3p213区域相关抑癌基因——RASSF1A、BLU和SEMA3B在肝癌组织中的表达及临床意义
万方数据
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（购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）说明书提取组织总ＲＮＡ，然后应用ＵＶ－２４０型紫外可见光光度计测定核酸Ａ２６０和Ａ２８０值，定量组织总ＲＮＡ含量。
３．逆转录ＲＴ：应用Ｍ—ＭＬＶ逆转录酶（Ｐｒｏｍｅｇａ产品），每份组织取５ｐｌ总ＲＮＡ进行逆转录，反应体系为２５ｐｌ。按照说明书加入各项试剂混匀后置３７℃水浴１ｈ，９５℃５ｒａｉｎ终止反应，进行下一步反应或一２０℃保存待测。
４．聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＲＡＳＳＦＩＡ、ＢＬＵ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因：ＲＡＳＳＦｌＡ的上游引物序列为５＇－ＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣ－３’，下游引物序列为５’一ＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＣＧＧＴＧ一３’，扩增长度为２３７ｂｐ；ＢＬＵ上游序列：５，－ＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡ一３７，下游序列为５，－ＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＧＧ３’，扩增长度为２３４ｂｐ；ＳＥＭＡ３Ｂ上游序列：５７－ＣＣＧＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＧＡＣ－３’，下游序列：５’一ＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＧＴＣＴＴ一３’，待测产物大小３６４ｂｐ。ｐ肌动蛋白的引物序列分别为上游５７－ＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴ一３７，下游为５１－ＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴ一３’，扩增长度为５６７ｂｐ。ＰＣＲ反应体积为２５ｐｌ，含有１０×ｂｕｆｆｅｒ２．５ｐｌ，Ｍ９２＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５肛１，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２肛１，上、下游引物各０．５ｐｌ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／ｕ１）ｏ．５ｐＩ，最后去离子水补齐至２５弘ｌ。循环参数：９５℃２ｍｉｎ，９５℃１ｍｉｎ，５８℃３０Ｓ，７２℃４５ｓ；共３４个循环，最后７２℃补延伸５ｍｉｎ，至４℃完成反应。
５．结果记录：取１５肛ｌ上述ＰＣＲ产物以１．５％的琼脂糖凝胶进行电泳，用ＥＤＡＳ２９０电泳成像拍照并用ＫｏｄａｋｌＤ３．５专用软件进行图像分析，记录结果。
６．统计学处理：采用ＳＰＳＳ１１．５统计软件Ｘ２检验，其他结果经精确概率法处理。
结果
１．肝组织总ＲＮＡ鉴定：经ＴＲＩＡｚｏｌ提取组织总ＲＮＡ后，测定Ａ２６０／Ａ２８０比值≥１．８，说明无蛋白污染。经１．５％琼脂糖电泳鉴定，见总ＲＮＡ有清晰的２８ｓ和１８ｓ两条带，表明ＲＮＡ无降解，无ＤＮＡ污染。
２．ＨＣＣ及相应癌旁组织中ＲＡＳＳＦｌＡ、ＢＬＵ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因的表达：经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后ＲＡＳＳＦＩＡ、ＢＬＵ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因，转录本片段大小分别为２３７ｂｐ，２３４ｂｐ，和３６４ｂｐ，ｐ肌动蛋白片段大小为５６７ｂｐ，均与理论值相符（图１）。在所有受检的癌旁肝组织中，ＲＡＳＳＦｌＡｍＲＮＡ表达率为７０．６％，ＢＬＵＩＴＩＲＮＡ为８７．２％，ＳＥＭＡ３ＢｍＲＮＡ为８５．７％，而肝癌组织中ＲＡＳＳＦＩＡｍＲＮＡ表达率为３９．２％，ＢＬＵｍＲＮＡ为３６．７％，ＳＥＭＡ３ＢｍＲＮＡ为２１．５％，差异有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）。
Ｍ：ＭａｒｋｅｒＣ：癌组织Ｎ：癌旁肝组织（数字为试验标本序号）圈１肝癌病人癌组织及相应癌旁组织中ＲＡＳｓＦｌＡ、
ＢＬＵ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因的表达
３．ＲＡＳＳＦｌＡ、ＢＬＵ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因的表达与肝癌相关临床因素的关系：肝细胞癌及癌旁组织中该三种基因的表达情况与年龄、术前肝功能Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｃｈ分级和肝癌大小与ＢＬＵ表达与否的关系无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；合并有肝硬化或者乙肝表面抗原阳性的病人，其肝癌组织中三种基因表达失活的比率显著高于无肝硬化或乙肝表面抗原阴性病人（Ｐ＜Ｏ．０１）。另外，低分化肝癌较中、高分化肝癌三种基因的ｍＲＮＡ未表达比率增高，但ＳＥＭＡ３Ｂ基因差别无显著性（表１）。
４．ＲＡＳＳＦｌＡ、ＢＬＵ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因的表达与肝癌预后的关系：按随访结果，将７９例肝癌病人，分为复发组（５７例，占７２．６％）和未复发组（２２例，占２７．４％）。复发组肿瘤ＲＡＳＳＦＩＡｍＲＮＡ表达率为３０．４％，ＢＬＵｎｌＲＮＡ为２９．１％，ＳＥＭＡ３ＢｍＲＮＡ为１７．７％，而未复发组中三种基因的表达率依次为４５．６％、４３．０％、３８．０％，差异有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）。
讨论
随着近年来人类基因组计划的实施，抑癌基因的检测方法较以往更加丰富和深入，对染色体３ｐ２１．３的研究逐渐成为热点ｕＪ，该区域在肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、肾癌、肝癌等不同肿瘤中均存在高频的染色体杂合性缺失心］。ＲＡＳＳＦｌＡ、ＢＩ。Ｕ和ＳＥＭＡ３Ｂ基因就定位于该区域，其作为候选抑癌基
因的身份已被多数研究所证实。
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3p21.3区域相关抑癌基因——RASSF1A、BLU和SEMA3B在肝癌
组织中的表达及临床意义
作者：李锟， 沈世强， 廖晓锋， 汪江平， 张剑
作者单位：李锟,廖晓锋,汪江平,张剑(华中科技大学同济医学院附属襄樊医院普外科,441021)， 沈世强(武汉大学人民医院普外科,430060)
刊名：
中华肝胆外科杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF HEPATOBILIARY SURGERY
年，卷(期)：2010，16(4)
被引用次数：0次
参考文献(11条)
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RASSF1A,located at 3p21.3 in cervical neoplasias 2007
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相似文献(2条)
1.期刊论文陈亮.沈世强.汪栋宇.荣愈平肝细胞癌中SEMA3B基因的表达及其意义-中华实验外科杂志2007,24(9) 目的 通过对SEMA3B基因在原发性肝细胞癌(HCC)组织中表达的检测,探讨该基因与HCC发生机制的关系.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测35例HCC组织及癌旁肝组织SEMA3B mRNA表达水平.结果 (1)在所有受检的癌旁肝组织中,SEMA3B mRNA表达率为85.7%(30/35),明显高于癌组织的表达率20.0%(7/35),差异有统计学意义(P＜0.01);(2)合并有肝硬化(20/28)或者乙肝(19/28)的患者,其癌组织中SEMA3B基因的表达缺失率显著高于无肝硬化(8/28)或乙肝阴性(9/28)患者(P＜0.05);(3)SEMA3B基因的异常表达情况与年龄、性别的差异无统计学意义(P＞0.05),与HCC患者术前肝功能Child-Pugh分级评价和血清AFP的检测值高低无相关(P＞0.05);(4)SEMA3B的表达缺失率与TNM分期关系无统计学差异,低分化型癌组织中SEMA3B基因缺失率高于中、高分化型,但差异无统计学意义(P＞0.05).此外,该基因的缺失与肿瘤大小无关(P＞0.05).结论 SEMA3B基因在HCC组织中的高频表达缺失说明该基因的失活与HCC的发生密切相关.SEMA3B基因是定位于染色体3p21.3区域的与HCC相关的抑癌基因,并且可能在HCC的发生发展方面起重要作用.
2.学位论文杜卫东受体酪氨酸激酶RON在大肠癌浸润/转移中的作用机制及信号传导2006
肿瘤的发展和转移是一个多步骤的过程，它包括局部肿瘤生长，浸润，扩散到邻近部位，并形成新病灶。肿瘤的转移和复发是肿瘤患者死亡率的主要决定因素。恶性肿瘤是人类死亡的第二大主要因素，而且有逐渐上升的趋势，在有些发达国家，恶性肿瘤甚至已成为危害人类生命的头号杀手。其中，消化系统的恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的60％～70％，结直肠癌和胃癌是常见恶性肿瘤。尽管胃肠肿瘤在手术、化疗、放疗、免疫和生物等各种治疗方法上有了很大提高，但遗憾的是仍然有30％～50％患者出现复发和转移。临床早期胃结肠癌可以通过手术等有效治疗达到根治，但大部分患者就诊时
，肿瘤已发生局部浸润或全身微转移甚至转移，治疗后又缺乏一个有效的手段予以评估疗效，检控病情的发展，这是目前导致治疗失败的主要原因。所以如何预防和检测发现肿瘤浸润或转移成为目前肿瘤研究的一个热点。
肿瘤生物学及小分子药物结构领域，阐明肿瘤转移浸润的分子生物学机制和发现、确认关键靶点分子乃当务之急。按Liotta等提出的癌细胞侵袭转移的3步骤假说，从分子水平上将这个过程分为：①粘附；②降解；⑨运动。肿瘤细胞的粘附性和迁移在肿瘤侵袭和转移中起着极为重要的作用。癌细胞
的运动能力影响其浸润周围组织和发生远处转移，其中运动因子起着重要作用。许多癌细胞表达运动因子受体，但关于运动因子与结直肠癌侵袭、转移的研究极少。
在对上皮源性肿瘤的研究中发现，有一类被称为受体酪氨酸激酶(RTKs)的跨膜蛋白质在调节细胞生长、分化和生存中起着基础性作用。
RON(Recepteurd'OrigineNantais)是属于MET原癌基因家族的一种酪氨酸激酶受体(RTK)。体外研究发现RON的激活引起上皮细胞的分化、迁移和基质的侵袭，并可能在肿瘤的发生发展中起重要作用。
RONcDNA最早从角质细胞中被克隆。此基因位于染色体3p21.3——一个在很多肿瘤中经常发生突变的区域。RON是一个180kD的具有酪氨酸激酶活性的杂二聚体，由一个40kD的α链和一个150kD的跨膜β链组成。两条链都是从同一个单链前体经蛋白水解转化而成，并经一个二硫键结合在一起。巨噬细胞刺激蛋白(MacrophageStimulationProtein，MSP)作为RON的唯一配体。有多篇研究显示在人的上皮性肿瘤，如乳癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、肝细胞性肝癌和头颈部的鳞癌中均有不同程度的RON的高表达，并在其中部分肿瘤中检测到变异体。
RON的高表达和变异体的出现在肿瘤的发生发展中有何意义、其可能的相关机制是什么?本研究对此进行探究，试图寻找一种监测评估肿瘤浸润、转移和病情发展的特异性强敏感性高的指标。
本论文的内容分以下三部分：第一部分主要试剂配制方法和实验方法介绍试剂配制方法主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)。主要实验方法有：细菌转化，质粒抽提；DNA琼脂糖凝胶电泳；DNA和蛋白提取；质粒转染；WesternBlot；SiRNA；过河实验；Transwell趋化运动实验；Matrigel基质浸润实验等。
第二部分RON受体酪氨酸激酶过表达在大肠癌细胞株浸润/转移中的作用及分子机制的研究
目的：1、观察RON受体酪氨酸激酶过表达对大肠癌细胞株RKO迁移/浸润能力的影响。
2、探索RON过表达引起大肠癌细胞株移动/浸润能力改变的具体分子机制及对Smad信号转导途径的影响。
方法：1、WesternBlot法筛选出低表达或不表达RON的结肠癌细胞株；检测转染前后E-cadherin、Smad2的表达。
2、扩增表达野生型RON的质粒pDR2-wt-RON，以脂质体法转染筛选细胞，并以WesternBlot法鉴定。
3、过河实验和Transwell趋化运动实验检测过表达wt-RON的细胞株迁移和穿膜能力改变，未转染细胞及载体转染细胞作对照。
4、Matrigel基质浸润实验检测转染细胞基质浸润能力的变化。
5、构建shRNA表达质粒，对转染细胞实施RNAi，比较迁移、浸润能力的改变，未转染细胞及对照序列转染细胞作对照。
6、脂质体法转染siRNA表达质粒，针对RON实施RNAi。
结果：1、成功筛选出不表达RON的结肠癌细胞株RKO。
2、成功转染质粒并选择稳定表达wt-RON的克隆，过表达wt-RON的细胞株形态改变，成长梭型。
3、显示过表达wt-RON的细胞株迁移和穿膜能力增强；基质浸润能力增强；E-cadherin表达下降；Smad2的表达增高。
4、针对RON实施RNAi后，过表达wt-RON的细胞株的迁移能力和基质浸润能力均下降；Smad2的表达下调。
结论：1、RKO细胞株转染并过表达wt-RON后，细胞内成分发生重构，E-cadherin表达下降，形态梭型化，迁移和浸润能力增强。提示通过上皮-间质细胞转化(EMT：Epithelial-MesenchymalTransition)机制促进细胞的迁移/浸润能力增加。
2、过表达wt-RON的细胞株Smad2的表达增高，实施RNAi后，其迁移能力和基质浸润能力均下降，Smad2的表达下调。说明可通过Smad途径进行信号转导。第三部分RON受体酪氨酸激酶变异体在大肠癌浸润/转移中的作用及分子机制的研究
目的：1、观察RON受体酪氨酸激酶变异体(RON△160)对大肠癌细胞株RKO迁移/浸润能力的作用。
2、探索RON△160表达引起大肠癌细胞株移动/浸润能力增强的具体分子机制及对Smad信号转导途径的影响。
方法：1、WesternBlot法筛选出低表达或不表达RON的结肠癌细胞株；检测转染前后E-cadherin、Smad2的表达。
2、扩增表达RON变异体(RON△160)的质粒pcDNA3.1-RON△160，以脂质体法转染筛选细胞，并以WesternBlot法鉴定。
3、过河实验和Transwell趋化运动实验检测表达RON△160的细胞株迁移和穿膜能力改变，未转染细胞及载体转染细胞作对照。
4、Matrigel基质浸润实验检测转染细胞基质浸润能力的变化，未转染细胞及载体转染细胞作对照。
5、构建shRNA表达质粒，对转染细胞实施RNAi，比较迁移、浸润能力的改变，未转染细胞及对照序列转染细胞作对照。
6、脂质体法转染shRNA表达质粒，针对RON实施RNAi后，WesternBlot法检测转染前后E-cadherin、Smad2的表达。
结果：1、成功筛选出不表达RON的结肠癌细胞株RKO。
2、成功转染质粒并选择稳定表达RON△160的克隆，表达RON△160的细胞株形态改变，成长梭型。
3、显示表达RON△160的细胞株迁移和穿膜能力增强；基质浸润能力增强；E-cadherin表达下降；Smad2的表达增高。
4、针对RON实施RNAi后，表达RON△160的细胞株的迁移能力和基质浸润能力均下降；Smad2的表达下调。
结论：1、RKO细胞株转染并表达RON△160后，形态变成长梭型，E-cadherin表达下降，细胞内成分重构，可增强迁移和浸润能力；提示通过上皮-间质细胞转化(EMT:Epithelial-MesenchymalTransition)机制促进细胞的迁移/浸润能力增加。
2、表达RON△160的细胞株Smad2的表达增高；实施RNAi后，迁移能力和基质浸润能力均下降，Smad2的表达下调。变异体也可通过Smad途径进行信号转导。全文结论1.RKO细胞株转染并过表达wt-RON后可增强迁移和浸润能力，此作用可为特异性SiRNA所阻断。
2.过表达wt-RON通过上皮-间质细胞转化促进细胞的迁移/浸润能力增加，上调Smad2表达。
3.RKO细胞株转染并表达RON△160后可增强迁移和浸润能力，此作用可为特异性SiRNA所阻断。
4.细胞株表达RON△160可下调E-cadherin的表达、上皮-间质细胞转化增强迁移和浸润能力，上调Smad2表达。
5.RON可以通过过表达和产生变异体方式引起大肠癌细胞株RKO的迁移和浸润，两者均可通过Smad途径进行信号转导。
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