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE 2、PCR扩增 模板DNA的浓度大约25ng/ul，扩增反应体系为20ul。具体如下：Sterile ddH2O 11ul PCR Buffer 3ul dNTP-mix 0.5ul Primer1 1ul Primer2 1ul Taq polymerase 0.5ul(2U/μL) DNA 3ul PCR扩增程序为：（2h30min）
SSR分子标记遗传分析
SSR分子标记遗传分析 实验原理： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高 实验材料： 欧美山杨杂种幼嫩叶片 实验器具、药品： 模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统 SSR引物及退火温度 位点Loci 重复单元 Repeat unit 引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′) 退火温度 T(℃) PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R) 63℃ PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F) TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R) 49.4℃ PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F) A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R) 55.4℃ 实验步骤： 1.总DNA的提取 采用CTAB法提取植物总DNA （1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热； （2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末； （3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀； （4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清； （6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质； （7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA； （8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。 2.总DNA的检测
玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法
辣椒种子纯度 SSR分子标记鉴定技术规程 编制说明 沈阳市农业科学院 2017年5月
《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》 标准编制说明 一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作； 2016年5月沈阳市农业科学院通过辽宁省农村经济委员会和沈阳市质量监督局向辽宁省质量技术监督局提交《项目建议书》，建议编制《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》标准。经审查及公示，项目被列入辽宁省地方标准制修订2017年度计划，立项编号为2016073，沈阳市农业科学院为项目承担单位。 项目立项后，项目承担单位成立了标准起草小组，落实了标准起草经费，提供了必要的工作条件。标准起草小组的成员有：杨双、张曼丽、刘延斌、李金凤、马东梅、潘菊、胡颖、孙嘉兴、李雪、宋伟。杨双为技术总负责；李金凤、马东梅负责标准样品收集；潘菊、胡颖负责技术资料检索；刘延斌、孙嘉兴、李雪负责标准技术参数确定。标准起草小组在批准立项的一个月内制定了具体的标准起草计划。按照计划，2016年12月前完成资料收集、相关调研及试验验证；2017年4月聘请省内农业专家对征求意见稿进行修改；5月完成意见整理、分析和处理，填写地方标准征求意见汇总表；5月申请专家审查。 二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则）的依据。地方标准修订项目，还应列出和原标准主要差异情况；
辣椒(Capsicum annuum L.)是辽宁省八大蔬菜作物之一，省内广泛种植，随着辣椒杂交种的种植面积不断扩大，种子纯度问题显得尤其重要。在辣椒制种过程中，无论使用两系杂交或者三系杂交，杂交一代种子中易于混入母本种子。由于亲本的生产力弱，产量低，纯度不够的种子对辣椒生产造成影响。在辣椒生产过程中，常常出现因种子纯度不高造成产量降低、品质变劣，商品性不好，严重影响经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。目前鉴定辣椒种子纯度一般采用田间种植或室内酯酶同工酶电泳等方法，这些方法虽简便易行，但田间种植仅靠形态观察较难做到准确判断，且耗时长，同工酶检测也会因环境和发育时期而发生变化，导致电泳结果不易判读。建议制定基于DNA多态性，依托SSR分子标记技术，具有快速、准确、易操作等特点的鉴定辣椒种子纯度技术规程，适用于省内主栽的辣椒品种的纯度鉴定，提高商品种子质量，为质量监督管理部门提供参考，同时也为辣椒品种指纹图谱的建立和品种知识产权的保护打下基础。 SSR（Simple Sequence Repeat）是一类由几个（多为1-6个）碱基组成的基本单元串联重复形成，广泛存在于真核生物的基因组中。由于个体基因组中每个SSR位点的重复单元在数量上存在多态性，可用于鉴别不同个体。基因组中这些SSR位点的侧翼DNA片段通常都是保守性较强的单一序列，可以根据侧翼的DNA片段的碱基序列设计引物，进行PCR扩增，将单个SSR位点扩增出来。不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生多态性，可用来鉴别不同个体。
SSR标记电泳
3.1.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶分离可以达到几个碱基，以便真实的反应各样品的多态性，本实验采用用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离。 3.1.2. 4.1 凝胶的制备 （1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥，备用。 （2）电泳凝胶的配制（常用6％和8％的非变性凝胶）： （4）按表4中顺序加入各组分（注意：TEMED一定要最后加入），充分摇匀后用注射器将配好的胶轻轻灌入好两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。若有漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置室温让其聚合1h以上。 3.1.2. 4.2 扩增产物的电泳 （1）电泳缓冲液：待凝胶聚合完后，在电泳槽中加入1×TBE（用5×TBE稀释）的电泳缓冲液。 （2）上样：1.5-2μl，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔中，尽量缩短加样时间。 （3）电泳：将梳子轻轻拔出，170V预电泳1.5-2小时(50bp左右的用1个半小时）。电泳结束后，切断电源，卸下玻璃板，准备染色。 3.1. 4.2.3 扩增产物的快速银染显色 非变性聚丙烯酰胺电泳的银染方法参考Sanguinetti等1994并经改进简化如下：
（1）漂洗：在塑料盘中加入200ml蒸馏水漂洗1次，再加入200ml蒸馏水。染色：加入2ml 10％AgNO3 (10g AgNO3加入到100ml蒸馏水中)后，平行摇动5～8min。 （2）漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2～3次，洗净后，倒掉蒸馏水。（3）显色：在瓷盘中加入200ml蒸馏水，10ml 30%NAOH和2ml甲醛，迅速振动，使显影液均匀作用，然后平行摇动10分钟左右，直至显影。 （4）洗涤：清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1～2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。 （5）保存：用蒸馏水冲洗干净，放在胶片上吸干水，上面盖上保鲜膜，统计带型，并照相或扫描。
EST-SSSR分子标记的建立
课程名称： 分子育种学 指导老师： 崔海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型 分工： 谢奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析 一、实验目的和要求 1、了解SSR 标记的开发策略； 2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理； 3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。 二、实验内容和原理 1、实验内容 通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA 真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。 微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。 重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略 SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列内的SSR ，不包括内含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。 建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性； （4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。 近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。
玉米种子纯度检验技术
种子纯度检验是质量检验的中心，是对一批玉米种子中个体与个体之间在特征特性方面典型一致性程度的检验和种子真实性的鉴定。一般有田间检验、室内检验和种植检验三种。 1.品种纯度田间检验 田间检验是三大检验的重中之重。种子质量的高低主要是在田间生产过程中形成的，做好制种田间检验对于确保种子质量显得格外重要。要想做好田间检验，要做到以下几点： ①掌握被检品种组合亲本各生育期的特征特性，收集有关地区主要品种组合同名异源亲本种子、植株标准样品、有关资料和图册。 ②掌握最佳田检时期。一般分苗期、花期和成熟期三期进行，花期是关键。苗期检验性状为幼苗叶色、叶鞘颜色、叶型，花期为株高、茎秆粗细、叶片形状、叶片数及上冲程度、花药色、花丝色、雄穗护颖颜色及主轴长度、分枝多少等，成熟期为穗位高低、双穗率、穗型、穗轴颜色、粒型、粒色、果穗苞叶长度等。 ③掌握安全隔离。无论是空间隔离、时间隔离或障碍物隔离，一定要控制外来花粉干扰，防止生物学混杂。 ④掌握正确的田检方法。在对基本情况了解的前提下，要正确划分检验区和设点取样。一个检验区的最大面积为33.3公顷；0.7公顷以下5点取样,0.7～6.7公顷为8点取样, 6.7～13.3公顷为11点取样,13.3～33.3公顷为15点取样。每点最株数不低于200株。取样点分布方式因地块形状和大小可选择棋盘式、梅花式或方格式等，但取样点距地块边缘必须在5米以上。 2.品种纯度室内检验 种子在收获、脱粒、加工等过程中都有可能造成机械混杂，因此，在田检基础上必须进行品种真实性和一致性检验。室内检验杂交玉米种子纯度常用的方法主要有籽粒形态法、幼苗形态法和电泳法。 ①种子形态鉴定法是根据粒色、粒型、粒质、顶部凹陷和饱满状况、胚的形状与大小、籽粒表面圆滑程度、棱角的有无、稃色和花丝遗迹等特征进行鉴定的。其特点是快速、简单、经济。但因主要依据籽粒外部形态特征，由感官鉴别，对一些外部形态差异不大的品种鉴别准确性较差，在应用上存在一定的局限性。 ②幼苗形态鉴定法主要是以幼苗表现出的不同特征为依据面进行的检验，可根据芽鞘的颜色和长短、叶色、叶型、叶上茸毛的多少，中胚轴和近根处颜色、次生根的粗细、长短和多少等综合鉴别。幼苗形态鉴定可与发芽率鉴定一并进行，方法简单易行。但受环境因素及籽粒大小饱满程度的影响较大，容易引起较大的误差。不过，几是杂交的籽粒都具有杂种优势，其长势旺盛，如茎根比未杂交的粗壮，长得也快，次生根也多，用区别杂粒与自交粒还是很适用的。 细幼苗形态鉴定可与籽粒形态鉴定结合进行。在籽粒形态鉴定的基础上，将形态特征一致的籽粒进一步进行幼苗形态鉴定，可减少鉴定误差，提高鉴定的准确性。据种子站多年试验，籽粒形态与幼苗形态两者结合鉴定，一是适宜的品种范围广些；二是准确度也有较大提高，鉴定结果与田
实验七小麦玉米品种田间纯度鉴定完整版
实验七小麦玉米品种田 间纯度鉴定 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
实验七小麦、玉米品种田间纯度鉴定 一、目的 掌握小麦、玉米等主要农作物育种过程中品种纯度的鉴定方法。 二、内容说明 品种纯度，指品种一致性的程度。(在形态特征、生理特征性方面典型一致的程度，即供检样品中本品种的株（穗）数占供检该作物样品总株（穗）数的百分率)。它是种子质量的重要指标之一，是评定种子等级的主要依据。 品种纯度检验分田间检验和室内检验，田间检验以品种纯度为主，同时检验异作物、异品种、杂草、病虫感染率、作物生长发育情况等。 田间检验是以作物植株高度，叶片、穗部、芒、籽粒、护颖的性状和颜色，以及成熟迟早等差异为依据，进行分析鉴定。 田间品种纯度检验时期，以品种特点、特征、特性表现最明显的时期为宜。稻麦可分别于幼苗期、抽穗期开花期和蜡熟期检验。如果条件有限，至少应在蜡熟期检验一次。苗期检验结果供定级参考用，花期、成熟期的检验结果作为定级依据。如三次结果不同，要按最低的一次检验结果定级。 （补充）田间检验：一般在作物品种形态特征表现最明显的时期，如禾谷类作物黄熟期、大豆结荚期、薯类收获期进行检验。凡同一品种、同一种子等级和来源一致、栽培管理大体相同者，可作为一个检验区。每个检验区再选有代表性的地块，面积不少于检验区的5-10%，块数不少于3块，并均匀分布。在选好的代表性地块上设点取样，一般用梅花式、单对角线式、双对角线式或棋盘式取样法。代表性地块在5亩以上的，最少设点5个；在50亩以上的，每增加25亩增设样点一个。麦类每点取样20-40穗。玉米、高粱、谷子、糜黍、马铃薯每点取样20株。豆类每点取样10-20株。取样总数随代表性地块面积大小而定，一般以100-1000穗，或50-500株为限。 取样后，根据品种特征，鉴别本品种的株（穗）数、异品种的株（穗）数和其它作物株（穗）数，计算出该品种的田间纯度。 田间品种纯度（%）=本品种株（穗）数/供检总株（穗）数×100 种子纯度检验是质量检验的中心，是对一批种子中个体与个体之间在特征特性方面典型一致性程度的检验和种子真实性的鉴定。一般有田间检验、室内检验和种植检验三种。 1.品种纯度田间检验 田间检验是三大检验的重中之重。种子质量的高低主要是在田间生产过程中形成的，做好制种田间检验对于确保种子质量显得格外重要。要想做好田间检验，要做到以下几点： ①掌握被检品种组合亲本各生育期的特征特性，收集有关地区主要品种组合同名异源亲本种子、植株标准样品、有关资料和图册。 ②掌握最佳田检时期。一般分苗期、花期和成熟期三期进行，花期是关键。苗期检验性状为幼苗叶色、叶鞘颜色、叶型，花期为株高、茎秆粗细、叶片形状、叶片数及上冲程度、花药色、花丝色、雄穗护颖颜色及主轴长度、分枝多少等，成熟期为穗位高低、双穗率、穗型、穗轴颜色、粒型、粒色、果穗苞叶长度等。 ③掌握安全隔离。无论是空间隔离、时间隔离或障碍物隔离，一定要控制外来花粉干扰，防止生物学混杂。 ④掌握正确的田检方法。在对基本情况了解的前提下，要正确划分检验区和设点取样。一个检验区的最大面积为公顷；公顷以下5点取样,～公顷为8点取样, ～公顷为11点取样,～公顷为15点取样。每点最株数不低于200株。取样点分 布方式因地块形状和大小可选择棋盘式、梅花式或方格式等，但取样点距地块边缘必须在5米以上。 2.品种纯度室内检验（自学） 种子在收获、脱粒、加工等过程中都有可能造成机械混杂，因此，在田检基础上必须进行品种真实性和一致性检验。室内检验杂交玉米种子纯度常用的方法主要有籽粒形态法、幼苗形态法和电泳法。 ①种子形态鉴定法是根据粒色、粒型、粒质、顶部凹陷和饱满状况、胚的形状与大小、籽粒表面圆滑程度、棱角的有无、稃色和花丝遗迹等特征进行鉴定的。其特点是快速、简
SSR分子标记实验流程
实验流程及操作 SSR分子标记开发的流程主要有DNA提取、DNA质量监测、PCR扩增反应和非聚丙烯酰胺凝胶电泳。 1油棕DNA的提取 DNA的提取一般有改良的CTAB法和SDS法，本实验室采用的是CTAB提取法。由于购买液氮不变，提取液用的是CTAB提取缓冲液，其配方是：2%(w)CTAB，50 mol·L-1Tris·HCl (pH8.0)，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2%(!) β- 巯基乙醇。具体操作方法如下： 取2g嫩叶片在约600ulCTA提取液进行磨样，直至所磨样品看不到嫩叶残渣为止；将磨好的样品分装到对应离心管中，之后在65℃的水浴锅中煮45min-1h 后，期间每隔10分钟左右将其拿起来轻轻摇匀约30次，水浴时间到后降温至室温；在水浴好后的离心管中加入500ul氯仿异戊醇并缓慢混匀30次，静置5min；在把样品配平后，在离心机中以10000rmp，25℃，离心8min；离心好后用移液枪吸取上清液，加入等体积冰冻的无水乙醇，轻轻混匀后静置10min；最后将DNA用枪头挑出，用75%乙醇或乙醇铵浸泡过夜，让其风干；风干后DNA用50ulddH2O培养于-20℃冰箱中。 2DNA质量检测 将获得的DNA样品稀释1000倍后，用紫外分光光度计分别测定不同样品的DNA溶液在260、280nm波长下的OD值,以及OD260/OD280的比值，计算样品的纯度，并通过260nm处的吸光值计算样品中的DNA含量。取1ulDNA,，加1ul10×loading buffer 和8ulddH2O 于ρ= 0.008 g·mL-1琼脂糖凝胶电泳，电压100v，电泳45min，于紫外透射仪下检测DNA降解情况[5～7]。 其中，水平电泳的步骤是：①、制胶：1﹪琼脂糖凝胶：1×TAE 50ml；REGULAR （琼脂糖） 0.5g；Goldview Nuleie 4ul∕Bioteko Corporation 2ul（染色剂）。 ②、点样：点样时需加溴酚蓝，即：5ul样品+5ul溴酚蓝。③、将胶放入电泳槽，接上电源进行电泳，时间约为30min，电源电压为120v。 3 SSR-PCR扩增 PCR反应前将提取的DNA样品稀释200倍。 PCR扩增反应体系的总体积为20ul，其中，ddH2O 4.8ul，10×Buffer 1ul,25mMMg2+ 0.8ul,10umPrimerL 0.5ul,10umPrimerR 0.5ul,10mMdNTP 0.2ul，5u/ulTaｑ酶 0.2ul，DNA模板 2ul，矿物油 10ul（防止蒸发）。 扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s,54.7℃退火30s,30个循环，72℃再延伸7min。 4电泳 ⑴装板：将玻璃板用洗洁剂冲洗干净后檫拭干净，然后按照说明书的说明正确装好板；板装好后封底，封底所用的试剂是1g琼脂糖+100ml 水。