中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol25 No9 2005

中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(9):94～98

植物遗传转化新技术和新方法*

陈英黄敏仁**王明庥

（南京林业大学林木遗传和基因工程重点实验室南京210037）

摘要目前通过遗传转化技术获得了许多植物的转基因植株，一些重要农作物转基因新品种已进入产业化阶段，展现出极好的应用前景。但随着研究的不断深入，在如何提高遗传转化效率和转基因安全性等方面，一些新的技术和方法不断出现并得到应用，如胚状体再生系统、叶绿体转化系统、超声波辅助农杆菌介导法、位点特异重组MAT vector系统、正选择系统以及新的转基因分子检测方法，使遗传转化技术向高效、安全方向发展，新一代的转基因植物也将会更适应人们和生态环境的需求。

关键词植物基因工程遗传转化效率转基因安全性

收稿日期：2005 04 28修回日期：2005 06 09

*江苏省高技术研究项目（BG2003304）和校高学历人才基金项目

** 通讯作者，电子信箱：mrhuang@https://www.360docs.net/doc/dc14926274.html,随着植物遗传转化技术的不断改进，越来越多的植物获得了转基因植株，一些重要的农作物，如棉花、玉米、番茄等，通过转基因技术培育的优良新品种，已得到大面积推广，获得了可观的经济效益。近年来，在进一步提高转基因效率，外源基因定点、定量、稳定地转移到植物基因组，外源基因在转基因植物及后代中的遗传和表达等方面进行了深入地研究。而同时，基于公众对转基因植物的安全性产生的疑虑和争议，促使人们继续探索和发现新的更为安全和有效的转化体系，如叶绿体转化研究和无选择标记研究也取得了重要进展，引起人们的普遍关注。本文就目前应用于植物遗传转化领域的新技术和新方法进行综述。

1新的遗传转化受体系统——胚状体再生系统成功的遗传转化首先依赖于良好的植物受体系统。胚状体再生系统是最理想的基因转化受体系统：体细胞胚是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA的能力强，是理想的基因转化感受态细胞；体胚发生多为单细胞起源，转基因植株嵌合体少；体胚具有两极性，在发育过程中可同时分化出芽和根，形成完整植株；体细胞胚个体间遗传背景一致，无性系变异小；体胚发生繁殖效率高、可通过生物反应器进行大规模生产。

自1988年体细胞胚转化技术在美国西部核桃(Jugalansregia L.)转Npt II基因获得成功以来，已经在苜蓿［1］、大豆［2］、葡萄［3］、可可［4］、非洲枸杞［5］、罂粟［6］等植物中相继获得成功。在农杆菌介导的非洲枸杞遗传转化研究中发现，采用茎段直接分化系统或愈伤组织再生系统，分化的不定芽90%以上玻璃化，只有30%能再生完整植株。而Mazur等［7］2002年采用胚状体再生系统，转基因植株形态和核型正常，转基因胚性愈伤长时间保持高效体胚分化频率和植株再生频率，通过1次转化即可获得大量的转基因植株。此外，体胚则可用于快速的转基因检测，有利与对转基因植株进行早期分子鉴定。

目前采用胚状体再生系统进行转化主要是报告基因，如Gus和GFP。Charity等［8］通过该系统将bar基因转入火炬松，转基因植株在4 kg/h的除草剂压力下生长正常，且外源基因表达稳定，说明利用胚状体再生系统进行转基因是可行的。

2新的遗传转化载体系统——叶绿体转化系统目前载体转化系统仍是植物基因转化研究中

使用最多、机理最清楚、技术最成熟的转化系统，并且随着研究的不断深入，在Ti质粒、Ri质粒和病毒转化载体系统的基础上，又发展了一些新的载体系统。其中，由于叶绿体遗传系统不遵循孟德尔遗传规律，具有可同时进行多基因转化、表达原核性、超量表达、后代遗传稳定、定点整合、不会产生基因沉默及母性遗传和安全性好等优点，越来越受到人们的重视。

2005, 25(9)陈英等：植物遗传转化新技术和新方法

中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.9 2005

近几年，叶绿体转化(chloroplast transformation)研究有了很大突破：(1）随着转基因技术研究的深入，除基因枪转化法外，产生了一些新的转化方法：农杆菌介导法、玻璃珠法、电激法、纤维注射法、PEG法等。(2）通过同源重组技术解决了外源基因定点整合到叶绿体基因组的问题。常选用的片段有：rcbL/aacD, 16strnV/rps2rps7, psbA/trnK, rps7/ndhB ［9］。(3）采用叶绿体特异的启动子和终止子（如光系统II作用蛋白基因psbA启动子和终止子，核糖体RNA基因FITI的启动子）实现外源基因的高效表达［10］。(4）采用筛选标记基因，或在转化前降低受体细胞叶绿体基因组拷贝数等方法实现叶绿体基因组的同质化。一般选用的选择标记基因有突变型16SrRNA基因、NPT II基因以及aadA基因绿色荧光蛋白基因gfp等［11］。自1990年Svab等利用基因枪法获得烟草叶绿体转基因植株，首次在高等植物叶绿体中使外源基因获得稳定表达以来，叶绿体基因组转化技术已拟南芥、马铃薯、油菜、番茄和水稻等高等植物中获得成功［9］。

3新的遗传转化方法——超声波辅助农杆菌介导法农杆菌介导法具有简单、快速、高效、多为单拷贝插入以及遗传稳定性好等特点，是植物基因工程研究的首选。研究表明，转基因受体材料的生长状态、农杆菌感染能力、添加创伤反应诱导物以及通过改变创伤方式增强受体材料被有效感染的能力等因素对转化频率影响较大。因此近年来在增强受体材料被有效感染能力方面发展了一些新技术，如超声波辅助农杆菌介导法(sonication assisted agrobacterium mediated transformation,SAAT)、低能离子束（low energy ion beam）与农杆菌介导结合法，基因枪与农杆菌介导结合法以及负压与农杆菌介导结合法等，均可增强农杆菌侵染，提高转化效率。

SAAT法集合了超声波法和农杆菌介导法的优点，近年来常被用于提高植物的转化效率，并在一些植物上（玉米、黄瓜、苦豆子、花生、苹果和油棕榈等）取得成功。农杆菌转染时，将转化材料浸在农杆菌悬液中, 进行超声波处理，在目标材料的表层和深层可能产生超声波的空化效应，即气泡闭合形成瞬间高压，连续不断的高压象发生一连串小“爆炸”不断地冲击材料表面，造成许多微损伤，有利于农杆菌进入组织内部，同时从伤口处分泌出较多的酚类物质, 有助于提高农杆菌的转化活力，明显地提高农杆菌的感染效率。但高强度和长时间的超声波处理可能损伤外植体和核基因组DNA，降低转化率，因此超声波处理强度不宜过大，时间不宜过长。

此外，其它转基因方法或某些物理因素与农杆菌介导转化技术联用能有效地提高转化效率。Bidney等［12］报道用基因枪轰击烟草和向日葵顶端分生组织，造成细小的伤口，再进行农杆菌侵染，取得了比刀切等方法大100倍的转化效率。另外，Kohler等［13］和Benediksson 分别报道先用电离射线(如10~15GY的X射线)或非电离射线(20Jm2的紫外线)处理受体植物细胞(烟草、矮牵牛、黑芥等)，而后再施以转基因处理,可提高转化频率3~7倍。

4新的遗传转化筛选标记标记基因是筛选和鉴定转化的细胞、组织和转基因植株的有效方法。标记基因在转基因成功后一般来说是多余的或者有害的，对人类自身和生存环境产生潜在的威胁。因此，无筛选标记基因和安全的筛选标记基因植物遗传转化系统越来越受到研究者的关注。

4.1位点特异重组MAT vector系统

目前去除选择标记基因的转化系统主要有共转化(cotransfomation)系统、位点特异性重组系统(site specific recombination system)、转座子元件(transposable elements)系统和位点特异重组MAT vector系统（multi auto transformation system）。

MAT vector系统是近几年来发展起来的。该系统将受诱导型启动子调控的重组酶基因与克隆于两段同源序列之间的标记基因连接到同一载体上，构建成双元载体导入植物中。对转基因植株进行化学诱导，表达重组酶，促使同源序列发生重组，从而将标记基因去除（图1）。与前3种途径相比，该系统不需要对初级转化体进行有性杂交，从发生分离的后代中筛选出不含选择标记基因的植株，因此更适宜于繁殖周期长的林木和需无性繁殖的作物的遗传改良，同时也使多次转化成为可能。

图1通过GST-MAT系统获得无选择标记植株［14］

●:插入位点; :T-DNA边界; :识别位点; :目的基因；GST11 Ⅱ启动子：来源于玉米，受除草剂解毒剂“Safener”诱导；ipt：异戊烯基转移酶基因，筛选标记基因

Fig.1 Obtaining marker-free transgenic

plant by GST-MAT

目前MAT vector系统主要有2类：ipt型［14］和rol型［15］。Ebinuma等［14］用ipt-type MAT vector系统获得了无选择标记基因的转基因杂种杨树。Endo等［16］也利用ipt-type MAT vector系统，仅通过一次转化即获得了无选择标记的转基因水稻，并且诱导无选择标记植株的频率高达25.5%。而Minlong等［17］则采用rol-type MAT vector系统对Antirrhinum majus L进行遗传转化，获得了无选择标记基因的GUS转基因植株。

4.2正选择系统

正选择系统(positive selection system)是相对于负选择系统，即抗生素筛选系统而言的。正选择系统主要选用糖类代谢酶基因作为筛选标记基因，可获得比负选择系统更高的转化频率，并且糖类代谢酶标记基因安全、筛选剂价廉，有望成为植物转化研究中的主导筛选系统。目前，用于正选择系统的糖类代谢酶基因有：1，6 磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isometase)基因pmi和木糖异构酶(xylose isomerase)基因xylA。

pmi编码6 磷酸甘露糖转移酶(PMI)，催化6 磷酸甘露糖(M 6 P)转变为植物细胞可代谢的6 磷酸果糖(F 6 P)，反应消耗ATP。在含D 甘露糖的筛选培养基上，在植物细胞内源的己糖激酶催化作用下，细胞不断将甘露糖转变成M 6 P。非转化细胞因缺乏PMI，不能继续代谢，造成细胞内M 6 P的积累，同时伴随着ATP和磷酸基的大量消耗，从而生长受到抑制；转化细胞则能将M 6 P转变为F 6 P，可继续代谢为细胞提供能量，能在筛选培养基上利用甘露糖作为碳源进行生长和扩增。目前来源于E. coli 的pmi已成功应用于甜菜［18］、玉米［19］、木薯［20］和水稻［21］的遗传转化。该系统在转化水稻幼胚时，转基因植株中标记基因pmi的转化率为41%，其中85%的植株为gus阳性，比nptII的转化率高1倍以上［22］。

xylA克隆于Thermoanaerobacterium thermosulfuro genes，已转入马铃薯、烟草和番茄中，获得了转基因植株［23］。xylA作用原理与pmi相似，所编码的木糖异构酶催化Ｄ 木糖和Ｄ 木酮糖之间相互转变。Haldrup等［23］将xylA标记基因置于CaMV35S启动子和Ω增强子调控下，与npt II抗性标记基因对植物细胞的筛选效应进行比较，结果表明，在非优化的条件下，Ｄ 木糖筛选的马铃薯、番茄转化率明显高于卡那霉素筛选。若条件优化，转化频率还可进一步提高。Ｄ-木糖筛选烟草的转化率虽比卡那霉素筛选时降低，但也可以取得良好的筛选效果，而且Ｄ-木糖筛选的植株生长状态较好。此外，以来源于Streptomyces rubiginosus的xylA作为标记基因，报告基因gus作为目的基因转化马铃薯，结果再生植

株中gus转化率达32%，比利用npt II作标记基因时提高了9倍［24］。

5新的分子检测方法——实时定量PCR在植物遗传转化中，一般外源基因随机插入染色体1~2个拷贝时基因的表达效率最高，多个拷贝时基因表达效率降低甚至沉默。因此越早对转基因植株进行分子检测，验证外源基因插入的拷贝数，对下一步的实验越有利。目前，检测基因的拷贝数一般采用经典的Southern杂交技术，但是该方法费时、费力、试剂昂贵，需要大量的植物材料，同时还可能因为基因重排（rearrange）丢失酶切位点，导致实验结果误差。而近年来发展起来的Quantitative Real-time PCR技术可快速、准确、高效地检测到转基因的拷贝数。

Quantitative Real-time PCR主要通过荧光报告物对PCR反应进行实时检测。荧光报告物可以是特异性的（如Taqman probes, molecularbeacons, FRET probes）和非特异性的（如SYBR Green I）。PCR产物量与起始模板量成正比。因此选取基因组中的某个单拷贝基因为对照，精确定量待测样品起始模板量，进行Quantitative Real-time PCR，最终对反应结果进行客观、快速的统计分析，即可准确、方便地检测出每一转基因植株中所含的拷贝数，即使发生基因重排，也不会产生误差。Giovanna等［25］采用Real-time PCR技术对转基因番茄的一个内源单拷贝基因tomato ascorbate peroxidase (apx)和两个外源基因tomato spottedwilt virus (TSWV N) 和nptⅡ进行了Quantitative Real-time PCR检测。结果表明，虽然两个外源基因TSWV N和nptⅡ插入于同一T DNA中，紧密连锁，但所检测到的拷贝数在同一转基因植株中却不尽相同(表1)，这可能是由于转化基因盒（transformation cassette）在插入植物基因组中时发生了某种修饰，导致基因重排，而采用一般的分子检测，如Southren杂交是无法检测到的。

表1Quantitative Real time PCR检测TSWV N

和nptⅡ插入拷贝数［26］

Table 1Real time PCR estimates of copy number for

TSWN N and npt Ⅱ transgenes and rearrangements

转基因株系〖〗TSWV N〖〗nptⅡ〖〗基因重排111 6〖〗1〖〗1〖〗否99 1〖〗1〖〗1〖〗否1 2 c〖〗1〖〗2〖〗是110 1〖〗2〖〗2〖〗否46 1〖〗2〖〗1〖〗是80 1〖〗2〖〗2〖〗否127-1〖〗2〖〗4〖〗是133 1〖〗3〖〗3〖〗否1 1〖〗3〖〗2〖〗是30 4〖〗3 4〖〗3〖〗？113 12〖〗3 4〖〗3〖〗？20 2〖〗7 10〖〗9 10〖〗？197 1〖〗7 10〖〗5〖〗是118 2〖〗0〖〗5〖〗是110 1(纯合体)〖〗2〖〗2〖〗否6展望植物基因工程自诞生以来已经取得了许多激动人心的成绩。我国科技部、财政部联合启动了“国家转基因植物研究与产业化专项”，旨在加快我国转基因植物研究与产业化进程，提高我国在此领域的自主创新能力，形成具有国际竞争能力的转基因植物产业。在专项的大力资助下，在许多方面取得了长足的进展：分离和克隆具有自主知识产权的基因，建立了一系列安全、高效的转基因体系，获得了一批转基因植物，一部分转基因新品种已进入田间释放阶段。

但遗传转化技术毕竟是一门年轻的技术，随着研究的深入，在看到其诱人前景的同时，也产生了很多亟待解决的问题，如遗传转化的效率、外源基因在转基因植株中的时空表达特性及在后代中的稳定遗传性、转基因植株田间释放和转基因食品的安全性等，已经引起了广泛关注，相继产生了上述的新技术和新方法。相信在科学工作者的不懈努力下，植物遗传转化技术将不断发展和完善，必将为农业和林业的发展带来新的生机与活力，也带来一场新的“绿色革命”。

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The Application of New Technology and Methods in Plant Transformation

CHEN YingHUANG Min renWANG Ming xiu

(Key Lab of Forest Genetics and Gene Engineering of Nanjing Forest UniversityNanjing210037,China)

AbstractIn recent years, many genetically plants were obtained and some important transgenic crops were commercialized. Some new transgenic technology and methods were explored and used, such as: somatic embryogenesis system, chloroplast transformation system, sonication assisted agrobacterium mediated transformation, multi-auto-transformation system, positive selection system and Quantitative Real time PCR. The transgenic technology will more and more efficient and safe and the future genetically modified plants will be adapted to consumers and environment. The characterizations, up to date development and the prospect of application of these new transgenic technology and methods were discussed.

Key wordsPlant gene engineeringTransformation rateTransgenic plants safety