小麦成株抗条锈性抑制差 交文库构建及表达序列标签分析
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):976~981
*基金项目： 国家重点基础研究发展规划 （973） 前期专项 （No.2006CB708208）、 教育部重大科技培育项目 （No.2004-295）、 教育部长江学者和创
新团队发展计划项目 （No.IRT0558）、 国家自然科学基金项目 （No.30671350） 和高等学校学科创新引智计划项目 （No.B07049） 资助。 **通讯作者。Author for correspondence.教授， 博士生导师， 主要从事病原物与寄主植物互作关系的细胞学和分子生物学研究。 E-mail ：﹤kangzs@https://www.360docs.net/doc/d27566511.html, ﹥. 收稿日期：
2007-03-26 接受日期： 2007-05-05 ·研究论文
· 小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析 *
黄雪玲 1 ， 喻修道 1 ， 屈志鹏 1 ， 王晓杰 1 ， 韩青梅 2 ， 黄丽丽 1 ， 康振生 1，
2
** （1.西北农林科技大学植物保护学院， 杨凌 712100；
2. 陕西省农业分子生物学重点实验室,杨凌712100） 摘要：以成株期抗条锈小麦（
）品种兴资 9104 为材料，依照 CLONTECH 公司 PCR-Select
TM
cDNA Subtraction Kit 方法构建了小麦成株期条锈菌
（ ） 诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization ,
SSH)cDNA 文库。建库质量分析表明,接头连接效率高， 插入片段平均 300bp ， 文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性 克隆进行测序， 用 CAP3软件聚类拼接， 得到 unigenes 41个。与 GenBank 已知序列进行Blastx 分析表明， 所得基因主要涉及植 物的信号传导、 转录调控、 能量与代谢、 蛋白质合成与代谢、 膜转运、 细胞生长分化等。利用 RT-PCR 对 3条基因进行分析， 明确 其在抗病过程中的表达模式。
关键词:小麦?条锈菌?抑制差减杂交? 表达序列标签
（EST ） ?成株抗性 中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2007)06-0976-06
Construction of Suppression Subtractive Hybridization cDNA Library of Wheat
Adult Plant Resistance to Stripe Rust and Analysis of Its Expressed Sequence Tags
HUANG Xue-ling 1 ,YU Xiu-dao 1 ,QU Zhi-peng 1 ,WANG Xiao-jie 1
,
HAN Qing-mei 2 ,HUANG Li-li 1 ,KANG Zhen-sheng 1,2
**
A suppression subtractive hybridization (SSH)cDNA library was constructed with an incompatible combination
between wheat (
)cultivar Xingzi 9104and
f.sp.
at adult plant stage by PCR-Select
TM
cDNA Subtraction Kit (CLONTECH).Detection and analysis of the library construction showed that the technique was efficient in the adaptors ligation,and the average insert fragment size was 300bp.Plasmids were extracted from 96positive clones randomly selected from the library and then sequenced and assembled using CAP3software and 41unigenes were obtained.ESTs similarity analysis was finished by comparing sequences with BLASTx software in non-redundance database of GenBank.The results showed that they related to many biological processes including signal transduction,transcription regulation,protein synthesis and metabolism, membrane transport and cell growth and division.Three sequences were selected to testify their expression profile at different time after inoculating with race CY32by reverse transcription PCR （RT-PCR ）
. ?
?suppression subtractive hybridization(SSH)?expressed sequence tags (ESTs)?
adult plant resistance (APR)
由条形柄锈菌（ f.sp. ）
引起的条锈病是世界范围内小麦重要的真菌病害之 一， 流行发生常常造成小麦严重减产。
国内外大量实 践证明，选育并合理利用抗锈病品种是控制小麦条
锈病经济、 安全和有效的方法。然而，
由主效基因控 制抗性的抗病品种在生产上大面积连续种植后， 由 于条锈菌毒性变异频繁，往往导致小麦品种抗锈性
丧失。 为此， 长期以来人们在探索合理利用主效抗病
第 6期 黄雪玲等:小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析
基因策略的同时，一直在寻求具持久抗病性小麦种 质资源。 近年来， 越来越多的研究表明小麦成株抗性 可能是持久抗病性的组分（Barcellors， 2000； McIntosh， 1992）。
Singh .（2005） 研究发现,小麦对条锈病的持 久抗性是由具有加性效应的成株抗性基因控制的， 认为多个成株抗性基因的累积可以增强抗性，含有 4～5个成株抗性基因的小麦即使在较强的接种压 力下也能表现近免疫。 这一理论已经成为 CIMMYT (International Maize and Wheat Improvement Center)开展小麦抗病育种的指导思想。
成株抗病性是一类苗期感病，但成株期表现中 抗到高抗的抗病类型 （Chen， 2005）。对成株抗性早 期的研究主要集中在新抗源的挖掘及其遗传机制的 研究 （Bariana and McIntosh， 1995）。近年来， 人们开 始注重寻找与成株抗性基因连锁的分子标记进行持 久抗性的培育 （Navabi，2005）。 然而， 目前就成 株抗性的分子机理仍了解甚少。 因此， 开展成株抗性 小麦与条锈菌互作分子机理的研究，对于小麦成株 抗病性的合理利用及小麦条锈病的可持续控制具有 重要的理论和实际意义。
小麦品种兴资 9104是一个成株期抗条锈性材 料。刘红梅等 （2006） 研究表明， 小麦兴资 9104苗期 对条中 32号小种呈感病反应，但成株期对条中 32号小种呈近免疫或免疫反应，含有一对显性成株抗 性基因。 本实验利用抑制差减杂交技术 （suppression subtractive hybridization，SSH）（Diatchenko， 1996）， 富集成株期小麦接种条锈菌后差异表达的基 因片段，构建小麦条锈病成株抗性相关基因的表达 谱。 通过分析参与抗性反应的基因， 探求基因表达模 式及其功能，为进一步揭示小麦成株抗性机理提供 基础资料。
1材料和方法
1.1 材料
供试小麦 （ ） 品种为兴资 9104，由中国农业科学院植物保护研究所徐世昌研 究员提供。供试小麦条锈菌（ f. sp.） 为条中 32号生理小种， 由西北农林科技 大学植物病理研究所提供。将供试小麦按每盆 5粒 播种于直径为 15cm的花盆中。 在小麦孕穗期， 用毛 笔涂抹接种小麦叶片， 对照喷清水处理， 接种后将小 麦置于保湿桶中保湿 24h。分别于接种后 12、 24和 36h剪取接种叶片和对照叶片，置于原 80 ℃保存备 用。留下部分叶片以鉴定反应型。
1.2 抑制差减杂交文库构建
利用 BIOZOL Reagent试剂盒，按照试剂盒所 提供的方法(BIOZOL Total RNA Extraction Protocol)提取小麦叶片总 RNA。 利用琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA质量，并利用核酸蛋白检测仪（NanoDrop R ND-1000） 进行浓度和纯度测定。 用 Oligotex mRNA Spin-Column Kit（QIAGEN， 德国） 从总 RNA中分离 mRNA并进行检测 （检测方法同 RNA）。 抑制差减杂 交具体操作步骤依照 PCR-Select T M cDNA Subtrac- tion Kit（CLONTECH， 日本） 方法进行。以接种病原 菌材料作为差减杂交的实验方(tester)， 以未接种材 料作为驱动方(driver)。
1.3 接头连接效率检测
根据 GenBank已经发表的小麦 基因 (gi： 4098271)序列设计引物， 鉴定接头的连接效率。 扩增片段大小为 497bp。引物为：
FP5'-CTCCTTCCCCATTTCGC-3'；
RP5'-CCAGAGCCAG TTCCACCT-3'。
实验设计及 PCR反应程序按建库说明书进行。 1.4 阳性克隆筛选
SSH产物按 QIAquickr R PCR Purification Kit （QIAGEN， 德国） 纯化试剂盒的方法纯化， 产物经浓 缩后溶于 30滋 L水 中。取纯化的 PCR产物 1滋 L， 按 pGEM-T Easy Vector Systems（Promega， 美国） 的 方法与载体 pGEM-T Easy连接， 形成抑制差减杂交 质粒文库。取 5滋 L连接产物转化 200滋 L大肠杆菌 （ ） JM109的感受态细胞，然后加入 800滋 L LB培养液，37 ℃、 150r/min振荡培养 1.5 h。取 100滋 L菌液涂于含 60滋 g/mL Amp的 LB/ X-gal/IPTG培养板上， 37 ℃培养 14h。挑取白色克 隆， 接种于含 Amp的 LB液体培养基中。震荡培养 过夜， 加 25%甘油后， 原 80 ℃保存。
1.5 文库片段大小检测
随机挑取 17个阳性克隆，接种于含 Amp的 5 mL LB液体培养基。37℃ 180r/min过夜培养。 使用 U-gene质粒微量提取试剂盒 （安徽优晶） 提取质粒 DNA， 用 R玉内切酶对其进行酶切， 检测插入片 段大小。
1.6 阳性克隆序列测定与分析
随机挑取 96个重组子提取质粒 DNA（方法同 1.5）。测序试剂盒为 Bigdye Terminator V3.1Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems， 美国）。用 ABI PRISM3130Genetic Analyzer， 利用 M13 +引物对质 粒进行测序。 用 Phred和 Consed程序将测序峰图文 件转化为序列和质量文件并去除低质量序列 （
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农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年
表１ 反转录 PCR 验证所选序列及引物
Table 1Primer combinations adopted in reverse transcription PCR
序列号 Contig No.
退火温度/℃ Tm 56515661
引物序列 Primer sequences
1.5'-AACAGCCTGAACCTGAATACC-3'?
2.5'-ACCAAGGAATGCGACACC-3'。 1.5'-TAATTTGCACAAGGGACTG -3'? 2.5'-TACAAGAGGAAGGAGGGAG -3'。 1.5'-ATCTGAGCCCATTCCACG-3'? 2.5'-CCCAGTCGCTTCACCATT-3'。 1.5'-GCCGAGAACTGCGACTGC-3'?
2.5'-GCCGAGGCTGTGAGGTAG-3'。
-value<13）和载体序列。用 CAP3 软件对所获得的 EST 序列进行拼接， 生成 contigs 和 singlets ， 然后去
除长度＜100bp 的序列。 将所得到的 unigenes （非冗
余序列）用 BLAST 伊
软件与 NCBI 的非冗余蛋白质 数据库进行本地化比对，-value 设置为 1e-5，其它 BLAST 参数均为默认值。 1.7 反转录 PCR （RT -PCR）
对文库中可能与抗病性有关的 3 条 ESTs 进行
RT-PCR 验证。实验材料处理方法同 1.6， 接种条锈 菌 0、
12、 18、 24、 36、 48 和 72h 后分别取样。以小麦 基因为对照，
PCR 引物序列及退火温度见 表 1。PCR 扩增程序：
94 ℃变性 30s ，退火 30s ， 72 ℃延伸 1min ，扩增循环在 25～27 循环之间调整， 以保证 PCR 扩增未进入平台期。
2 结果和分析
2.1 小麦叶片总 RNA 质量检测
接种叶片反应型鉴定表明， 成株期兴资 9104 接 种条中 32 号生理小种为近免疫反应型，
所取材料可 用于构建文库。总 RNA 用核酸蛋白检测仪测定总
RNA 的浓度及纯度。测定结果， 260 / 280 值为 1.8～2.0， 260 / 230 值为 1.8～2.2。取少量 Tester 与 Driver 总 RNA 用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显
示,总 RNA 中 和 rRNA 的比率约为 2:1， 其 完整性较好，可进一步用于提取 mRNA 。按 QIA-
GEN 试剂盒 Oligotex 方法从总 RNA 样品中分离 mRNA ， 测定结果表明 260
/
280
值为 1.8～2.0。
琼 脂糖凝胶电泳检测结果显示，
mRNA 呈弥散状分 布， 主要分布在
与 区域间，
证实 mRNA 质 量良好， 可用于构建文库。
2.2 接头连接效率检测
分别以接头外侧序列 （primer 1） 和
FP
为上游引物，
以 RP 为下游引物对接头连接 产物进行 PCR 扩增。 扩增结果显示 （图 1）， 以 pimer
1和 RP 扩增所得长片段亮度与以 FP 和 RP
扩增所得短片段的亮度比值超过 25%， 表明接头连
接符合要求， 可以进行下一步杂交实验。 2.3
SSH cDNA 文库的质量分析
对蓝白斑筛选结果进行统计与检测，阳性克隆 比例为 68.5%。 随机挑取白色克隆 17 个， 提取质粒 后， 用
R Ⅰ进行酶切， 检测插入片段大小 （图 2）。
结果表明， 插入片段 （除去载体和接头片段） 最小为
图1.cDNA 接头连接效率分析
Fig.1.Analysis of cDNA adaptor ligation efficiency
M,DL-2000DNA 分子质量标记； 1、 2, 以连接接头 1 的 cDNA 为模 板的 PCR 产物； 3、 4， 以连接接头2 的cDNA 为模板的 PCR 产物； 1、 3， 用引物1和下游引物进行扩增的产物； 2、 4， 上游引物和下游引物
进行扩增的产物。
M,DL-2000DNA ladder ?1and 2,PCR products using tester 1 (adaptor 1R-ligated)as the template?3and 4,PCR products using
tester 2(adaptor 2R-ligated)as the template?1and 3,PCR products using primer 1and reverse primer?2and 4,PCR products using forward primer and reverse primer.
100bp ， 最大为 800bp ，
大部分为 300bp 左右。 2.4
EST 获得与分析
对随机挑选的 96 个重组子进行测序，获得 92
条高质量序列， 测序成功率为 95.8%。对 92 条 ESTs
聚类拼接， 得到 41 个 unigenes ， 其中包括 18 个 con-
tigs ， 23 个 singlets 。将该 41 个 unigenes 与 GenBank 中 nr 数据库进行 BLASTx 同源比较，其中有 26 个
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第 6 期 黄雪玲等: 小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析
序列号
Gene No.
Energy and metabolism
Proteins synthesis
Disease defense
Signal transduction
Membrane and Transport
transcription
transposons
Cell growth division
Unknown
EST 数目 Copies
2 3 1 1 1 1
3 1 1 1 1
4 6 2
2 1
3 3 1
1
1 3
2
1
1 1
长度/bp Length
423 627 226 283 241 259
277 309 296 308 448 335 279 379 475 499 584 213 591 310 345 563 391 430 321 133
同源基因 Highest homology
S-腺苷-L 高半胱氨酸水解酶S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase
磷酸甘油酸激酶Phosphoglycerate kinase 1， 5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基
Ribulose bisphosphate carboxylase small chain clone 512
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 Glucose-6-phosphate dehydrogenase 盐酸脱卤化酶超家族水解酶HAD-superfamily hydrolase 果糖激酶Putative fructokinase
核糖体蛋白 L13a Ribosomal protein L13a 核糖体蛋白 L18Ribosomal protein L18 40S 核糖体蛋白 ribosomal protein 40S 核糖体蛋白
ribosomal protein
蛋白翻译因子Putative protein translation factor Sui1 过氧化物酶 Peroxidase 6
谷胱甘肽S 转移酶Glutathione S-transferase 2 类细胞外基质糖蛋白Pherophorin -like protein 植物抗病信号传导相关蛋白SGT1 糖原合成激酶GSK-like kinase
鞭毛合成蛋白Flagellar biosynthesis protein FLHA,putative,expressed 酪蛋白激酶 Casein kinase
叶绿体肌醇磷酸化酶Chloroplast inositol phosphatase-like protein 液泡ATP 合成酶
Putative vacuolar ATP synthase 16kD proteolipid subunit
含BSD 结构域的蛋白 Unknown protein,contains BSD domain HLA-B 相关的转录相关蛋白Putative HLA-B associated transcript 1
反转座子Retrotransposon protein,putative,Ty1-copia subclass 花发育相关功能蛋白MADS box interactor-like
Unknown protein Unknown protein
值value
2.00E-76 1.00E-96 1.00E-10 9.00E-13 1.00E-36 1.00E-12 1.00E-21 1.00E-48 7.00E-16 7.00E-16 5.00E-47
3.00E-15 2.00E-17 6.00E-08 5.00E-52 8.00E-38 3.00E-32 9.00E-09 1.00E-19 1.00E-07 1.00E-13 2.00E-77 9.00E-40 2.00E-7
5.00E-14 2.00E-10
为功能已知序列， 占 63.4% （表 1）， 15 个为 no hits （功能尚未确定）
， 占 36.6%。 对功能已知的基因进行分类
（Bevan ,1998），能量和初级代谢相关的基因
为第一大类， 占已知功能基因的 23.1%， 其 中磷酸甘油酸激酶和 S- 腺苷 -L- 高半胱
氨酸脱氢酶出现的频率较高；
其次是蛋白 质合成相关的基因及信号转导相关的基
因，分别占 19.2%；第四类是抗病防卫基 因， 占 11.5%； 编码有关膜转运、
蛋白质修表 2功能已知ESTs 的比对结果
Table 2Results for comparison of homology with function genes deposited in GenBank
图2.文库插入片段检测
Fig.2.Identification of inserted fragments of the SSH cDNA library
M,DL2000DNA 分子质量标记； 1～17,质粒经
R 玉酶切后的片段。
M,DL-2000DNA ladder ?1～17,fragments after the digestion of
plasmids by
R 玉.
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农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
饰加工、细胞生长分化及转座子基因的序列相对较 少。 本研究还发现了两个编码未知功能蛋白的 EST， 它们的具体功能还有待进一步确定。
2.5 反转录 PCR （RT-PCR）
从 SSH-cDNA文库中挑选 3个阳性克隆进行 RT-PCR验证， 结果见图 3。 受到条锈菌侵染后 表达差异显著， 接种 12h后强烈表达， 然后逐渐减 弱； 在受到条锈菌侵染后表现出先增强再减弱 的表达趋势， 在 18h时表达最强； 在受到条锈菌 侵染后则表现出两次表达峰。
图 3.反转录PCR检测
Fig.3.RT-PCR analysis of selected ESTs to evaluate the
SSHcDNA library
3讨论
本实验利用 SSH， 以成株期抗条锈性品种兴资 9104为材料， 构建小麦与条锈菌互作的 SSH cDNA 文库。抑制差减杂交技术是由 Diatchenko （1996） 建立的减法分离差异表达基因的方法， 已在 许多种植物上得到有效的应用（Fu， 2005； Lin ， 2006）。
建库材料时间点的选择是有效利用 SSH技术 的基础， 郭娴 （2005） 通过对两个白粉病诱导的小麦 SSH cDNA文库的比较发现， 以接种 24h内的材料 所构建的文库包含更多抗病信号激发、传导以及转 录相关的基因； 而以接种后 24～72h的材料所构建 的文库中，抗病防御功能相关及次生代谢相关基因 较多。 本课题组前期的组织病理学研究表明 （数据未 发表）， 在条锈菌与小麦的非亲和组合中， 当接种 6h 时条锈菌在小麦叶片上可见芽管甚至附着孢的形 成， 12h在叶片气孔下腔内出现了气孔下囊并产生 初生侵染菌丝， 18h时已有初生吸器母细胞和吸器， 接种 24h时侵染点附近的寄主细胞明显坏死， 以后 直到 48h坏死范围逐渐扩大， 条锈菌菌丝扩展同时 受到明显的抑制。 鉴于以上研究， 本实验选取接种后 12， 24和 36h3个时间点的材料构建 SSH cDNA文 库， 基本可以涵盖大部分抗病相关基因。
BLASTx分析结果表明， 所获得的 EST序列大 多数同源于水稻、 小麦及拟南芥等模式植物。 其中功 能已知的 EST中防卫反应相关及信号转导相关基 因占很大一部分，为 30.8%，主要包括过氧化物酶 （peroxidase6）、谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase2， GST）、 SGT1、 酪氨酸激酶 （casein ki- nase） 等。
蛋白质的降解是植物发育进程的关键调节机 制， 涉及种子萌发、 形态建成、 衰老和细胞程序化死 亡等。泛素 -蛋白酶体途径或 Ub途径是降解蛋 白质最重要的一种方式 （郭启芳等， 2004）。SGT1是 一类在酵母和动、植物中调节蛋白降解的泛素连接 酶 SCF蛋白 （Skp1-cullin-F-vox protein） 的核心组分 （王亚玲等， 2004）。研究人员通过突变体筛选、 酵母 双杂交以及基因沉默等方法， 分别在拟南芥、 大麦和 烟草中证实 SGT1介导或参与介导的蛋白降解过程 广泛参与了多种 R基因介导的病原菌抗性甚至某 些非寄主抗性 （Azevedo .， 2002； Peart .， 2002）。本实验得到一个编码 SGT1蛋白，由两个 EST组成的 contig。说明 SGT1介导或参与介导的 蛋白降解过程也参与了小麦成株抗性的表达， SGT1可能是植物抗病性的一个普遍因子。
在文库中还发现一个反转座子 （retrotransposon protein）。有研究表明， 反转座子受胁迫反应激活与 防卫基因激活之间可能存在相似的分子机理 （Grandbastien， 1997）。另外， 糖原合成酶激酶 （glycogen synthase kinase， GSK） 和酪蛋白激酶在文 库中也有出现， 它们在转录因子的活性调节、 基因表 达调控方面起着重要的作用 （Yin， 2002）。文库 中还发现一类 FLHA基因， 它编码细菌鞭毛输出器 的一个重要组分， 具体的作用还不清楚。 已有研究表 明它可能是一个涉及基因表达的跨膜信号分子， 在 毒性因子的调节和毒性相关蛋白的分泌调控方面起 重要作用 （Ramarao and Lereclus，2006）。
3个基因的 RT-PCR结果表明， 在条锈菌侵 染早期强烈表达， 而后呈下调趋势， 推测该基因参与 了介导抗性产生的信号途径； 在条锈菌侵染 24 h前及对照中强烈表达， 其中 18h时表达最强， 24h 后呈下调趋势。 在接种后的表达呈现两次增强 趋势。它们的具体功能有待于进一步研究。
综上所述，在条锈菌诱导下成株期小麦可能是
通过细胞内信号传导、防卫反应相关基因表达及反
转座子的激活等机制来抵抗病原菌危害。虽然部分
测序结果所获得的信息不够全面，但从这些有限的
信息可以粗略地了解成株期小麦与条锈菌互作过程 980
第 6期 黄雪玲等:小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析
参 考 文 献
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中差异表达基因的种类及表达丰度。 为了更全面、 详 尽地了解小麦条锈病成株抗性相关基因的表达模 式， 还需对 SSH cDNA文库进行更多的序列分析。
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