猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒说明书
猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒说明书Pseudorabies Virus gpI Antibody Test Kit (PRVgpI -Ab)
用途
畜得测PRV gpI 是用于检测猪血清中伪狂犬病病毒（PRV）gpI抗体的酶联免疫检测试剂盒。gpI(又名gE)抗体的存在表明猪曾感染PRV的野毒株和/或接种过含gpI抗原的疫苗。在美国，该试剂用于猪场管理和猪伪狂犬病的根除计划。当猪场使用gpI缺失PRV疫苗（如Boehringer Ingelheim 公司，Norden公司，Syntrovet公司和Solvay公司产品），并由批准实验室检测时，该试剂被用作州/联邦猪伪狂犬病消除计划的正式判定实验。
概述
用来保护猪免受伪狂犬病感染的传统策略，包括使用普通PRV疫苗和USDA许可的基因缺失PRV 疫苗。传统的血清学方法检测免疫后PRV的感染情况有很大的局限性，因为它们不能区分免疫猪和自然感染猪。
国际上许多疫苗生产商研制了安全有效的PRV gpI缺失疫苗，这种疫苗的使用可以使血清学方法区分免疫猪和自然感染猪。在这些疫苗中使用的病毒经过选择后消除了毒力因子的合成，但并不影响病毒的抗原性。另外，由于编码非必需蛋白质gpI的DNA序列的自然缺失，从而提供了血清学的鉴别机制。因此畜得测PRV gpI检测试剂盒能够排除gpI缺失PRV疫苗免疫抗体的干扰，从而能特异性地检测出野毒株感染的动物和含有gpI抗原的PRV疫苗免疫的动物。试剂盒中使用的抗体是gpI特异性单克隆抗体。
使用gpI缺失疫苗免疫前，应使用该试剂盒或畜得测PRV筛选和/或确认试剂盒来确定猪的免疫状态。猪经过免疫后，应至少每半年使用PRV gpI试剂常规检测一次猪PRV野毒株的感染情况。
原理
畜得测PRV gpI试验使用两倍稀释(1:2)的血清在PRV抗原包被的微孔中进行。在第一次的孵育阶段，存在于血清中的包括抗gpI抗体在内的PRV抗体，与塑料板孔上的抗原反应。洗涤后，酶标抗PRV gpI单克隆抗体加到微孔板中，并在第二次孵育中竞争结合gpI病毒抗原。如果被检血清中没有gpI抗体，酶标gpI抗体可与gpI抗原自由反应。相反，如果被检血清中存在gpI抗体，则酶标gpI单克隆抗体与抗原的反应被阻断。孵育后，没有反应的标记物被洗去，加入底物/显色剂溶液后，在酶的存在下，底物转变为一种能与显色剂反应产生蓝色的物质。使用分光光度计测量650nm的吸收值A(650)。被检样品的A(650)值除以阴性对照的平均A(650)值，计算得出样品/阴性值（S/N）。样品中gpI抗体的含量与其A(650)和S/N值成反比。如果存在抗gpI 抗体，表明以前曾感染PRV野毒株或应用过普通的弱毒疫苗或灭活疫苗。使用畜得测PRV筛选和/或确认试验检测到PRV抗体，而畜得测PRV gpI试验检测不到gpI抗体的存在，表明猪免疫过gpI缺失疫苗。
试剂
1．PRV包被板6块30块
2．HRPO标记抗PRV gpI抗体：含蛋白稳定剂的缓冲液，庆大霉素防
60ml350ml
腐
3．阴性对照：对PRV gpI 无反应的猪血清，叠氮钠防腐5ml5ml
4．PRV gpI阳性对照：抗PRV gpI抗体，叠氮钠防腐5ml5ml
5．样品稀释液：蛋白稳定缓冲液，叠氮钠防腐120ml300ml
G．10倍浓缩洗涤液：磷酸缓冲液，庆大霉素防腐235ml1440ml
H．TMB底物液60ml315ml
I．终止液60ml315ml
自备器材
1. 50、100μl 精确微量移液器或连续移液器。
2. 一次性移液器吸头。
3. 配制洗涤液的500ml 量筒。
4. 96 孔板酶标仪。
5. 稀释样品的玻璃或塑料管。
6. 蒸馏水或去离子水。
7. 滴加和吸去洗涤液的装置。
8. 吸液用的真空和控制装置。
使用注意事项
1. 处理所有的PRV 材料以免PRV 的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV 的传染源。
2. 勿用口移液。
3. 使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。
4. TMB 底物和终止液对皮肤有刺激性。
5. 试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRV gpI 抗体的污染。
6. TMB 不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB 底物液。
7. 所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。
8. 所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。
9. 注意防止试剂盒成分的污染。
10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。
11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。
样品的制备
用样品稀释液将被检样品稀释2 倍 (1:2)。
取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV 包被板前应混匀。
洗涤液的制备
浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10 倍稀释（例如：每块板用30ml 浓缩液加上270ml水）。
操作步骤
使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。
1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。
2.在A1，A2 和A3 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阴性对照。
3.在A4，A5 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阳性对照。
4.在其余的孔内分别加入100μl 已稀释好的被检样品。
5.室温下孵育1 小时或2－7℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。
6.用大约300μl 洗涤液洗涤板孔，重复3－5 次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。
7.每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记抗PRV gpI 抗体。
8.室温下孵育20 分钟。
9.重复步骤6。
10.每孔加入100μl TMB 底物液。
11.室温下孵育15 分钟。
12.每孔加入50μl 终止液，使反应终止。
13.分光光度计调零。
14.测量并且记录被检样品和对照的A(650)。
15.计算结果。
结果
阴性对照A(650)的平均值减去阳性对照A(650)的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果试验无效，试验操作可能有误，试验应重做，并应详细阅读说明书。首先通过计算每个样品的S/N 值，判定其gpI 抗体的有无。
具体方法参见样品结果的计算。
注意：北京爱德士元亨生物科技有限公司有进行平均值和S/N值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统（xChek）。
结果判定
1.如果S/N值低于或等于0.60，样品应判定为PRV gpI抗体阳性。
2.如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间隔一定时间后重新采样、检测。
3.如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRV gpI抗体阴性。
注意：确定阳性应作两次重复。
伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列
伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析 黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13 (11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095; 21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005) 摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491 bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。gG 具有膜蛋白的结构特点。 关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列 中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704 Cloning ,sequence analysis of the gG gene of Pseudorabies virus SH strain HUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1, ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13 (1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture , Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Science and Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China ) Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1 K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence 伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057) 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @ njau 1edu 1cn 南京农业大学学报 2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity
人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可
规模化种猪场猪伪狂犬病的净化方案
规模化种猪场猪伪狂犬病的净化方案 摘要猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病[1]，新生仔猪感染后主要以体温升高和神经症状为主要特征。本文通过对某猪场发生仔猪伪狂犬病的诊断，从发病情况、临床症状、剖检变化、实验室诊断、动物街种实验、防治净化等方面对该病进行了阐述。 关键词伪狂犬病；基因缺失苗；防治措施；净化 1 伪狂犬病的现状 由于伪狂犬病疫苗的普遍免疫,典型伪狂犬病的发生率降低；尽管大部分猪场进行了伪狂犬病疫苗的免疫,但有些猪场仍存在伪狂犬病引起的危害,表现为母猪繁殖障碍及哺乳期仔猪的拉稀；保育猪及生长期、育肥期猪与伪狂犬病有关的呼吸道疾病发生率增高；种公猪已成为猪场伪狂犬病的主要传染源,使种母猪群的野毒感染率随胎次的增加而呈线性上升[2]。 2 病原学 伪狂犬病病毒属于疱疹病毒，呈圆形或椭圆形，为双股DNA病毒，具有完整囊膜和轴突[3]。主要存在于脑脊髓组织中，在发生败血症时存在于血液和实质器管，恢复后1 个月内带毒。病猪带毒时间长，可垂直感染，传染源主要是带毒鼠类和病猪，病毒随病猪和带毒猪的鼻液、唾液、乳汁、尿、精液、阴道分泌物排出体外，污染饲料、饮水、用具和周围环境。其传染途径主要是消化道、呼吸道及损伤的皮肤感染。伪狂犬病病毒对外界环境的抵抗力很强，在污染的猪舍的内能存活 1 个多月，在肉中可存活5 星期以上。病毒对热、烧碱等敏感，一般的消毒药都有效，如0.5%次氯酸钠、3%复合酚类消毒剂作用 10 分钟即可将其杀死，碘酊、季铵盐也能迅速有效地杀灭伪狂犬病毒。 3 流行病学 3.1 易感动物 猪是PRV惟一的自然宿主，能够引起猪临床、亚临床和潜伏感染等。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感，人工接种可引起典型的发病症状。PRV还可感染牛、羊、犬、猫、烷熊、鼠等，偶尔可以感染马属[4]。虽然目前尚无人类感染PRV的报道，但有文献称灵长类动物，如恒河猴和绒猴对此病较敏感。 3.2 传染源
利用Tn7介导的转座快速构建重组伪狂犬病毒
V IROLOGICA S INICA, August 2007, 22 (4):316-325 Received: 2007-04-04, Accepted: 2007-05-18 * Foundation item: Key technologies R&D program (2006BAD06A01) from the Ministry of Science and Technology of China. ** Corresponding author. Tel: +86-27-87199239, E-mail: wanghz@https://www.360docs.net/doc/dc17209010.html,
ZHUAN et al. Rapid Construction of Recombinant Viruses of PRV Genome 317 functional domains within the proteins (9). Such studies often require establishment of large numbers of recombinant viruses which are usually created by homologous recombination in infected cells relying on the cellular recombination and repair machinery. However, this can be a laborious and sometimes impossible task, especially if the mutant has a severe growth disadvantage compared to the wild-type virus. Bacterial artificial chromosomes (BACs), single copy F-factor-based plasmid vectors of intermediate insert capacity (15), have now enabled the cloning of complete herpesvirus genomes and infectious virus genomes can be shuttled between Escherichia coli (E. coli) and eukaryotic cells. While herpesvirus BAC DNA engineering in E. coli requires neither restriction sites nor cloning steps and allows the introduction of a wide variety of DNA modif- cations, the large size of these bacmids precludes the use of rapid in vitro methods of manipulation commonly employed for construction of small plasmids. Tn7, a site-specific transposon, transposes almost exclusively to a distinct attachment site named attTn7 within the E. coli genome (1). By introducing this attTn7 sequence into a BAC, Tn7 can serve as an insertion vehicle (4). This is particularly useful if numerous genes and constructs need to be tested for their expression in the context of viral genome. Tn7-mediated transposition has been well exploited for research on functional genomics of baculoviruses (4). Recently, this technology has been applied to bacmid-cloned cytomegalovirus (CMV), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, for rapid recombinant virus construction (2). In this paper, we report the development of a technology employing Tn7-mediated transposition as a rapid and reliable method for recombinant PRV construction. A lacZα-mini-attTn7 region was inserted into the intergenic region between the gG and gD genes in an attempt to maintain every gene and element of the parental virus. Then green fluorescent protein (GFP) gene was introduced to test the utility of this transposition system and the stability of mini-Tn7 insertions in cell culture. The technology should greatly facilitate the detailed mutagenic studies of PRV. MATERIALS AND METHODS Plasmids, strains, and reagents Plasmids pGS284 and pBecker3, strains GS500 and S17λπ were provided by Lynn W. Enquist, Princeton University, USA. The pGEM-T Easy was purchased from Promega Co. (Maddison, USA), and plasmid pEGFP-N1 from Clonetech Laboratories, Inc. (Mountain View, USA). DNA restriction enzymes, T4 DNA ligase, alkaline phosphatase, exTaq hot start DNA polymerase and 2×GC buffer I were the products of TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, China). Plasmids pFBCMV-GFP and pZFBΔtk were constructed and stored in our lab. Strains DH5α and DH10B were stored in our lab. Lipofectin reagent and Delbecco’s Modified Essential Medium (DMEM) were purchased from Invitrogen Co. (Carlsbad, USA), and fetal bovine serum (FBS) from Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd. (Hangzhou, China). Virus and cells The wild-type PRV used was vBecker3, generated by transfection of pBecker3 into Vero cells (18). Mutant PRVs (vBeckerZF1 and vBeckerZF2) were
猪场伪狂犬病净化措施
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/dc17209010.html, 猪场伪狂犬病净化措施 作者：郑迎春 来源：《新农村》2018年第05期 近几年来，伪狂犬病在猪场发病率呈上升趋势，给养猪场造成了严重损失。生猪养殖场户在猪伪狂犬防治方面虽然采取一些措施，但收效甚微，我市通过与齐鲁动保公司联合对部分养猪场进行了流行病学调查和检测，发现猪伪狂犬隐性感染率高达60%以上，发病率达20%以上，直接或间接对养猪场造成了严重的危害。为做好猪场伪狂犬病的防控工作，故对部分养猪场采取监测、淘汰、免疫等措施，实施猪伪狂犬病净化，现就有关措施交流如下： 1猪伪狂犬病流行态势 2011年以前，我国普遍应用疫苗预防伪狂犬病，控制较好，发病率下降，总体控制较 好。而在2011年猪伪狂犬病卷土重来，老病新发，风云再起。2011年10月，在我国河北、山东、豫北等养殖密度较大的黄河下游区域首先爆发。2012年3月，江苏、安徽、上海等地爆发。2012年5月，华东、华北、华中等地爆发。2012年11月，广东、广西等地爆发，2013年4月，我国中东部数十个省份爆发了大面积的猪伪狂犬病。2014年5月，全国大部分猪场爆发。 2典型症状病变及危害 2.1母猪流产。妊娠母猪中后期发生流产，临床症状表现为：整窝出现流产、死胎、木乃伊胎，窝平均有2-5头死胎。 2.2仔猪和育肥猪神经症状。一般1-20日龄发病仔猪明显表现为口吐白沫，四肢划船状，角弓紧张等神经症状，呼吸困难，1-2天左右衰竭死亡，死亡率高达到100%。育肥猪死亡率相对偏低，个别育肥猪表现为拉稀，出现神经症状，病愈后生长不良。 2.3危害。发病期间，猪只死亡率高，损失大。流行过后，通过监测原伪狂犬阴性猪场变成阳性。 2.4剖检症状。剖检发现病猪可见肝脏密布白色结节，脾脏瘀血，表面可见大量白色结节，肾脏有出血点或白点，扁桃体溃疡，脑膜充血。 3实验室诊断 对发病猪场采样送省疾控中心实验室检测，抗体阳性率100%。2014年对我县部分猪场检测平均野毒感染率达到32%。 4原因分析
B-raf基因突变检测试剂盒(PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程
B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中
【CN109943539A】一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910244928.7 (22)申请日 2019.03.28 (71)申请人 中国科学院武汉物理与数学研究所 地址 430071 湖北省武汉市武昌区小洪山 西30号 (72)发明人 贾凡 徐富强 李莉 缪欢 吕培 施祥玮 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 35/76(2015.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环 路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种高亮表达红色荧光蛋白 的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备 方法和应用，包括（1）制备表达红色荧光蛋白的 重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用， 该平台成功制备高亮表达红色荧光蛋白的重组 伪狂犬病毒。本发明成功获得高亮表达红色荧光 蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，在 神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制 病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动 物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方 面具有广泛的应用价值。 权利要求书1页 说明书5页序列表8页 附图2页CN 109943539 A 2019.06.28 C N 109943539 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109943539 A 1.一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤： 1)具备高亮表达红色荧光蛋白能力的克隆：以pCDNA3.1(+)为载体，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA； 2)构建高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA；将SEQ ID NO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA-right arm；将所得的质粒转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养基上清；纯化后即获得高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。 2.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。 3.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。 4.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。 5.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。 6.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。 2
Braf基因突变检测试剂盒说明书
人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长
猪伪狂犬病的预防与用药
猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理 最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。 那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？ （一）综述 猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。 本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死
亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。 （三）病理变化 剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。 （四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。
猪伪狂犬病净化方案
猪伪狂犬病净化方案 （见农业部《伪狂犬病防治技术规范》） 我国种猪场伪狂犬病净化方案内容由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。种猪场根据本场实际情况，分阶段逐步实施。 一、材料准备 疫苗：使用国家批准的基因缺失疫苗。 抗体检测试剂盒：检测伪狂犬病全病毒抗体或gB抗体试剂盒、区分免疫猪和感染猪的抗体鉴别检测试剂盒。试剂盒必须获得国家相关批准文号。 待净化猪群的确定：应选择健康、生产成绩稳定的种猪群开展伪狂犬病的净化。在初次开展本病净化的大型种猪场中，可先选定500-1000头母猪群开展净化，逐步推进。 二、净化方案 1、调查阶段 如果种猪群母猪大于500头，按照种母猪群数量的10%、种公猪全群采血。分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群（种母猪和种公猪）伪狂犬病野毒感染状态。如果母猪数量小于500头，可一次采集全部种猪的样品，检测gE抗体，根据检测结果，确定进入何种净化阶段。 1.1如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段； 1.2如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.3如果gE抗体阳性率在10%-20%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.4如果gE抗体阳性率大于30%，则实行“全群或部分清群”措施，暂不考
虑实施净化； 1.5在全部种猪群gE抗体阴性时，可直接进入“监测与认证维持”阶段。 2.强化免疫控制阶段 使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫该猪群，同时采取生物安全和灭鼠等综合措施，达到控制的目的。 2.1免疫程序的制定 2.1.1种母猪（种公猪） 每年普免3-4次。或者母猪配种前和产前4周分别免疫一次。普免时，避免在分娩前7天内接种疫苗，以减少接种应激对分娩的影响，但可于母猪分娩后补免。 公猪每年3次免疫，采用集中普免的方式。 2.1.2仔猪 分别测定仔猪在50日龄、60日龄和70日龄时的伪狂犬病抗体（gB抗体或全病毒抗体），每个阶段抽样30份，样品来自10窝猪，每窝3头，确保采样的均衡性。根据抗体水平确定仔猪的免疫日龄。猪场可根据产房小猪和保育猪是否出现伪狂犬病(如腹泻、神经症状等)，使用出生猪滴鼻免疫的方式，克服母源抗体干扰，并以提高局部的黏膜免疫力。 2.2实验室评估 仔猪免疫后3周，检测30份血清gB或全病毒抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果85%的样品为gB抗体或全病毒抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 2.3 临床评估 主要考察猪群的生长成绩。母猪无繁殖障碍，哺乳仔猪无尖叫、腹泻和转圈，最后死亡等现象；保育猪无神经症状，育肥猪无伪狂犬病病毒引起的呼吸道症状。 2.4配套的生物安全措施 2.4.1如需引种，只能引进伪狂犬病gE抗体阴性的后备种猪； 2.4.2对进出猪场的车辆和外来人员进行消毒； 2.4.3无害化处理病死猪和流产死胎等； 2.4.4定期灭鼠。 3、检测淘汰阶段
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 7测试/盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1
详解猪伪狂犬的病理过程及其防治.
详解猪伪狂犬的病理过程及其防治 核心提示：本文详细阐述猪伪狂犬病的临床表现、发病过程及诊断要点。 猪伪狂犬病病（PPV）是由疱疹病毒属的伪狂犬病毒引起的疾病。在猪群中该病毒能够通过妊娠从上一代传递到下一代的垂直传播，还能够通过猪只之间互相接吻以及蚊蝇叮咬而水平传播，属于乙型传播疫病。主要经呼吸道传播，病毒感染后首先在鼻咽部、扁桃体中增殖，再经神经侵袭脑、脊髓的同时，也可由鼻腔粘膜经呼吸道侵入肺泡。这是临床初生仔猪无其他明显症状，但若发生抽搐后迅速死亡的主要原因。 一、临床表现 感染早期体重25kg以上的商品猪，病毒侵袭导致猪的肝脏的胆汁分泌机能亢进，突然增多的大量胆汁刺激十二指肠和幽门壶腹部，病猪表现胃肠痉挛和粪便发黑，阵发性腹痛，频频排粪，采食量下降；体温39-41℃。进入4-10天的感染中期，由于十二指肠和幽门壶腹的持续痉挛，幽门突红肿，溃疡，形成胆汁排泄障碍和向胃部的逆流；同时，由于持续增值的病毒对外周淋巴的侵袭引起的全身发热，水排泄的增强，继发胆汁粘稠，胆囊内壁充血、出血和胆囊壁增厚等炎症变化。与此同时，大量胆汁进入胃部，打破胃内容物的酸碱平衡，使pH值上升，直接引发病猪发生呕吐。pH值偏高的胃液长时间的浸润，一方面使得胃神经反射机能麻痹，呕吐很快停止，病猪出现采食量下降，这是饲养密度过大或观察不及时，个体发病后不易被发现的主要原因；另一方面，贴近胃壁的高pH值胃液直接损伤胃底粘膜，引起胃底充血、出血和穿孔、胃痛，形成病猪有食欲，但采食量下降或呈间断性采食（即添加饲料时猪反映明显，但采食数口后停顿下来，稍后继续采食，并再次发生采食停顿）、粪便发黑的现象。到了10-15天（部分单一性病例可达20天）的感染中后期，由于胃底损伤严重，病猪采食量下降至正常采食量的1/5-1/8，甚至
猪伪狂犬病病毒基因序列分析
猪伪狂犬病病毒主要功能蛋白基因序列分析 摘要：根据Genbank中已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）gE、TK基因的序列各设计了1对引物，对分离得到的PRV毒株的gE、gG、TK基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序，测序结果与预期的PRV gE、gG、TK基因片段相符。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV毒株的gE、gG、TK氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV 流行株相同，从而推测该毒株为PRV变异毒株。 关键词：伪狂犬病毒；gE基因；TK基因；序列分析 猪伪狂犬（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Peudorabies virus，PRV）引起的以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病[1]。该病在我国发生较为严重，是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国目前广泛应用的是自然缺失弱毒活疫苗Bartha-k61株，使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是，2011年底至2012年该病在中国东北部分省份流行，甚至在许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了猪伪狂犬病疫情，给中国的养猪业造成了巨大的经济损失[2-6]。 伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)属于双股线性DNA病毒，大小约150kb，DNA基因组中G+C的含量高达73%，可编码100种蛋白质。基因组由独特的长节段(UL)、独特的短节段(US)、内部倒转重复序列(IRs)和末端倒转重复序列(TRs)组成。在病毒的结构蛋白中，gE糖蛋白是主要毒力因子之一，并作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染。TK基因不仅是最主要的毒力基因，而且也是决定病毒持续感染的重要因素[7]。一旦TK基因缺失，PＲV变异株对宿主的毒力将丧失或明显降低。 2013年至2014年上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍研究室从山西某免疫猪伪狂犬病（Bartha）疫苗的规模化猪场成功分离并鉴定出四株PRV，命名为SX1，SX2，SX3，SX4株，为明确该四株分离株是否属于PRV抗原变异毒株，本研究对PRV SX株的gE、gG、TK全基因进行克隆和测序，通过与国内外其他已公布PRV分离株的gE、gG、TK推导的氨基酸序列进行比对，构建核苷酸序列遗传进化树，以期为丰富PRV分子流行病学和开发科学有效的新型猪伪狂犬病疫苗提供重要科学依据。
关于猪伪狂犬病净化思考
关于猪伪狂犬病净化思考 动物疫病净化应当说是一个非常重要的工作。在国家发布的中长期动物疫病防治规划里，提到了动物疫病的防控三个阶段，一个叫控制，一个叫净化，一个叫消灭。那么目前来说，中国在改革开放三十多年的时间，动物疫病的防控取得了长足的发展。在疫病的体系建设、技术研发、队伍建设、资金投入、法律法规以及制度建设等方面，都已经逐渐地在完善。也可以说，目前大规模的重大动物疫病的发生率已经得到了很好的控制。在这种背景下，我们要转入到动物疫病的净化这个阶段来。在2017年9月，国务院办公厅和中央办公厅发了一个关于加快体制机制建设、推动绿色农业的发展意见，提到了要实施动物疫病净化的计划，并且推动动物疫病的防控从有效控制向净化和消灭转变。另外，在2016年农业部也下发了关于加强组织型管理的一个意见，里面也特别强调了要进一步地加强动物疫病，特别是种畜禽的疫病净化，通过净化来提升整个中国种畜禽的健康水平。也可以说，目前净化工作成为农业部的一个重点，从2018年开始大力推进。 1、国家（层面）制定了伪狂犬净化政策，有哪些措施？ 伪狂犬病的净化，是从2013年我们开始进行研究，从2013年开始搞疫病净化的创建和示范。经过了几年的时间，现在通过了8个疫病净化的示范场和84个疫病净化的创建场。
这里面就包括猪的伪狂犬病的净化场和创建场。通过示范和创建使这个机制进行了集成，取得了很好的成效。特别是种猪场，通过净化使猪场的生产效益明显提升，特别是PSY 提升，大大地增强了种猪场的竞争力。 中国动物疫控中心在推进疫病净化过程中，特别是猪伪狂犬病净化过程中也做了大量的工作。比如，进行培训，制定了一系列的培训计划。除了中国动物疫控中心组织了全国的疫病培训以外，各省也按照相应的方案进行培训。另外在专家队伍的建设、专家委员会的建设以及相关的实验室配套组建方面也做了大量的工作。在推广模式上，我们也进行了有益的探索。我们的思路是先点、后线、再面、再区。可以说，从某个场入手，然后再下一步就是一个线，也就是从原种场、种猪场这样的一个线，再到一个面，然后再到一个区。 2、伪狂犬净化有什么标准？ 中国动物疫控中心下发了一系列的伪狂犬病净化的标准，里面主要有两个，一个叫免疫净化，一个叫做非免疫净化，那么呢这个名字很值得商榷。免疫净化，实际这个标准就是控制标准，非免疫净化就是净化标准。作为控制标准，我们的前提是猪场进行了猪的伪狂犬免疫，对所有的猪包括种公猪、生产母猪以及后备猪等进行采样，检测它的gE抗体，全部是阴性。作为它的免疫抗体，gE抗体阳性率要超过