间充质干细胞的研究进展与临床应用前景
间充质干细胞的研究进展与临床应用前景
韩冰# 付小兵
【摘 要】 目的 介绍间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s)的研究进展及其临床应用前景。 方法 查阅国内外近年有关文献,并行综合分析。 结果 由于M SC s能分化为多种类型的细胞,所以在细胞移植治疗和组织工程方面有广泛的应用。由于其能稳定表达转染到细胞内的目的基因,可治疗血友病、脑梗塞及骨缺损等,因此在基因治疗中应用广泛。其所具有的免疫调节特性,使它在免疫性疾病的治疗中也有广泛的用途。 结论 M SC s是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,且体外易于扩增,是一种理想的细胞治疗和基因治疗的靶细胞,临床应用前景非常广阔。
【关键词】 间充质干细胞 细胞治疗 基因治疗 组织工程 免疫治疗
中图分类号:Q813 R318 文献标识码:A
RESEARCH AD VANCE AND CL IN I CAL APPL I CATI ON OF M ESENCHYM AL STE M CELL S H A N B ing,FU X iaobing.K ey R esea rch L abora tory of W ound R ep a ir of PL A,304th C lin ica l D ep a rt m en t,Genera l H osp ita l of PL A, B eij ing,100037,P.R.Ch ina
Corresp ond ing au thor:FU X iaobing,E2m a il:f ux b@https://www.360docs.net/doc/df357122.html,
【Abstract】 Objective To review the advance in the experi m en tal studies and evaluate the po ten tial therapeu tic app licati on of the m esenchym al stem cells(M SC s).M ethods T he related articles pub lished in Ch ina and the o ther coun tries du ring the recen t years w ere ex ten sively review ed and analyzed.Results T he M SC s w ere w idely u sed in the cell2tran sp lan tati on therapy and the tissue engineering becau se of their p lu ri po tency of differen tiati on in to vari ou s k inds of cells.T hey w ere also frequen tly u sed in the gene therapy becau se they cou ld stab ly exp ress the tran sfected ob jective genes.Becau se of their i m m unomodu lato ry functi on,the M SC s cou ld also be u sed in the i m m uno therapy.Conclusion T he M SC s are the stem cells,w h ich have characteristics of renew ing them selves,having m u lti po tency,and being easy to undergo amp lificati on in vitro.T heM SC s are ideal target cells fo r the cell therapy,tissue engineering,gene therapy, and i m m uno therapy.
【Key words】 M esenchym al stem cells Cell therapy Gene therapy T issue engineering I mm uno therapy
Founda tion ite m s:N ati onal Basic Science R esearch and D evelopm en t Gran ts(2005CB522603);N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina(30670824,30230370,30400172)
随着现代医学的发展,对干细胞的研究也越来越深入。由于干细胞具有自我更新和分化为其它类型细胞的能力,因此干细胞在临床上的应用也越来越广泛。临床上研究较早的干细胞是神经干细胞和胚胎干细胞。但神经干细胞只能分化成为神经细胞,因而临床应用受限。而胚胎干细胞虽然能分化为多种不同的组织,但与之相关的法律和道德问题限制了胚胎干细胞的临床应用。随着人们对间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s)研究的深入,M SC s的优越性逐渐显露出来。M SC s不仅具有自我更新的能力,而且具有多向
基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(2005CB522603);国家自然科学基金资助项目(30670824,30230370, 30400172)
作者单位:解放军总医院304临床部全军创伤修复重点实验室(北京,100037)
#现在解放军第148医院
通讯作者:付小兵,教授,博士导师,研究方向:创伤修复与组织再生,E2m ail:fuxb@https://www.360docs.net/doc/df357122.html, 分化潜能,在不同的诱导条件下可以分化为许多不同的组织[1],如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织等。更为重要的是, M SC s可以从成体多种组织获得,分离方法简便,体外培养方便。M SC s最常见的来源是骨髓,另外也有研究者从其他组织,如脐带血、骨组织、软骨组织、肌肉组织、肌腱组织、脂肪组织、血管组织等分离出M SC s[2]。所以近来有关M SC s的研究越来越多。有些研究成果已经应用于临床,有些虽然暂时未应用于临床,但也为有些疾病的临床治疗提供了新的思路。
1 细胞移植治疗
1.1 系统性移植治疗全身性疾病
M SC s在骨髓内的主要功能是支持造血。在骨髓中,红细胞、粒细胞、巨噬细胞、血小板等的分化、成熟都依赖于造血干细胞及祖细胞与M SC s和细胞外基质及血管组成的微环境的接触,包括造血细胞通过表面
黏附相关分子与M SC s的直接接触来实现造血干 祖细胞的回髓定位和M SC s通过分泌多种细胞因子对造血细胞的分化、成熟进行调控[3,4]。近来的研究发现,将M SC s与造血干细胞共同移植时,能获得比单纯造血干细胞更理想的治疗效果。K itam u ra等[5]将人的M SC s和人的脐带血CD34+细胞共同移植到非肥胖性糖尿病 严重联合免疫缺陷病(nonobese diabetic severe com b ined i m m unodeficiency disease,NOD SC I D)小鼠时,发现共同移植的小鼠外周血、骨髓和脾脏内能检测到比单纯CD34+细胞移植组明显增多的造血系细胞。这说明M SC s在移植后仍具有支持造血的功能。Chen等[6]分离、培养大鼠骨髓M SC s并进行诱导分化,发现诱导分化的细胞呈典型的胰岛样细胞集落。已分化的细胞内胰岛素m RNA和蛋白阳性表达,且其分泌到细胞外的胰岛素水平明显高于分化前细胞。向糖尿病大鼠体内注入已分化细胞能下调血糖水平。这为糖尿病的临床治疗提供了新的思路。
1.2 局部移植治疗局部组织或器官病变
由于M SC s在不同的诱导条件下可分化成骨、椎间盘软骨、膝关节软骨、心肌细胞以及脂肪等许多中胚层来源的组织,而且还能分化成神经组织、内皮组织和皮肤、肺脏、肝脏、肾脏、肠道和脾脏的上皮细胞[7221],所以许多组织或器官的缺损或病变可以通过M SC s移植进行治疗。
体外培养条件下,当培养基中含有成骨添加剂(即地塞米松、抗坏血酸和Β2磷酸甘油)时,M SC s发生了一系列的变化,开始表达骨细胞的某些特征。可以观察到细胞内碱性磷酸酶表达一过性增强, 型胶原下调和骨桥接素上调。同时,在分化级联反应末期骨唾液蛋白及骨钙蛋白上调,骨粘连蛋白(o steonectin)则为组成型表达[22]。
通过离心使M SC s形成小的团状沉淀,然后静置于含有转化生长因子Β(tran sfo rm ing grow th facto rΒ, T GF2Β)的无血清培养基中培养,10～14d后,培养物开始表达软骨细胞的特异性分子标记—— 型胶原,且随着培养时间的延长,表达 型胶原的细胞越来越多[23]。L ee等[24]将经T GF2Β3诱导向软骨分化的M SC s 注射到一个新型的膀胱内软骨形成的模型中,注射后14周,黏膜下层发现大量软骨形成。H E、阿新蓝和其它特异性染色确认软骨分化。该细胞治疗技术为临床上治疗膀胱输尿管反流、反流性食管炎、尿失禁和软骨再生提供了可能性。
K ram er等[25]的实验发现,与牙周膜细胞直接接触或培养体系内添加牙周膜分泌的因子诱导的M SC s 可在体外获得牙周膜样细胞特征。提示用M SC s修复或再生牙周组织的可行性。
最近,我们在实验中研究了M SC s在皮肤愈合过程中的应用,发现M SC s能通过分化成血管内皮细胞、表皮细胞等参与皮肤创面的修复。付小兵等[17]研究发现,将猪的M SC s体外扩增后移植到皮肤创面处,能显著提高皮肤创面愈合的质量。方利君等[15]发现,将猪的M SC s移植到自体皮下后,能表达血管内皮细胞的标志。该结果不仅表明了M SC s向皮肤分化的潜能,且为M SC s用于皮肤修复提供了新的思路。
1.3 通过分泌某些细胞活性因子来治疗疾病
除细胞替代治疗外,M SC s还能通过分泌某些细胞活性因子治疗某些疾病。由于成体大脑损伤后很少出现神经发生和轴突再生,所以中枢神经损伤后其自发修复很有限。因此细胞移植治疗中枢神经损伤就有了意义。M SC s能通过自体移植进行替代治疗。W islet2 Gendeb ien等[26]实验发现移植的M SC s可通过释放活性骨形成蛋白4(bone m o rp hogen itic p ro tein4, BM P24)有益于神经祖细胞和干细胞内的星型胶质细胞的生长。
1.4 系统性移植时定位到特定的器官或组织治疗局部病变
M SC s还能在进行系统性移植时,定位到特定的器官或组织治疗局部病变,虽然机制尚不清楚,但很多实验结果支持这种定位理论。M SC s能通过分化为心肌细胞,参与恢复心肌梗死并预防梗死后充血性心力衰竭,临床前的动物实验表明这种治疗能重建心脏血管,肌肉和功能。将M SC s直接注射到梗死区,或经静脉注射后,发现其均能定位于损伤区,分化为心肌细胞,且能预防有害的重构并改善心功能[27,28]。另外,同时患有SC I D和进行性假肥大性肌营养不良的儿童接受骨髓移植治疗13年后进行肌肉组织活检,发现肌肉有供体来源的细胞核。对其骨髓进行分析发现,骨髓内一小部分细胞也来源于移植的骨髓。虽然无证据证明供体来源的肌细胞能减轻肌营养不良的病程进展,但至少提示M SC s能定位于病变的组织。在患者肌肉内发现供体细胞为患有相同疾病的患者带来了希望,也使M SC s移植对肌肉疾病的患者进行治疗提供了理论依据[29]。
此外,动物实验发现M SC s对肝脏纤维化有一定的治疗作用。史明霞等[30]用CC l4制作雌性小鼠肝纤维化模型,在损伤后立即或1周后经尾静脉注射M SC s,2周或5周后检测受体小鼠肝脏的纤维化程度和供体细胞的植入。结果发现,CC l4损伤后立即注射M SC s,可以使肝脏损伤程度明显减轻,减少胶原沉积,使肝脏羟脯氨酸含量及血清纤维化指标显著下降;而损伤1周
后注射细胞则无明显变化。免疫荧光、PCR和荧光原位杂交方法证实,在受体肝脏中有供体细胞植入,呈上皮细胞形态,并表达白蛋白,但是数量很少。因此我们认为M SC s具有潜在的植入肝组织的能力,并可能启动肝组织的内源性修复,减轻CC l4导致的肝纤维化。
2 基因治疗
由于M SC s具有多向分化的干细胞特征,体外易于分离和扩增,回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活,且多种外源目的基因可整合至M SC s基因组DNA中并能长期表达,因此,M SC s作为一种理想的靶细胞可用于基因治疗。
Chuah等[31]构建B区缺失的 因子(Facto r ,F )c DNA逆转录病毒载体,以人M SC s为靶细胞,在优化的转导条件下体外可表达 因子700～2500mU (106cell?24h)。将经过转导的M SC s以(115～310)×106的剂量移植入NOD SC I D小鼠的脾脏后,小鼠体内人F 水平能达到13±4ng m l并保持3周。Ch iang等[32]比较了质粒载体转染和逆转录病毒载体转导的犬M SC s的转染效率和体外表达人F 的水平,结果显示两者都能表达人的F ,且逆转录病毒转导的M SC s效率更高,并能分泌更高水平的人F 。提示M SC s系统在血友病A的基因治疗方面有潜在的应用价值。
T ang等[33]将羊骨髓来源的M SC s用人BM P22基因转染后注射入裸鼠体内,发现转染的M SC s能在注射部位分化成骨。这说明M SC s不仅能稳定表达转染的外源基因,而且表达的外源基因具有生物活性。
既往文献报道M SC s改善中风大鼠神经功能缺陷,其部分原因是该细胞分泌的细胞因子的作用。为了增强该细胞因子的效应,Ku rozum i等[34]用突变的F R GD腺病毒载体将脑源性神经营养因子基因转染了人M SC s,并研究了该细胞对大鼠大脑中动脉短时间阻塞模型的神经功能恢复的影响。结果发现,脑源性神经营养因子基因改良的M SC s治疗组能促进大脑中动脉闭塞模型的神经功能恢复并减少梗塞面积,且缺血区边缘凋亡细胞数量比对照组少。
Po tapova等[35]用心脏起搏器基因(HCN2基因)转染了人的M SC s,发现转染的细胞能加速新生大鼠心室细胞的搏动。结果说明基因修饰的人M SC s能表达功能性HCN2通道,模拟心肌细胞内HCN2基因过表达,提示M SC s能用作将起搏器基因导入心脏的载体。3 生物组织工程
除了通过细胞移植来修复受损组织和器官, M SC s还能通过组织工程的方法参与受损组织和器官的修复。
骨缺损的临床治疗是一个比较棘手的问题。虽然自体或异体骨移植是治疗骨缺损的一种疗效相对较好的方法,但限于骨来源的问题,在临床上的应用很受限制。如何构建组织工程骨并用于临床修复骨缺损,就成了一个令医学界十分关注的问题。由于M SC s的自我复制和多向分化的能力,近年来成了组织工程骨构建过程中最常用的种子细胞[36]。E l2Am in等[37]研究发现,将M SC s种植于多孔的生物可降解聚合材料上以后,能形成有功能的组织工程化骨,植入严重骨缺损处能修复骨缺损。Yam ada等[38]把富含血小板血浆当作体外扩增的M SC s的同源支架构建组织工程骨并移植入动物体内,对照组动物行微粒骨移植治疗作为对照,发现M SC s加富含血小板血浆治疗组在2周和4周时新生成骨和新生血管化情况比微粒骨移植组治疗效果更好。
除了构建组织工程骨,M SC s在其他的结缔组织工程方面也有着广泛的应用。W ak itan i等[39]将自体M SC s种植在 型胶原凝胶上构建的组织工程软骨,可以修复膝关节软骨全层缺损。同样,M SC s也能通过组织工程的方法促进肌腱的愈合。Young等[40]将骨髓来源的M SC s与 型胶原混合并植入恢复中的跟腱,随后可见M SC s治疗组较对照组有更好的力学特性,组织学上可见治疗组跟腱内细胞和胶原纤维排列更接近正常跟腱。
另外,由于M SC s能分化为具有肝细胞功能的肝脏上皮细胞,所以M SC s也被用于生物人工肝的研究[41],以治疗肝硬化等原因导致的肝功能衰竭。
4 免疫治疗
L e B lanc等[42,43]的研究表明,M SC s无免疫原性,不刺激同种异体反应性,且能逃避细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的溶解。因此M SC s能在人类白细胞抗原配型不同的个体间移植,不需要对宿主进行免疫抑制。另外,成体M SC s具有免疫抑制性,因为它们在体外能减少同种异体反应性和细胞毒性淋巴细胞的产生。在体内,成体M SC s能延迟错误配型的狒狒的皮肤移植物的排斥反应。这种免疫抑制特征在胎儿的最初3个月不显著,但能被干扰素Χ诱导。他们还研究了当淋巴细胞在有M SC s存在的情况下被活化时淋巴细胞活化标志的表达的情况,发现M SC s能抑制血细胞凝集素刺激的CD3+,CD4+和CD8+淋巴细胞的增生,减
少淋巴细胞活化标志的表达,且抑制淋巴细胞增生。同时发现环孢素A和M SC s的免疫抑制作用不相互干扰。Go therstrom等[44]在实验中发现成体M SC s在体外能减少淋巴细胞的增生。但当把成人和胎儿M SC s 加入含有外周血淋巴细胞和胎肝细胞的混合淋巴细胞培养液内后,发现成人M SC s抑制混合淋巴细胞增生,但胎儿M SC s不抑制混合淋巴细胞增生,却能抑制促有丝分裂原诱导的淋巴细胞增生。
这些发现意味着M SC s不仅自己不刺激同种异体反应性,而且还能抑制宿主的免疫反应,可用于有些免疫相关的疾病的治疗。其中最有意义的,就是在治疗移植物抗宿主反应中的应用[45]。L e B lanc等[46]已经将这一研究成果用于临床。他们给一位肝肠联合移植后严重移植物抗宿主病的患者移植了M SC s,患者临床症状明显减轻,并维持至少1年不复发。
除了上述免疫疾病的治疗外,M SC s在肿瘤的免疫治疗方面也扮演着非常重要的角色[47,48]。脑神经胶质瘤动物模型治疗实验结果表明,M SC s拥有良好的迁移能力,并能抑制神经胶质瘤细胞的增生。将M SC s 注射到恶性神经胶质瘤内后,能明显地抑制肿瘤生长并增加荷瘤大鼠的存活时间。将M SC s用编码人白介素2基因的腺病毒载体进行基因修饰后,显著增强其抗肿瘤效应,并明显延长荷瘤大鼠的存活时间。所以,用M SC s当作进行基因治疗的靶向载体将会是治疗顽固性脑瘤的有效方法。这也为其他肿瘤的免疫治疗开拓了新的思路。
5 存在问题和展望
在对M SC s进行研究的过程中,研究者都希望得到大量的纯化的未分化干细胞成分。由于不同实验室对M SC s的研究方向上的不同和在分离培养M SC s方案上的差异,对M SC s本身的研究目前还不系统,不全面。目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定M SC s,也就不能保证M SC s的同质性。如何有效地获得大量同质性的M SC s,依赖于对其生物学特性和异质细胞群中各类细胞标志物的进一步研究。
尽管目前已观察到M SC s在移植入体内后能定位到损伤的组织[49]并分化为相应的细胞参与创伤修复,但仍有许多基本问题需要进一步解决。如:这些M SC s 是如何定位到损伤部位的?引起它们定位到局部的始动因素和其中的调节机制是什么?它们是如何分化为其它细胞的?是什么因素在调控或决定着细胞的分化及功能?这些问题的解决,必将拓宽M SC s在临床上的应用范围。
尽管如此,由于M SC s具有公认的多向分化潜能等干细胞的特征和易于体外扩增等特征,已被认为是一种理想的细胞治疗、组织工程[50,51]和基因治疗的靶细胞。相信研究的进一步深入,一定会为其临床应用带来新的更为广阔的前景。
6 参考文献
1Kassem M,K ristiansen M,A bdallah BM.M esenchym al stem cells:cell bi o logy and po tential use in therapy.Basic C lin Pharm aco l Toxico l,2004,95(5):2092214.
2吴清法,王立生,吴祖泽.间充质干细胞的来源及临床应用.军事医学科学院院刊,2002,26(3):2132217.
3W eaver A,R yder WD,T esta N G.M easurem ent of long2term culture initiating cells(L TC2I C s)using li m iting diluti on: comparison of endpo ints and strom al suppo rt.Exp H em ato l, 1997,25(13):133321338.
4Ko ller M R,Palsson M A,M anchel I,et a l.L ong2term culture2 initiating cell expansi on is dependent on frequent m edium exchange com bined w ith strom al and o ther accesso ry cell effects.
B lood,1995,86(5):178421793.
5K itam ura S,O hgush i H,H iro se M,et a l.O steogenic differentiati on of hum an bone m arrow2derived m esenchym al cells cultured on alum ina ceram ics.A rtif O rgans,2004,28(1):72282. 6Chen LB,J iang XB,Yang L.D ifferentiati on of rat m arrow m esenchym al stem cells into pancreatic islet beta2cells.W o rld J Gastroentero l,2004,10(20):301623020.
7Cham berlain JR,Schw arze U,W ang PR,et al.Gene targeting in stem cells from individuals w ith o steogenesis i m perfecta.Science, 2004,303(5661):119821201.
8A rinzeh TL,Peter SJ,A rcham bault M P,et a l.A llogeneic m esenchym al stem cells regenerate bone in a critical2sized canine segm ental defect.J Bone Jo int Surg(Am),2003,85(10):19272 1935.
9C revensten G,W alsh A J,A nanthak rishnan D,et a l.
Intervertebral disc cell therapy fo r regenerati on:m esenchym al stem cell i m p lantati on in rat intervertebral discs.A nn B i om ed Eng,2004,32(3):4302434.
10Barry FP.M esenchym al stem cell therapy in j o int disease.
N ovartis Found Symp,2003,249:86296;discussi on962102,1702 104,2392141.
11Grinnemo KH,M ansson A,D ellgren G,et a l.Xeno reactivity and engraftm ent of hum an m esenchym al stem cells transp lanted into infarcted rat m yocardium.J T ho rac Cardi ovasc Surg,2004,127
(5):129321300.
12D ennis JE,M erriam A,Aw adallah A,et a l.A quadri po tential m esenchym al p rogenito r cell iso lated from the m arrow of an adult mouse.J Bone M iner R es,1999,14(5):7002709.
13P rockop DJ.M arrow strom al cells as stem cells fo r nonhem atopo ietic tissues.Science,1997,276(5309):71274.
14Sugaya K.Po tential use of stem cells in neuro rep lacem ent therap ies fo r neurodegenerative diseases.Int R ev Cyto l,2003, 228:1230.
15方利君,付小兵,孙同柱,等.骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究.中华烧伤杂志,2003,19(1):22224.
16韩冰,付小兵,孙晓庆.骨髓基质细胞基因表达的研究进展.中国修复重建外科杂志,2005,19(2):1532158.
17付小兵,方利君,王玉新,等.骨髓间充质干细胞自体移植提高猪皮肤创面修复质量的初步研究.中华医学杂志,2004,84(11): 9202924.
18Chapel A,Bertho JM,Bensidhoum M,et a l.M esenchym al stem cells hom e to injured tissues w hen co2infused w ith hem atopo ietic
cells to treat a radiati on2induced m ulti2o rgan failure syndrom e.J Gene M ed,2003,5(12):102821038.
19D eng Y,Guo X,Yuan Q,et a l.Efficiency of adenoviral vecto r m ediated CTLA4Ig gene delivery into m esenchym al stem cells.
Ch in M ed J(Engl),2003,116(11):164921654.
20O rtiz LA,Gam belli F,M c B ride C,et a l.M esenchym al stem cell engraftm ent in lung is enhanced in response to bleom ycin expo sure and am eli o rates its fibro tic effects.P roc N atl A cad Sci U SA, 2003,100(14):840728411.
21R asulov M F,V asilchenkov AV,O nishchenko NA,et al.F irst experience of the use bone m arrow m esenchym al stem cells fo r the treatm ent of a patient w ith deep sk in burns.Bull Exp B i o l M ed, 2005,139(1):1412144.
22B ruder SP,Jais w al N,R icalton N S,et a l.M esenchym al stem cells in o steobi o logy and app lied bone regenerati on.C lin O rthop R elat R es,1998,(355Supp l):2472256.
23P ittenger M F,M ackay AM,Beck SC,et a l.M ultilineage po tential of adult hum an m esenchym al stem cells.Science,1999, 284(5411):1432147.
24L ee JW,K i m YH,K i m SH,et al.Chondrogenic differentiati on of m esenchym al stem cells and its clinical app licati ons.Yonsei M ed J,2004,45Supp l:41247.
25K ram er PR,N ares S,K ram er SF,et al.M esenchym al stem cells acquire characteristics of cells in the peri odontal ligam ent in vitro.
J D ent R es,2004,83(1):27234.
26W islet2Gendebien S,B ruyere F,H ans G,et a l.N estin2po sitive m esenchym al stem cells favour the astroglial lineage in neural p rogenito rs and stem cells by releasing active BM P4.BM C N euro sci,2004,5(1):33244.
27P ittenger M F,M artin BJ.M esenchym al stem cells and their po tential as cardiac therapeutics.C irc R es,2004,95(1):9220.
28W ang FS,T rester C.Bone m arrow cells and m yocardial regenerati on.Int J H em ato l,2004,79(4):3222327.
29Smogo rzew ska E M,W einberg K I.T reatm ent p rogress of
D uchenne M uscular D ystrophy(DM D).M ed W ieku Roz wo j,
2004,8(1):25232.
30史明霞,房佰俊,廖联明,等.FL K1+间充质干细胞减轻四氯化碳导致的肝纤维化的研究.生物工程学报,2005,21(3):3962401. 31Chuah M K,V an D amm e A,Z w innen H,et al.L ong2term persistence of hum an bone m arrow strom al cells transduced w ith facto r 2retroviral vecto rs and transient p roducti on of therapeutic levels of hum an facto r in nonm yeloablated i m m unodeficient m ice.H um Gene T her,2000,11(5):7292738.
32Ch iang GG,R ubin HL,Cherington V,et al.Bone m arrow strom al cell2m ediated gene therapy fo r hemoph ilia A:in vitro exp ressi on of hum an facto r w ith h igh bi o logical activity requires the inclusi on of the p ro teo lytic site at am ino acid1648.
H um Gene T her,1999,10(1):61276.
33T ang T T,Xu XL,D ai KR,et a l.Ectop ic bone fo rm ati on of hum an bone mo rphogenetic p ro tein22gene transfected goat bone m arrow2derived m esenchym al stem cells in nude m ice.Ch in J T raum ato l,2005,8(1):327.
34Kurozum i K,N akam ura K,T am iya T,et a l.BDN F gene2 modified m esenchym al stem cells p romo te functi onal recovery and reduce infarct size in the rat m iddle cerebral artery occlusi on model.M o l T her,2004,9(2):1892197.35Po tapova I,P lo tnikov A,L u Z,et al.H um an m esenchym al stem cells as a gene delivery system to create cardiac pacem akers.C irc R es,2004,94(7):9522959.
36T uan R S,Bo land G,T uli R.A dult m esenchym al stem cells and cell2based tissue engineering.A rth ritis R es T her,2003,5(1):322
45.
37E l2Am in SF,A ttaw ia M,L u HH,et a l.Integrin exp ressi on by hum an o steoblasts cultured on degradable po lym eric m aterials app licable fo r tissue engineered bone.J O rthop R es,2002,20(1): 20228.
38Yam ada Y,U eda M,N aik i T,et a l.A utogenous injectable bone fo r regenerati on w ith m esenchym al stem cells and p latelet2rich p las m a:tissue2engineered bone regenerati on.T issue Eng,2004, 10(526):9552964.
39W ak itani S,Go to T,P ineda SJ,et a l.M esenchym al cell2based repair of large,full2th ickness defects of articular cartilage.J Bone Jo int Surg(Am),1994,76(4):5792592.
40Young R G,Butler DL,W eber W,et al.U se of m esenchym al stem cells in a co llagen m atrix fo r A ch illes tendon repair.J O rthop R es,1998,16(4):4062413.
41张卫光.间充质干细胞与生物人工肝的研究进展.解剖科学进展, 2004,10(3):2322234.
42L e B lanc K,R as m usson I,Go therstrom C,et a l.M esenchym al stem cells inh ibit the exp ressi on of CD25(interleuk in22recep to r) and CD38on phytohaem agglutinin2activated lymphocytes.Scand J
I mm uno l,2004,60(3):3072315.
43L e B lanc K.I mm unomodulato ry effects of fetal and adult m esenchym al stem cells.Cyto therapy,2003,5(6):4852489.
44Go therstrom C,R ingden O,W estgren M,et a l.
I mm unomodulato ry effects of hum an foetal liver2derived
m esenchym al stem cells.Bone M arrow T ransp lant,2003,32(3): 2652272.
45F rank M H,Sayegh M H.I mm unomodulato ry functi ons of m esenchym al stem cells.L ancet,2004,363(9419):141121412.
46L e B lanc K,R as m usson I,Sundberg B,et al.T reatm ent of severe acute graft2versus2ho st disease w ith th ird party hap lo identical m esenchym al stem cells.L ancet,2004,363(9419): 143921441.
47H am ada H,Kobune M,N akam ura K,et al.M esenchym al stem cells(M SC)as therapeutic cyto reagents fo r gene therapy.Cancer Sci,2005,96(3):1492156.
48N akam ura K,Ito Y,Kaw ano Y,et al.A ntitumo r effect of genetically engineered m esenchym al stem cells in a rat gli om a model.Gene T her,2004,11(14):115521164.
49段小军,杨柳,周跃,等.增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪.中国修复重建外科杂志,2006,20
(2):1022106.
50董世武,应大君,朱楚洪,等.核心结合因子Α1基因修饰骨髓间充质干细胞对骨缺损的修复研究.中国修复重建外和杂志,2006,20
(5):5552559.
51葛薇,姜文学,李长虹,等.骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白封闭剂体内构建可注射性组织工程软骨.中国修复重建外科杂志,2006, 20(2):1392143.
(收稿:2005212213 修回:2006202223)
(本文编辑:董奇男)
骨髓间充质干细胞研究进展(一)
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
间充质干细胞在医学中的应用文献综述
间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院：生命科学学院 年级：2011 姓名：张胜男
前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！ 正文： 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性
间充质干细胞培养方法
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
间充质干细胞研究进展及其临床应用前景
?２２８?生国篮旦匡煎！Ｑ塑生！！旦笠！鲞筮丝塑￡！ｉ塑旦墼丛鲤：堕！！！Ｑ嫂：Ｙ丛：堡：些！：１２ 病情持久不愈，气血郁滞，经脉失畅，化湿生痰，痰血瘀结而致。根据其病机，选用小金丸治疗，取得较好疗效，值得推广。５治疗乳腺囊性增生病悼３ 将５００例乳腺囊性增生病患者随机分为治疗组和对照组各２５０例，对照组单用三苯氧胺治疗，治疗组在对照组相同治疗的基础上加用小金丸治疗。结果：治疗组总有效率为９２．０％，对照组总有效率为６７．６％，两组有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）。乳腺囊性增生病系内分泌障碍性增生病，一是体内女性激素代谢障碍，尤其是雌孕激素比例失调，使乳腺实质增生过度和复旧不全；二是部分乳腺实质成分中女性激素受体的质和量的异常，使乳房各部分增生程度参差不齐。三苯氧胺与此激素竞争受体，阻断过高的雌激素作用于乳腺组织，但部分患者临床效果甚微，或服药期间疗效较好，停药后复发。小金丸的药理实验证实对乳腺泡和导管增生有明显抑制作用，同时能抑制纤维母细胞摄取１４．甘氨酸减少胶原纤维合成，又能促进细胞吞噬胶原纤维及其断片，增强细胞溶酶体释放组织蛋白水解胶原纤维，从而消降纤维细胞的增生、粘连，疗效肯定，不良反应小，但疗程较长。中医学认为乳腺增生病主要是气机郁滞，痰瘀互结，冲任失调所致，治当理气化瘀散结，活血祛瘀为原则。小金丸方中麝香走窜通络，散结开壅，枫香脂调气血，土鳖消肿定痛，地龙通络，制草乌祛风湿，温经散寒，当归活血，香墨消肿化瘀，五灵脂、乳香、没药活血化瘀、消肿定痛。诸药合用有温通、活血、消壅、散结之效。可使气旺络通，痰散结消。配合三苯氧胺治疗乳腺增生病，标本兼治，故能取得较好疗效。 ６治疗慢性盆腔炎包块怕１ 将６０例患者（疾湿疥阻兼脾肾两虚型）分为２组各３０例，治疗组口服小金丸和血宝胶囊配合宫颈湿敷血竭粉治疗。对照组用西医抗炎治疗。治疗前后Ｂ超测量盆腔包块的大小、检测雌激素水平、观察临床症状消失的情况。结果：总有效率治疗组８６．６７％，对照组为６３．３３％，２组比较，差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５）；随访半年复发率，治疗组为２３．０８％，对照组为６３．１５％，２组比较，差异有非常显著性意义（Ｐ＜０．０１）；雌激素水平治疗前后比较及治疗后组问比较，差异均无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。慢性盆腔炎包快属中医学瘢瘕范畴，多起于经行产后，胞脉胞络空虚，血室正开，痰湿之邪乘虚而入，蕴结胞宫；失治误治，余邪未净，迁延１３久，病及血分，致瘀积胞中，积聚成瘾。小金丸功能散结消肿，化瘀止痛，原用于痰气凝滞所致的瘰疬、瘿瘤、乳岩、乳癖，用于此药治疗盆腔炎包块属异病同治，有异曲同工之妙。现代药理研究表明小金丸具有抗炎、消肿、抗肿瘤和镇痛作用。血宝胶囊具有益肾健脾、补阴培阳之效。血宝既可助小金丸化痰散结、活血消ｊ｝毂之力，又可防止小金丸攻邪太过损伤正气。廊竭粉是伤科活血疗伤之圣药，取其破散瘾积宿血之功。内服外用双管齐下，共奏化痰散结、化瘀消瘕之功，使邪去而不伤正。本研究表明，用中成药扶正消瘾法治疗慢性盆腔炎包块具有无创性、服用简便、疗效好，复发率低的优点。 ７治疗结节性筋膜炎ｏ¨ ５例结节性筋膜炎患者，内服小金丸０．６ｇ，２次／ｄ。局部服用黄金膏（金黄散＋凡士林）＋四虎散（由生草乌、生半夏、生南星、狼毒组成）外敷，方法：根据肿块大小，先用金黄膏涂布于纱布上，再掺加四虎散，外面用单层纱布包裹，最后在药物表面撒少量蒸馏水，敷贴患处，每２ｄ换１次。结果５例均治愈。最短治愈时间２６ｄ，最长治愈时间３５ｄ，平均治愈时间３０．８ｄ。结节性筋膜炎又称为假肉瘤性筋膜炎，是一种发生于浅筋膜的良性增生性病变。小金丸具有消痰化坚、活血止痛、消结散毒的作用；金黄散清热、解毒、消肿、定痛；四虎散化痰散结止痛。内外治结合，共奏解毒化肿、化痰散结、活血止痛之效，故用于治疗本病能取得较满意的疗效。 参考文献 ［１］秦树光，等．小金丸联合甲状腺素片治疗甲状腺肿的ｌ｜缶床分析．现代中西医结合杂志，２００５，１４（８）：１０１８． ［２］屈江宁．小金丸治疗良性前列腺增生８０例．世界中医药，２００８，３（５）：２７７． ［３］马宝华，等．小金丸治疗带状疱疹后遗神经痛４４例．中国中医急诊，２００３，１２（５）：４７３． ［４］余勇．小金丸治疗聚合性痤疮２４例．医药导报，２０００，１９（３）：２６３． ［５］杨玉国，等．小金丸与三苯氧胺合用治疗乳腺囊性增生病２５０例分析．实用中医药杂志，２００５，２１（５）：２６１． ［６］邱明英，等．小金丸为主治疗慢性盆腔炎包块的临床研究．新中医，２００８，４０（４）：５５ ［７］吴亚旭．中药治疗结节性筋膜炎５例．江苏中医药，２００５，２６（１１）：２７． 间充质干细胞研究进展及其临床应用前景李玲玲李晶 【关键词】骨髓间充质干细胞；多向分化；组织工程 间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）通常是指从骨髓或其他组织中分离到的在体外具有多向分化潜能的一类细胞。自Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等首次报道骨髓中有少量细胞在培养过程中能贴壁分化形成类似骨、软骨的集落后，人们对这些细胞产生了浓厚兴趣。随后从鼠、兔、犬、人等多种动物的骨髓中均分离到了这种贴壁细胞。它们具有多向分化潜能， 作者单位：１３００２１吉林省前卫医院（李玲玲）；吉林省人民医院中西医结合科（李晶）在体外不同诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞…。 与软骨细胞、骨髓基质细胞、胚胎干细胞等相比，ＭＳＣｓ具有强大的增殖力、较强的多向分化潜能，而且具有取材方便、便于自体移植、便于外源基因转染及表达调控等诸多优点。最近。还发现ＭＳＣｓ具有免疫调节功能嵋ｏ。因此，ＭＳＣｓ是组织工程的一种新的理想种子细胞。目前，已知ＭＳＣｓ是源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中¨１。本文就ＭＳＣｓ 万方数据
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
间充质干细胞培养方法
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.360docs.net/doc/df357122.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.360docs.net/doc/df357122.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
17.1.9间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病
间充质干细胞移植治疗系统系性硬皮病 对一名安省的硬皮病（scleroderma）的患者来说，一个实验性的干细胞治疗方式为其健康状况带来180度的转变。安省圣托马斯（St. Thomas）的49岁居民慕斯卡特（Dan Muscat，图）于2014年患上系统性硬皮病，由于他皮肤胶原增生，导致他全身皮肤变硬变紧。作为一名珠宝商，他的工作也变得困难而痛苦。 他说：我的手卷成一团并且僵硬，我的脸上和脖子上的皮肤都变硬，我无法转动我的脖子，甚至不能转动身躯。步行超过20步几乎变得不可能。」他还失去了开车的能力，因为他的膝盖不能弯曲，无法踩到刹车或者油门。 之前没有任何治疗方法可以阻止这一疾病的发展。他的医生认为他只有几个月的活命时间。导致这种自身免疫性疾病原因不清楚，而疾病最终会袭击肺部和其他内脏。 慕斯卡特开始研究在加拿大、美国和欧洲进行的干细胞治疗测试。他通过加拿大干细胞基金会（Canadian Stem Cell Foundation）找到了艾金斯医生（Dr. Harry Atkins），艾金斯是渥太华医院（Ottawa Hospital）的干细胞治疗专家，他愿意为慕斯卡特治疗。 艾金斯表示，对于合适的病人来说，这一治疗方法确实对改善他们的生活质量有重要影
响。一旦免疫系统能够正常运作并且停止损伤皮肤，皮肤就会自愈。为硬皮病做干细胞移植在加拿大还是很新的事物。其他国家特别是在欧洲对此作出很多研究，而效果令人鼓舞。艾金斯医生曾经为其他自身免疫性疾病做过干细胞移植，例如多发性硬化病、僵硬人综合症、重症肌无力等。 慕斯卡特是加拿大首个运用在美国和欧洲得到测试的治疗方法的病例。该治疗方法从去年6月开始，医生们从慕斯卡特身上获取干细胞。然后使用强效的化疗药物，杀死导致他出现硬皮病的失效免疫系统。经过淨化的干细胞重新植入他身体内，目标是重新启动他的免疫系统，以便能够停止他的疾病。 慕斯卡特说，自从接受治疗以来，身体一天天好起来。他发现从6月以来，他的动作有所改善，紧绷情况已经消失。他逐渐可以恢复使用自己双手，现在又可以开始驾驶他心爱的赛车。 加拿大干细胞基金会的总裁兼首席执行官普莱斯（James Price）表示，对那些目前没有其他治疗方法的多种疾病患者来说，干细胞治疗能够给他们带来希望。普莱斯说，基金会的目标是能够在10年内令新的干细胞治疗方法得到运用。 该基金会指出，有证据显示，干细胞移植可以令其他严重自身免疫性疾病例如多发性硬化病、狼疮、类风湿关节炎等疾病的情况得到持续缓解。干细胞疗法现在也正在被研究用于治疗肌萎缩性侧索硬化、感染性休克、骨关节炎、糖尿病、黄斑变性等疾病。 在慕斯卡特的病情明显缓和之后，加拿大的其他干细胞治疗中心将会考虑为那些符合相关治疗条件的硬皮病患者提供这种治疗方法，为其他遭受这一疾病折磨的病人们带来希望。
骨髓间充质干细胞的分离与培养
骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ
间充质干细胞临床研究进展
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 间充质干细胞临床研究进展 间充质干细胞临床研究进展自 1867 年德国病理学家Cohnheim 在研究伤口愈合过程时，首次提出成纤维细胞可能来源于骨髓，即骨髓可能含有非造血干细胞的观点。 1869年，Goujon 发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了骨髓具有成骨能力。 但直到 1976 年，Friedenstein 和 Petrakova 首先报道，通过帖壁培养的方法分离得到间充质干细胞（MSCs）。 1987 年，Friedenstein 等将骨髓放置在塑料培养皿中培养，发现骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，由于能分化为多种中胚层来源的间充质细胞，因此被称之为间充质干细胞。 1991 年 Caplan 把骨髓中具有黏附于塑料培养皿表面、在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞。 1999 年，Pittenger 等在《Science》（科学）杂志上发表文章，对从骨髓标本中分离得到 MSC，应用流式细胞分析术分析 MSC，结果表明分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化条件诱导下，可以形成成骨细胞、成软骨细胞或脂肪细胞，而且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。 一系列的研究已经证明 MSC 可以分化为神经、心脏、肝脏、 1 / 4
间充质干细胞培养大全.
1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与 β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前
间充质干细胞药物开发策略
间充质干细胞药物开发策略 干细胞药物开发的目的是，从“一对一”的个体化干细胞临床应用转向“一对多”的临床治疗方案，为临床提供标准化的干细胞制品。药物的开发需要遵循常规药物开发的流程，包括：药学研究、非临床研究、临床试验申请、早期临床试验、确证性临床试验、新药申请和批准上市等过程。 1干细胞制剂开发要点概述 干细胞制剂药学研究，主要包括工艺开发与质量评价： ①干细胞库与工作细胞库建立： 供者筛查、组织采集，细胞分离、纯化、培养、保藏、鉴别、效力检测，以及生物学特性、遗传学稳定性研究，干细胞库技术标准及工作标准建立； ②干细胞制剂工艺开发与药学研究： 大规模细胞扩增、细胞制备工艺、剂型选择、包装选择、处方筛选、制剂冻存/复苏工艺，体外操作对干细胞生物学特性的影响，过程质量控制，干细胞药物放行标准建立； ③干细胞制剂冷链运输和稳定性研究： 产品冻存与复苏、冷链运输技术、临床快速检验、稳定性研究等，稳定性研究包括冻存条件下制剂影响因素试验、长期试验，模拟临床应用条件的试验等，通过这些实验获得的药品稳定性信息来确定药物的储存运输条件、包装以及有效期。 干细胞制剂开发原则 干细胞制剂开发过程服从GMP原则，但应充分考虑活的药物与传统药物区别： ①供者细胞的合理性及筛查； ②生产材料应考虑，供者细胞、生产过程细胞分类分级管理，生产用原材料的风险评估， 外源因子去除，限制动物及人来源材料，基因修饰/改造按高风险管控，辅料使用考虑必要性、安全性和合理性； ③制备工艺与过程控制应证明可行性与稳健性，生产工艺的设计（QbD）应避免细胞发生 非预期的或异常的变化，全过程监控、持续改进，用连续自动化、全封闭手段减少污染； ④强调过程控制与制品放行互补，高风险操作评估，细胞制剂与回输制剂转换验证； ⑤质量研究取代表批次及生产阶段细胞的特性、功能性、纯度和安全性等分析； ⑥质量控制基于过程理解，兼顾认知，逐步完善，确证性与商业化保持一致； ⑦临床质量核准，方法验证与药典适用性验证，快速微量方法相互验证； ⑧稳定性研究应采取连续工艺，适用包装密封性研究、冷冻储存适应性研究等，运输条件，
间充质干细胞培养方法
间充质干细胞培养方法 １、间充质干细胞MSC基本形态?2。干细胞应用与干细胞调控、?３、间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞ＭＳC培养得合适气体环境 ５、细胞培养板得选择 6. 如何选用细胞培养基? 7. 如何维持培养液p H?８。血清与干细胞得培养?9、胎牛血清(F B S ) 10.细胞得细菌、真菌污染及排除 就是否需要灭活? １１、细胞培养污染得预防 1４。胶原酶V １２、使用胰蛋白酶时加入 E ＤTA得目得就是什么?１3、胶原酶得种类与选型? S胰酶 １5、干细胞得种类与表面标记 18. 干细胞老化得表现与处16.间质干细胞培养原理概述?１7、间质干细胞成脂与成骨诱导分化? 理 20。冷冻保护剂作用与选择 1９、细胞传代消化过程指导? 21。细胞冻存指导 2２。干细胞冷冻与复苏 2３、移植细胞得基因修饰?１、间充质干细胞ＭＳC基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。?间充质干细胞ＭSＣ基本形态:形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同得突起、可瞧到细胞成螺旋状生长。? 2、干细胞应用与干细胞调控?干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展。? 2.1内源性调控?干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 (1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得。细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要、如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ａ。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?(2)转录因子得调控 在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4 就是必需得。Oct4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FGF－4 等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oc ｔ4 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子(LI Ｆ)对培养得小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得、又如Tｃf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要、Tcf／Leｆ就是Wnｔ信号通路得中间介质,当与β－Ｃateｎin形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控?除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(１)分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们就是TＧＦβ家族与Ｗｎt 信号通路、比如TＧF 家族中至少