菌落PCR筛选阳性重组子

实验十菌落PCR筛选阳性重组子

【实验目的】

学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法

【实验原理】

细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。

【仪器、材料与试剂】

1 仪器

生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统

2 材料

含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer 1）和引物2（primer 2），PCR管，移液器枪头，ddH2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。

3 试剂

PCR试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶；

primer 1和primer 2：均配成10μmol的使用液；

DNA Marker：根据PCR产物大小确定。

【实验步骤】

1 配制25μL的PCR反应体系

10×buffer 2.5 μL

MgCL2或MgSO4 1.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加）

dNTPs（2μmol） 2.5μL

primer 1 (10μmol ) 1μL

primer 2 (10μmol ) 1μL

Taq 酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1U

ddH2O 补至25μL

最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。

2 PCR程序

配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。通常设计的反应条件如下：

94℃预变性3～5min；

94℃变性30sec～1min

50～60℃退火1min 30～35个循环

72℃延伸2min

72℃最终延伸8～10min

设定好程序后，即可开始运行程序，进行PCR。

3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六

PCR完成后，取5～8μL PCR产物与适宜的上样缓冲液（loading buffer ）混匀后，加样电泳。待电泳完成后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。

【注意事项】

1配制PCR反应所用PCR管及移液器枪头要洁净、无菌，反应体系配制时要仔细，防止液体飞溅。

2要选取清晰、散落的菌落进行挑菌，防止沾染其他菌落或杂菌。

【思考题】

1 菌落PCR扩增时应注意哪些问题？

2菌落PCR扩增鉴定阳性重组子的依据是什么？