SDS-PAGE所有详细试剂配方
SDS-PAGE
30%聚丙烯酰胺溶液-----30%(w/v)Acrylamide
【组分浓度】
各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)
30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml
29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g
1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g
【配制方法】
将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热(37℃左右)的去离子水中,充分搅拌溶解,补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质,储于棕色瓶,4℃避光(用铝箔纸包扎起来)保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。
【保存条件】
4℃避光(用铝箔纸包扎起来)保存
【注意事项】
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。
1MTris-HCL(pH6.8)(浓缩胶buffer)
【组分浓度】1MTris-HCL
名称用量备注
Tris 12.1g
去离子水80ml
浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定
去离子水加入去离子水定容至100ml后,室温保存
【配制方法】
称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值(7.4-大约0.7mL,7.6-大约0.6mL,8.0-大约0.42mL),将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
【保存条件】
室温保存。
【注意事项】
对人体有刺激性,请注意适当防护。
1.5MTris-HCL(pH8.8)(分离胶buffer)
【组分浓度】1.5MTris-HCL
名称用量备注
Tris 18.17g
去离子水80ml
浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定
去离子水加入去离子水定容至100ml后,室温保存
【配制方法】1L
称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加浓HCL调节所需要的pH值=8.8,将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保存。(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合,加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。)
【保存条件】
室温保存
【注意事项】
应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS
【组分浓度】10%(w/v)SDS
名称用量备注
SDS 10g
去离子水80ml 加入去离子水定容至100ml后,室温保存
【配制方法】
称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中,加入约16ml的去离子水,68℃加热溶解,滴加浓盐酸调节PH至7.2,定容至20ml后,室温保存
【保存条件】
室温保存
【注意事项】
对人体有害,请注意防护。
10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)AP
【组分浓度】10%(w/v) 过硫酸铵
名称用量备注
过硫酸铵0.1g
去离子水1ml 现配现用
【配制方法】
称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管,加1mL去离子水吹打溶解,4℃保存
【保存条件】
4℃保存
【注意事项】
10%过硫酸铵溶液在4℃保存时,可使用2周左右,超过期限会失去催化作用
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5×Tris-Glycine buffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)【组分浓度】
各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)
1000ml 500ml
0.125M Tris 15.1g
1.25M glycine(甘氨酸) 94.0g
0.5%(W/V)SDS 5.0g
【配制方法】
称取15.1gTris,94.0g甘氨酸(glycine),5.0gSDS,用800ml蒸馏水或去离子水溶解,充分搅拌溶解,定容至1000ml,室温保存。得0.125mol/L Tris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。
【保存条件】
室温保存,两年有效。
【注意事项】
配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。
电泳缓冲液可以回收,回收后可再使用1-2次,但为了取得最佳的电泳效果,应使用新电泳液。
5×SDS-PAGE加样缓冲液----- 5×SDS-PAGE Loading Buffer
【组分浓度】0.25MTris-HCL(pH6.8);
10%(W/V)SDS;
0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝);
50%(V/V) 甘油;
5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)
各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)
5ml 3ml
1MTris-HCL(pH6.8) 1.25ml
SDS 0.5g
BPB(溴酚蓝) 25mg
甘油 2.5ml
(0.5mL/份)分装,室温保存,使用前加25μL 2-ME/小份,保存一个月左右。
β-巯基乙醇(2-ME) 0.25ml
【配制方法】
量取1.25mL 1MTris-HCL(pH6.8),0.5g SDS,25mg BPB,2.5mL甘油,置于10mL塑料离心管中,加去离子水溶解后,定容至5mL,小份(0.5mL/份)分装,于室温保存。使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
【保存条件】
-20℃保存,至少一年有效。
【注意事项】
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇,有轻微刺激性气味,必须完全溶解后再使用。摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法
TEMED原液直接使用
考马斯亮蓝R-250染色液
【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250,25%(v/v)异丙醇,10%(v/v)冰醋酸
各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)
1000ml 400ml 备注
考马斯亮蓝R-250 1.0g0.4g
异丙醇250ml100ml 搅拌溶解,可用甲醇替代
冰醋酸100ml40ml 搅拌均匀
去离子水650ml260ml 搅拌均匀,滤纸除去颗粒物,室温保存
考马斯亮蓝染色脱色液
【组分浓度】10%(v/v)醋酸,5%(v/v)乙醇
名称用量备注
冰醋酸100ml
乙醇50ml
去离子水850ml 充分混匀后使用