土壤拮抗放线菌的分离及其抗菌活性筛选
禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案
由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。 小麦赤霉病的表现 小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。最常见的是穗腐。初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。 小麦赤霉病的发病条件 在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。在适宜的条件下2～3d 即可产生子囊壳，5～10d 形成子囊孢子。在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。 气象条件对小麦赤霉病的影响较大。当平均气温为9℃以上，3～5d 的雨天时，便形成了子囊孢子。这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。小麦赤霉病的危害 小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。 小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。 1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为46.8%。1985年全国赤霉病又大流行，仅河南省发病面积就达3.0×106 hm2。2000以来赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积就超过了3.3×106 hm2。其中仅河南省就有7年的发病面积超过6.7×105 hm2。在2012年的赤霉病大流行中，山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏普遍严重[7]。 1
放线菌筛选的一般方法(1)
放线菌筛选的一般方法 摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。 关键词：放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况 放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。 放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。它是一个原核生物类群，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。 2 放线菌的培养基 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、 K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 高氏一号合成培养基需要K2HPO4?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾 0.25,MgSO4?7H2O 0.125g，FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌20分钟。 3 土壤中放线菌的分离 编号，分装取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。 4 倒平板分离培养 于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约
土壤中放线菌的分离
土壤中放线菌的分离 实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离 （1）待测样液的制备 选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌 取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌 取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作
_大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选
第33卷第2期2014年 4月 大豆科学SOYBEAN SCIENCE Vol．33No．2Apr． 2014 大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选 刘庆莉1，王金生1，刘丽君1，林蔚刚1，王红蕾2，张俐俐3，吴俊江 1 （1．黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院信息中心，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086） 摘要：为筛选出适宜根瘤菌吸附且能促进大豆生长、提高产量的优质载体，并且在优质载体的条件下，筛选出大豆 根瘤菌液的最佳使用浓度，通过3种载体吸附不同浓度根瘤菌液拌种大豆盆栽播种后，对大豆的生物量、结瘤及产量的对比发现：不同载体介入、大豆接入根瘤菌后均对大豆的生物量及结瘤产生一定的促进作用。根瘤菌以草炭和蛭石为载体，更有利于促使大豆植株生长，积累更多的干物质；草炭的促进结瘤作用持续效果时间较长，液体的持续效果时间最短，而蛭石的持续效果时间相对比较居中；以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥其提高产量的作用，以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥其提高产量的作用。结合生产成本来看， 草炭土更适宜作为自主研发根瘤菌剂的载体，同时推荐根瘤菌使用浓度为1．4?108 菌细胞 ·mL －1。关键词：大豆根瘤菌；结瘤；载体 中图分类号：S565．1文献标识码：A 文章编号：1000- 9841（2014）02-0207-04收稿日期：2013-10-11基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD14B06）；现代农业产业技术体系（CAＲS-004）；黑龙江省自然科学基金（C201104）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2013ＲFXYJ043）。 第一作者简介：刘庆莉（1971-），女，技师，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：liuqingli1971@126．com 。通讯作者：吴俊江（1970-），男，博士， 研究员，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：nkywujj@163．com 。Chosen of Soybean Ｒhizobia Carrier and Screening of the Best Concentration LIU Qing-li 1，WANG Jin-sheng 1，LIU Li-jun 1，LIN Wei-gang 1，WANG Hong-lei 2，ZHANG Li-li 3，WU Jun-jiang 1 （1．Soybean Ｒesearch Institute ，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；2．Information Center of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；3．Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ） Abstract ：In order to screen the carrier that was more appropriate for the absorption of rhizobia ，improving yield and quality of inoculated soybean ，and screen the best soybean rhizobia bacterial concentration at levels of quality carrier ，three carriers ab-sorbed different soybean rhizobia bacterial concentration with seed dressing were performed according to the biomass ，nodular rate and yields of soybean plant by soil pot experiments．The results showed that different carriers and inoculating soybean rhi-zobia could improve the biomass and nodular rate of soybean plant．Peat and vermiculite were used as carriers of rhizobia could remarkably promote the growth of soybean plant and enhance dry matter accumulation ；thus the lasting effect of nodular was the longest ，followed by vermiculite and liquid．Low level bacterial concentration could remarkably increased soybean yield and quality with peat and vermiculite as carriers ，however the opposite when used liquid as carriers．In conclusion ，in view of the cost ，peat was more appropriate for soybean rhizobia ，and the best bacterial concentration was 1．4?108 cells ·mL －1．Key words ：Soybean rhizobia ；Nodulation ；Carrier 施用根瘤菌菌剂能促进大豆结瘤， 有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力，同时，由于根瘤菌剂耐污染能力强［1］ ，还可以减少因长期使用化肥对 环境的破坏 ［2-3］ ，对无公害大豆生产以及降低农民 投人， 保护环境等具有十分重要的作用［4-5］ 。因此 引起了人们的极大兴趣和广泛关注，已成为豆科植 物增产的主要研究方向。 近年来随着新技术特别是分子生物学技术的发展，各种高效菌种不断被选育或改造，制备菌剂的工艺、保藏菌剂的方法也不断完善和发展，配制成的菌剂的效果越来越好，在农业生产中得到了广泛利用。与此同时，诸如发酵水平低、保质期短和 技术不成熟、质量不过关等问题限制了根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用。其中，菌种质量的高低一直是影响其应用效果的一个突出问题；载体也是大豆根瘤菌肥料质量控制的一个关键因素 ［6］ 。作 为根瘤菌的载体很多， 如草炭、蛭石、珍珠岩、煤炭、草炭、膨润土和高岭土等。草炭、蛭石由于其营养与pH 适中，表面积比较大和吸附性好，有利于根瘤菌的存活及菌剂保存，是理想的载体 ［7-9］ 。另外，草 炭和蛭石等资源丰富，价格低廉，适合于在根瘤菌剂生产中应用推广，已成为当代根瘤菌类肥料的主要类型。 本文的研究目的是筛选出适宜根瘤菌吸附且接种大豆能促进大豆生长、提高产量的优质载体，
土壤中放线菌的分离
土壤中放线菌的分离 实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。 2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、 KNO 3、NaCI、K2HPO 4?3H 2O、MgSO 4?7H 2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO 4?3H 2O 、MgSO 4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（1h1）0或加入某种抑制剂（如加数滴 10% 酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备
微生物--土壤放线菌的分离与鉴定
土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告 学院：生命科学学院 班级： 2013级生科2班 组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079
郑国梁 2013506083 2015年10月15日 一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 二、实验原理 土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特
殊培养基的方法，来获得放线菌。
放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。 三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4
放线菌筛选的一般方法定稿版
放线菌筛选的一般方法 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】
放线菌筛选的一般方法 摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。 关键词：放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况 放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。
最新土壤中放线菌的分离与纯化
土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒
平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4? 7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌。
细菌拮抗作用的筛选 - 副本
细菌对几种病害的拮抗作用植物病害拮抗细菌的筛选和应用是植物病害防治的研究热点。拮抗细菌及其代谢产物的开发利用, 以及通过基因工程改造产生新型、高效、稳定、适生性强的拮抗细菌是今后生防菌发展的趋势。拮抗细菌作为生物防治措施的成功例子已经存在。 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,已受到各国生物学家的高度关注。大量研究结果表明:植物内生菌在体内占据有利于生防的生态位,具有生物防治,植物促长,增强宿主抗逆境、抗病虫害、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性等优点。近年来,对植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体的研究,已逐渐成为国内外研究的热点。关于内生细菌对植物病原菌的拮抗作用,前人研究已证明,植物内生细菌中存在有大量的对植物病原菌具有拮抗作用的菌株,不同植物含有对病原菌具有拮抗作用的内生细菌的种类有所不同。本实验研究了拮抗细菌对几种病害的拮抗作用，进而在病害的生物控制病害方面提供了一个发展趋势。 1 材料及方法 1．1 材料 1．1．1 培养基PDA、NA培养基、金氏培养液 1．1．2 供试菌从植物组织中分离的内生菌 1．1．3 病害种类马铃薯炭疽病菌、枯萎病菌、茎点霉 1．2 方法 1.2.1 内生菌的分离纯化
将植物组织用自来水清洗表面后,晾干称重后用10%的次氯酸钠溶液消毒中10 min, 之后浸入0.1%的升汞中2min，最后用无菌水冲洗3次,用滤纸吸干, 放入研钵中加入质量分数为0.85%Nacl研磨,梯度稀释后涂布于NA培养基, 28℃培养箱中倒置培养3?7 d。同时以最后一次洗涤的水作为对照。根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等挑取不同单菌落, 反复划线纯化后接斜面保藏。 1．2．2 拮抗菌的筛选 1．2．2．1 采用平板对峙法 采用平板对峙法测定抑菌效果，将纯化好并活化的细菌接到NA培养基中制成平板, 28℃恒温培养24h，用直径5 mm的打孔器取致病菌菌块于PDA 平板中央,在其周围4个等距离位置上分别接上4种不同的内生细菌,每处理做3次重复，进行初筛选，培养3～5 d后,观察不同内生细菌是否对致病菌有抑制生长的作用及抑菌圈的大小(取3次重复的平均值)。对抑菌效果好的细菌再进行筛选， 28 ℃下恒温培养至对照长满后，测致病菌菌落的长和宽, 计算拮抗细菌对致病菌的抑菌力。抑菌力= (D-B)/D（100 %)（D : CK 致病菌菌落直径；B : 处理致病菌菌落宽度），每处理重复3 次, 只接致病菌菌饼为对照( CK) 。 1．2．2.2 拮抗细菌对致病菌孢子萌发的影响 在金氏培养液中培养36 h ( 30 ℃ ) 的拮抗细菌用细菌过滤器过滤, 滤液分别稀释0、10、100 倍, 每浓度溶液中加入病菌孢子, 配成孢子悬浮液, 以金氏培养液配成的孢子悬浮液为对照。采用悬滴法
根瘤菌及其应用
根瘤菌与豆科植物及其应用 摘要：自贝叶林克1888年首次从豆科植物根瘤中分离获得根瘤菌以来，国内外的许多学者都为揭开这一大自然的奥秘进行着孜孜不倦的研究，成为生命科学最为活跃的领域之一。人们从生物学，生态学，生理生化，分类和遗传等方面对根瘤菌进行了广泛研究，在根瘤菌和根瘤的形态结构，固氮酶的结构和功能，固氮机理和作用调件，根瘤菌在细菌分类学中的地位直到固氮基因，结瘤基因，固氮生态等应用方面都有着较快发展，20世纪90年代共生固氮体系已进入分子水平，研究转入根瘤菌与宿主豆目植物植物的相互识别和信息传递以及根瘤菌群体感应等方面。 关键词：根瘤菌生物固氮根瘤菌应用 一．根瘤菌的生物学特征 根瘤菌：根瘤菌主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌属和慢生根瘤菌属；两属都属于根瘤菌目。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈和生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。 根瘤菌的形态特征：根瘤菌是短杆状细菌，因生活环境和发育阶段的不同，在形态上有显著变化.根瘤菌在固体培养基上和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛能运动，革兰氏染色阴性，无芽孢，培养较久
菌体粗大，染色不均。 生存习性：根瘤菌与植物的共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。 根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。 类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 二．根瘤菌与豆科植物 根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。 1.拮抗放线菌的筛选方法： 1.1平板划线法： 待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。选择抑制活性强的复筛。 1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法 将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。 1.3纸片法或生长速率法： 主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测
发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有 无抑菌圈或抑菌圈的大小。 2.放线菌分离与筛选. 2.1培养基； 2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%） 3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。 2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基 2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速 度迅速。 重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可 显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。 2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形 杆菌 2.4放线菌分离与筛选 2.4.1传统的分离筛选思路； 以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选 产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。 初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。 优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。缺点：方法粗放，
放线菌
土壤中放线菌的提取与分离 环境科学与工程学院 环工13实验班杨健3130206323 【摘要】:放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原 核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。放线菌[1] 是一群革兰氏阳性、含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。从土壤中提取放线菌主要用高氏一号培养基进行培养。 【关键词】：原核微生物，高氏一号，革兰氏阳性，孢子等。 【Abstrat】：Actinomycetes is a kind of main assumes the hypha growth and to spore reproductive land was more powerful prokaryotes. Named after the deep in radiating growth on solid medium. Most have developed branch hyphae. Hyphae slender, width to rod-shaped bacteria, about 0.5 ~ 1 micron. Can be divided into: vegetative hyphae, also known as the substrate mycelium, main function is to absorb nutrients, some can produce different colors, is important basis of species identification; Aerial hyphae, fold, was born in the vegetative hyphae, also known as secondary hyphae. Actinomycetes [1] is a group of gram positive bacteria, content (> 55%). Actinomycetes by colony is put a line of its name. It is a prokaryotic organisms, is widely distributed in nature, mainly by spore reproduction, followed by rupture of reproduction. As the common bacteria, and more for saprophytic, a few stray. Extracted from the soil actinomycetes mainly use high's number one medium for culture. 【Key words】: procaryote microbiology, coates, number one gram positive, spores, etc. 引言 放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。本次实验所取的放线菌都来自于土壤,用高氏一号培养基进行对土壤放线菌的分离和培养。一、高氏一号合成培养基的制备
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定 一、培养基 1 放线菌培养基 高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。 黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。 放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。 2 放线菌形态及培养特征研究用培养基 察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。 麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。 燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。 甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。 无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，CaCO32.0g，(NH4)2SO42.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，pH 7.4。 马铃薯培养基：去皮马铃薯块200g（1000 毫升水，80℃煮１小时，然后离心或过滤得上清液），葡萄糖20g，pH 7.4。 营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，H2O 1000mL，pH 7.4（亦可补加葡萄糖10g）。 葡萄糖-天门冬酰胺培养基：葡萄糖10g，L-天门冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g，牛肉膏2g，H2O 1000mL，pH 7.2。 3 测定生理生化特性供试培养基 淀粉水解测定培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO45.65g，NaCl 0.5g，KNO31g，MgCO31g，琼脂15g，H2O 1000mL，pH 7.2~7.4。 纤维素水解培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，H2O1000mL。滤纸条（5cm×0.8cm）灭菌20 分钟。（pH7.0～7.2） 明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，H2O 1000mL，明胶灭菌10min，pH7.0（灭菌3 次，每次20min，灭菌后立即浸入冷水中冷却。） 牛奶凝固与胨化培养基：脱脂牛奶1000mL，CaCO30.02g，pH 7.2~7.4，间歇灭菌三次（脱脂牛奶的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min）脱脂，除去上层油脂，即得脱脂牛奶）。 石蕊溶液配制：称取2.5g 石蕊浸泡在100ml 蒸馏水中过夜，使石蕊充分溶解，然后过滤备用。石蕊牛奶的制备：2.5％的石蕊液与脱脂牛奶以4：100（V/V）比例混合，牛奶呈紫丁香色，分装于试管中，灭菌备用。接种前抽检灭菌是否彻底。
实验二_____土壤中放线菌的分离
实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。 放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。 用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。 实验6土壤中放线菌的分离（实训） 实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离 （1）待测样液的制备 选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的