ATP和乙酰胆碱诱发豚鼠耳蜗外毛细胞内CICR的激光共聚焦研究
?实验研究?
A TP和乙酰胆碱诱发豚鼠耳蜗外毛细胞内
CICR的激光共聚焦研究3
黄莉1△ 杨军1
[摘要] 目的:运用激光共聚焦研究A TP和乙酰胆碱(ACh)对豚鼠耳蜗外毛细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响以及诱发Ca2+介导的Ca2+释放(CICR)的可能机制。方法:用酶孵育机械分离法,分离豚鼠耳蜗外毛细胞(O HC),钙敏荧光探针Fluo23染色后,用激光扫描共聚焦显微镜分别记录在细胞外液有钙或无钙条件下,加入A TP、ACh、斯里兰卡肉桂碱(Ryanodine)+A TP(或ACh)和毒胡萝卜素(Thapsigargin)+A TP(或ACh)后的O HC的[Ca2+]i的变化。结果:在含钙的细胞外液中,A TP、Ryanodine+A TP、Thap sigargin+A TP、ACh、Ryanodine+ACh和Thapsigargin+ACh均可引起[Ca2+]i升高,引起明显的波峰,荧光强度相对峰值分别为1.60±0.01(A TP)、1.644±0.005(Ryanodine+A TP)、1.491±0.005(Thapsigargin+A TP)、1.43±0.01 (ACh)、1.58±0.02(Ryanodine+ACh)、1.398±0.003(Thapsigargin+ACh);而在不含钙的细胞外液中,A TP和Ryanodine+A TP仍可引起[Ca2+]i出现幅度较小的波峰,分别为1.341±0.006和1.386±0.008,而ACh、Ryan2 odine+ACh、Thapsigargin+ACh和Thapsigargin+A TP未引起明显[Ca2+]i波峰出现,其中ACh不能引起[Ca2+]i的升高,Ryanodine+ACh、Thapsigargin+ACh和Thap sigargin+A TP分别引起[Ca2+]i缓慢升高。结论:在细胞外液有Ca2+的条件下,A TP和ACh引起O HC的[Ca2+]i升高,除了通过离子通道引起胞外Ca2+内流,还有IP3敏感钙库的释放和诱发CICR。在无Ca2+的条件下,A TP仍能诱发CICR,其机制可能是A TP促进IP3敏感钙库释放Ca2+,Ca2+又诱发了CICR,而ACh的反应是Ca2+依赖性的,在细胞外液无Ca2+的条件下, ACh不能引起IP3敏感钙库的释放和诱发CICR。
[关键词] 三磷酸腺苷;乙酰胆碱;Ca2+介导的Ca2+释放;外毛细胞;钙;耳蜗
[中图分类号] R34 [文献标志码] A [文章编号] 100121781(2009)0720316206
ATP and ACh induced CICR in outer hair cells of the guinea pig cochlea:
study of confocal microscopy
H UA N G L i YA N G J un
(Depart ment of Otolaryngology2Head and Neck Surgery,Xinhua Ho spital Jiaotong University School of Medicine,Shanghai,200092,China)
Corresponding aut hor:YAN G J un(Email:yangjun67@hot https://www.360docs.net/doc/c218844120.html,)
Abstract Objective:Effects of A TP and acetylcholine(ACh)on intracellular Ca2+concentrations([Ca2+]i) and possible mechanism of Ca2+2induced Ca2+release(CICR)of the isolated outer hair cells(O HCs)in the guinea pig cochlea were studied with confocal microscopy.Method:O HCs were isolated f rom guinea pig cochlea by enzy2 matic and mechanical methods.The effects of A TP,ACh,Ryanodine+A TP(or ACh)and Thapsigargin+A TP (or ACh)in the presence or absence of extracellular Ca2+on[Ca2+]i in O HCs were examined by confocal micros2 copy.R esult:In the presence of A TP,Ryanodine+A TP,Thapsigargin+A TP,ACh,Ryanodine+ACh and Thapsi2 gargin+ACh increased[Ca2+]i and evoked an evident wave,respectively,the relative magnitude of fluorescence were1.60±0.01(A TP),1.644±0.005(Ryanodine+A TP),1.491±0.005(Thapsigargin+A TP),1.43±0.01 (ACh),1.58±0.02(Ryanodine+ACh),1.398±0.003(Thapsigargin+ACh)in O HCs in the presence of extra2 cellular Ca2+respectively.In the absence of extracellular Ca2+,A TP and Ryanodine+A TP induced a gradual and small[Ca2+]i wave,the relative magnitude of fluorescence were1.341±0.006and1.386±0.008,however, ACh,Ryanodine+ACh,Thap sigargin+ACh and Thap sigargin+A TP can not induce wave but a gradual[Ca2+]i elevation.ACh can not increase[Ca2+]i.Conclusion:In the presence of extracellular Ca2+,A TP and ACh in2 creased[Ca2+]i in O HCs not only by Ca2+influx through ion channel on cell membrance but also a release of Ca2+
3基金项目:国家自然科学基金资助项目(No:30772396)
1上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉2头颈外科(上海,200092)
△现在山西省肿瘤医院乳腺放疗科(太原,030013)
通信作者:杨军(Email:yangjun67@https://www.360docs.net/doc/c218844120.html,)
f rom IP32sensitive calcium reservoir and CICR.In the absence of extracellular Ca2+,A TP activated IP3sensitive calcium reservoir and Ca2+release through IP3sensitive calcium reservoir,in turn CICR was induced.ACh can not activate IP3sensitive calcium reservoir and CICR in the absence of extracellular Ca2+,therefore,the effect of ACh was dependent of extracellular Ca2+.
K ey w ords A TP;ACh;Ca2+2induced Ca2+release;outer hair cells;Ca2+;cochlea
哺乳动物耳蜗具有频率选择和放大效应,这一生理特征被认为与耳蜗外毛细胞(O HC)的主动运动有关〔1〕。Ca2+在细胞内的浓度受到精细的调控,其中一个重要的调节机制就是Ca2+介导的Ca2+释放(Ca2+2induced Ca2+release,CICR),即细胞外的Ca2+进入细胞内,然后诱发了细胞内的钙库释放。在我们以前的研究中已经证实〔2〕,A TP除了可以引起O HC的细胞外Ca2+内流,还可以引起细胞内钙库的释放。但有关细胞内IP3敏感钙库的研究较多,对另一种斯里兰卡肉桂碱(Ryanodine)敏感钙库知之甚少,而细胞内CICR的过程正是与Ry2 anodine敏感钙库密切相关。A TP和ACh对O HC 的CICR机制有何影响,A TP引起的[Ca2+]i慢速上升相是否就是CICR,尚未见有国内外报道。本实验用激光共聚焦技术对离体豚鼠耳蜗O HC的[Ca2+]i变化进行分析,首次发现A TP和ACh引起豚鼠耳蜗O HC内[Ca2+]i升高可能诱发CICR,以前报道的[Ca2+]i慢速上升相可能有CICR参与。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞制备
选用耳廓反射敏感的健康杂色豚鼠20只,快速断头,取出双侧听泡,置入D2Hank液或Hank液中。在解剖显微镜下,打开听泡,剔除蜗壳,离断蜗轴,再将其放入0.25%的Ⅳ型胶原酶溶液(Sigma 公司,美国)中,在室温孵育20min,孵育后冲洗3次,将蜗轴移入Pet ri培养皿中,用细钢针钩下基底膜,应用吹打技术分离,制得细胞悬液。
1.2 溶液与药品
将Hank液和D2Hank液(G ibco公司,美国)分别作为有钙组和无钙组的细胞外液,实验前需配制成加到培养皿后的终浓度为100μmol/L的ACh 和A TP(Sigma公司,美国)。毒胡萝卜素(Thap si2 gargin)(美国B IOMOL公司)可动员细胞内IP3敏感钙库释放Ca2+〔3〕,用二甲基亚砜(Sigma公司,美国)制成1mmol/L贮存液冻存;Ryanodine(美国B IOMOL公司)为Ryanodine受体(RyR)的激动剂,动员细胞内Ryanodine钙库释放Ca2+〔4〕。Thap sigargin使用前用二甲基亚砜稀释,Ryanod2 ine使用前用D2Hank液配制,加到培养皿后的终浓度分别为30nmol/L和30μmol/L。钙荧光探针Fluo23/AM(Sigma公司,美国)用纯二甲亚砜配成1g/L的储备液-20℃保存。1.3 实验分组
根据细胞外液有钙或无钙及加入药物的不同,将实验分为12组:①A TP(有钙或无钙组);②Ry2 anodine+A TP(有钙或无钙组);③Thap sigargin+ A TP(有钙或无钙组);④ACh(有钙或无钙组);⑤Ryanodine+ACh(有钙或无钙组);⑥Thap sigargin +ACh(有钙或无钙组)。有2种药物时,先加入Ryanodine或Thap sigargin,观察200s左右,再加入A TP或ACh。每组分别观察5个细胞。
1.4 Fluo23/AM染色和钙成像
选择活性良好的O HC进行实验。待O HC贴壁后,加入荧光离子探针Fluo23/AM(Sigma,美国),终浓度为5μmol/L,避光孵育30～50min。加药操作轻巧,以不使O HC发生移位、不产生机械刺激为度。用激光扫描共聚焦显微镜(Bio2rad ra2 diance2000,美国)监测,以Fluo23荧光强度值指示O HC的[Ca2+]i高低。专用软件(Lasersharp2000,美国)可计算出删除本底的荧光强度值,以Fluo23荧光强度相对值(各时间点的荧光强度与初始荧光强度的比值)作为[Ca2+]i的相对值。
1.5 数据处理
采用Excel10.0软件(Microsoft公司,美国)计算均数、标准差,结果用 x±s表示。采用SPSS软件配对t检验进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 A TP对O HC的[Ca2+]i的影响
2.1.1 细胞外液为有钙的条件下 ①A TP组: 100μmol/L(此为加药后平皿中A TP的最终浓度,以下同)的A TP引起[Ca2+]i立即升高,荧光强度相对峰值为(1.60±0.01)U(n=5),约经9s左右回到静息水平(图1)。②Ryanodine+A TP组: 30μmol/L的Ryanodine在观察开始后50s左右加入后,[Ca2+]i呈缓慢上升趋势,然后在230s左右加入A TP,[Ca2+]i升高并出现明显波峰,约经8s 左右回到静息水平(图2)。③Thap sigargin+A TP 组:在50s左右先加入30nmol/L的Thap sigar2 gin,O HC的[Ca2+]i呈缓慢上升趋势,然后在210s 左右加入A TP后,约经8s左右[Ca2+]i出现一个高峰,约10s左右回到静息水平,在所观察的200s 左右荧光强度呈持续升高(图3)。经2h左右,细胞变性死亡。
2.1.2 细胞外液为无钙的条件下 ①A TP 组:100μmol/L 的A TP 作用于O HC ,[Ca 2+]i 缓慢上升,幅度较在Hanks 液中减小,荧光强度相对峰值为(1.341±0.006)U (n =5),约经70s 回到静息水平(图4)。②Ryanodine +A TP 组:先加入30μmol/L 的Ryanodine ,荧光强度值出现缓慢上升,然后在260s 左右加入A TP 出现明显波峰。③Thap sigargin +A TP 组:先加入30nmol/L 的Thap sigargin ,O HC 的[Ca 2+]i 呈缓慢上升趋势,并未出现明显波峰,约经2h 左右,细胞变性死亡(见表1)。
图4 在D 2H ank 液中终浓度为100μmol/L 的ATP
对1个OH C 的[C a 2+]i 影响
表1 ATP 组、Ryanodine +ATP 组和Thapsigargin +
ATP 组在有钙或无钙条件下的各荧光强度相对
值 x ±s
组别
Hanks 液D 2Hank 液A TP 组
1.6000±0.01
1.341±0.006
Ryanodine +A TP 组
Ryanodine 1.1396±0.002 1.140±0.02 A TP
1.6440±0.0051)1.386±0.0081)
Thapsigargin +A TP 组
Thap sigargin 1.1450±0.007 1.130±0.02 A TP
1.4910±0.0051)1.190±0.021)
与A TP 组比较,1)P <0.05
2.2 ACh 对O HC 的[Ca 2+]i 的影响
ACh 对O HC 的[Ca 2+]i 的影响见表2。
表2 ACh 组、R yanodint +ACh 组和Thapsigargin +
ACh 在有钙或无钙条件下的各荧光强度相对值
x ±s
组别
Hanks 液D 2Hank 液ACh 组
1.430±0.01
1.0030±0.022
Ryanodine +ACh 组
Ryanodine 1.140±0.0004 1.1395±0.0006 ACh
1.580±0.021)
1.1400±0.0011)
Thapsigargin +ACh 组
Thap sigargin 1.145±0.002 1.1410±0.001
ACh
1.398±0.0031) 1.2100±0.011)
与ACh 组比较,1)P <0.05
2.2.1 细胞外液为有钙的条件下 ①ACh 组:100μmol/L 的ACh 引起[Ca 2+]i 迅速升高,约经8s 到达高峰,荧光强度相对峰值为(1.43±0.01)U (n =5),约经6s 回到静息水平(图5)。
②Ryanodine +ACh 组:在观察开始后50s 左右先加入30μmol/L 的Ryanodine ,O HC 的[Ca 2+]i 呈缓慢上升趋势,然后在220s 左右加入ACh ,[Ca 2+]i 出现一个波峰,约经10s 左右回到静息水平(图6)。③Thap sigargin +ACh 组:在50s 左右加入30nmol/L 的Thap sigargin ,O HC 的[Ca 2+]i 出现缓慢上升,然后在250s 左右加入ACh 后,O HC 的[Ca 2+]i 迅速升高,约5s 左右达到高峰(图7)。经2h 左右,细胞变性死亡
。
2.2.2 细胞外液为无钙的条件下 ①ACh 组:100μmol/L 的ACh 作用于O HC 时,均无反应,未
引起明显的波峰,荧光强度值平均为(1.003±0.022)U (n =5)(图8)。②Ryanodine +ACh 组:先加入30μmol/L 的Ryanodine ,O HC 的[Ca 2+]i 呈缓慢上升趋势,然后在220s 左右加入ACh ,细胞内[Ca 2+]i 仍出现缓慢上升,但未出现明显波峰。③Thap sigargin +ACh 组:先加入30nmol/L 的Thap sigargin ,O HC 的[Ca 2+]i 呈上升趋势,然后在220s 左右加入ACh 无明显波峰出现,荧光强度呈缓慢升高,经2h 左右,细胞变性死亡
。
图8 在D 2H ank 液中终浓度为100μmol/L ACh 对1个OH C 的[C a 2+]i 影响
3 讨论
Ca 2+在耳蜗毛细胞功能调控上具有重要意义,
涉及耳蜗从“机械2电换能”到“电2化学换能”的全部听觉外周过程。Ca 2+在细胞内的浓度受到精细的调控,其中一个重要的调节机制就是CICR 。
已知细胞内钙贮库主要包括内质网、肌浆网以及线粒体等,有IP 3敏感和IP 3不敏感两类钙库,分别受IP 3受体系统〔5〕和RyR 系统调控〔6〕,前者可被一系列激动剂以及SERCA 抑制剂(钙泵抑制剂)如t hap sigarngin 和环匹阿尼激活;而后者是一种对咖啡因/Ryanodine 敏感的钙通道,通过CICR 途径释放细胞内钙。
Williams 〔7〕发现CICR 机制的分子基础是对Ryanodine 敏感的Ca 2+通道,而RyR 在内质网和肌浆网均有表达。CICR 是一个正反馈的过程,Ca 2+先通过电压依赖性或受体依赖性钙通道进入细胞内,然后介导Ca 2+从细胞内的Ryanodine 敏感钙库释放以增加细胞内Ca 2+浓度,从而进一步增强Ca 2+信号。Andrea 等〔8〕通过膜片钳技术测试膜电容和Ca 2+荧光成像的研究,证实了对咖啡因和Ry 2anodine 敏感的钙库来源的CICR 参与了去极化诱导的毛细胞Ca 2+信号的形成,而且促成了传入神经信号的形成。已经发现在小鼠内毛细胞传入突触处存在CICR ,[Ca 2+]i 升高非常快〔9〕。在其他组织内A TP 可以诱发CICR ,例如Hoesch 等〔10〕在迷走感觉神经元发现Ryanodine 敏感的[Ca 2+]i 升高即由CICR 通过RyR 实现。
在耳蜗的O HC 膜上有A TP 受体表达〔11〕。在
既往的研究中已经证实了A TP是通过P2X型配体门控离子通道引起胞外Ca2+内流,同时还通过P2Y R2G蛋白磷酯酶C系统,导致细胞内的IP3增加,引起细胞内IP3敏感Ca2+库释放〔2〕。
在哺乳动物耳蜗中ACh为传出性神经递质,可激动细胞膜上M或N样受体,继而激活细胞膜的Ca2+通道(电压门控Ca2+通道或受体门控Ca2+通道),引起细胞外Ca2+内流。同时通过G蛋白途径激活细胞内的磷脂酶C,以磷脂酸肌醇二磷酸为底物产生IP3,后者与IP3受体结合,引起细胞内IP3敏感钙库内Ca2+释放〔12〕。
为了进一步探明A TP和ACh在豚鼠耳蜗O HC所引起的[Ca2+]i升高过程中是否能诱发CICR,本实验用A TP、ACh、Thap sigargin和Ryanodine分别在有钙或无钙的条件下,应用激光共聚焦技术探讨对O HC的[Ca2+]i影响。Thap si2 gargin可动员胞内IP3敏感钙库释放Ca2+,是一种钙泵抑制剂,与肌浆/内质网A TP酶形成不可逆的复合物,选择性抑制Ca2+2A TP酶,不可逆地使内质网钙池排空,从而使细胞质内[Ca2+]i持续升高〔3〕;而Ryanodine动员细胞内Ryanodine敏感钙库释放Ca2+,是RyR的激动剂,可增加RyR的活性,降低RyR介导的CICR释放Ca2+的阈值,在低浓度(≤50μmol/L)时是激动剂,在高浓度时(>50μmol/L)是拮抗剂〔4〕。
在本实验中我们发现,O HC在含Ca2+的Hanks液中A TP的作用下,引起[Ca2+]i升高的波峰较在无Ca2+的D2Hanks液下的幅度大。这是因为在有Ca2+条件下,既有细胞外Ca2+内流,又引起细胞内Ca2+库释放,而在细胞外无Ca2+时,仅仅引起了细胞内Ca2+库释放。实验发现,无论在有或无Ca2+条件下,Ryanodine+A TP组与A TP的两组进行比较,前者引起O HC的[Ca2+]i升高的波峰幅度较后者大,有统计学意义。我们推测,在细胞外液有Ca2+时,先加入的Ryanodine降低了RyR 介导的CICR释放Ca2+的阈值,之后加入的A TP 引起离子通道开放导致细胞外Ca2+内流,从而诱发了CICR的过程,进一步增加了[Ca2+]i升高的幅度。而在细胞外液无Ca2+条件下,观察到[Ca2+]i 升高的幅度加大,推测可能是A TP通过P2Y R2G蛋白2磷酯酶C系统,引起IP3敏感Ca2+库释放后, O HC的[Ca2+]i升高,接着诱导了Ryanodine敏感钙库释放,引发了CICR的过程。
在实验中发现,无论在有或无Ca2+条件下, Thap sigargin+A TP组与A TP的两组进行比较, O HC的[Ca2+]i升高的幅度均降低,有统计学意义。说明先加入的Thap sigargin作用于IP3敏感Ca2+库,不可逆地使钙库排空后,再加入A TP无法使IP3敏感Ca2+库继续有效的释放,导致O HC的[Ca2+]i升高的幅度减小。而在细胞外无钙条件下,A TP不能引起[Ca2+]i升高,则说明在没有细胞外Ca2+内流和IP3敏感Ca2+库释放的情况下,不能诱发CICR的过程。
在本实验中我们观察到在有Ca2+的条件下, ACh引起O HC的[Ca2+]i迅速升高,而在无Ca2+的条件下,[Ca2+]i并不升高,说明ACh的反应是Ca2+依赖性的。我们用Ryanodine和Thap sigar2 gin分别与ACh在有或无Ca2+条件下进行实验发现,在有Ca2+条件下,Ryanodine+ACh组与ACh 组比较,前者引起的O HC的[Ca2+]i波峰幅度较大,有统计学意义。可能是Ryanodine先降低了CICR的阈值,之后加入ACh引起细胞外Ca2+内流后,诱发了CICR的过程,导致[Ca2+]i波峰的幅度加大。在细胞外有Ca2+条件下,Thap sigargin+ ACh与ACh组比较,前者引起的O HC的[Ca2+]i 波峰幅度较小,有统计学意义,说明Thap sigargin 先不可逆地使IP3敏感Ca2+库排空后,再加入ACh 则无法使IP3敏感钙库继续释放,导致[Ca2+]i升高幅度减小。而在无Ca2+条件下,无论是先加入Ryanodine还是Thap sigargin,均无[Ca2+]i波峰出现,只出现缓慢的[Ca2+]i升高,进一步说明ACh 的反应是Ca2+依赖性的,即在细胞外无Ca2+条件下,没有IP3敏感钙库的释放和CICR的发生。
同时我们发现,不管是细胞外有Ca2+和无Ca2+条件下,加入Ryanodine或Thap sigargin,都可以使O HC的[Ca2+]i出现缓慢升高,而加入Thap sigargin后的O HC均在较短时间内(约2h 左右)出现变性死亡,其机制为Ryanodine作用于内质网和肌浆网均有表达的RyR受体〔13〕,导致Ryanodine敏感钙库的释放从而使[Ca2+]i缓慢升高,而Thap sigargin不可逆地使IP3敏感钙库排空,使[Ca2+]i缓慢升高,最终均导致细胞钙超载,直至变性死亡。
对内耳毛细胞IP3敏感钙库已有较多的研究,发现O HC的IP3敏感钙库位于独特的Hensen体(由内质网和线粒体构成)和膜下池等结构,与A TP和ACh对毛细胞的调控和毛细胞换能机制有关〔13〕。至于Ryanodine敏感钙库的具体结构如何,是否与IP3敏感钙库存在于相同的细胞器中,生理功能如何,都是有待进一步研究的重要课题。
本实验首次证实A TP和ACh能够引起细胞内钙库Ca2+的释放,除了IP3敏感钙库释放以外, Ryanodine敏感钙库释放也参与了[Ca2+]i升高。以前报道的[Ca2+]i慢速上升相可能有CICR参与。CICR不仅可被细胞外内流的Ca2+诱发,也可被IP3敏感钙库释放的Ca2+诱发。在细胞外液有
Ca2+或无Ca2+情况下,IP3和Ryanodine敏感钙库协调作用,使[Ca2+]i抑或CICR受到精细调节。参考文献
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(收稿日期:2008207201)
第43期全国鼻内镜微创手术培训班
暨慢性鼻窦炎新进展国际研讨会
中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院、中山大学耳鼻咽喉科学研究所定于2009年7月25～27日在广州举办第43期全国鼻内镜微创手术培训班暨慢性鼻窦炎新进展国际研讨会,学习班将邀请美国Penn2 sylvania大学、国际鼻科学会主席Kennedy W.教授,土耳其Hacettepe大学、国际鼻科学会秘书长Onerci M.教授,荷兰Amsterdam医学中心、EP3OS2007主编Fokkens W.教授,Mayo Clinic中心、前任国际和美国鼻科学会主席Kern E B.教授,Pennsylvania大学、ORL杂志负责人Li DQ.教授,新加坡国立大学、ARIA2008,EP3OS2007编委Wang D Y.教授,首都医科大学附属同仁医院周兵教授、张罗教授,上海复旦大学附属眼耳鼻咽喉科医院王德辉教授做专题发言,中山大学附属一院许庚、文卫平、史剑波、张湘民、姜鸿彦、熊观霞等教授担任讲者,讲课内容基本涵盖目前国内外鼻内镜微创外科基本技术、最新技术、慢性鼻2鼻窦炎研究最新进展,主要内容涉及鼻黏膜炎症和免疫反应、慢性鼻2鼻窦炎的发病机制、功能性鼻内镜微创手术基本技术、额窦和上颌窦手术技巧、欧洲和中国鼻2鼻窦炎、鼻息肉临床诊疗指引、手术并发症预防及处理原则、鼻2颅底外科进展、鼻2眼相关微创外科进展等;许庚、文卫平、史剑波教授还将就鼻内镜手术的相关技术进行现场解剖示教。欢迎各位耳鼻咽喉科医生参加。联系人:020-********(中山大学附属一院耳鼻咽喉科医院张伟红);138********、t sjbent@https://www.360docs.net/doc/c218844120.html,(史剑波)。通讯地址:广州市中山二路58号中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院,邮政编码:510080。详情请登陆https://www.360docs.net/doc/c218844120.html,/,可以通过网站进行报名。