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山东药品食品职业学院2007级毕业论文
毕业论文
论文题目：乳铁蛋白的功能特性及应用情况
系别: 食品系
专业：食品营养与检测
班级： 07.22
学号： 200701052204
姓名：宗立萍
指导教师：吕艳
目录
摘要 (1)
关键词 (1)
1 Lf的分布及含量 (2)
1.1 Lf的分布 (2)
1.2 Lf的含量 (2)
2 Lf的基本结构 (2)
3 Lf的理化性质 (3)
3.1 乳铁蛋白的糖基化反应 (3)
3.2 乳铁蛋白的配基作用 (3)
3.3 乳铁蛋白受体 (3)
4 Lf的功能与作用机制 (4)
4.1 参与铁代谢 (4)
4.2 广谱抗菌作用 (4)
4.3 调节免疫 (4)
4.4 抗病毒 (5)
4.5 阻断氧自由基 (5)
4.6 避免刺激肠胃 (6)
4.7 刺激双歧杆菌生长 (6)
4.8 细胞繁殖中的作用 (6)
4.9 抗肿瘤作用 (6)
5 Lf的分离提取 (6)
5.1 色谱法 (6)
5.2 超滤法 (8)
6 Lf的安全性 (8)
7 Lf的发展趋势 (8)
8 国内外Lf的应用情况 (9)
8.1 国外Lf的应用情况 (9)
8.2 我国乳铁蛋白的应用 (9)
9 LF的应用前景展望 (10)
参考文献 (11)
致谢 (12)
乳铁蛋白的功能特性及应用情况
作者：宗立萍指导老师：吕艳
摘要:本文主要介绍了母乳中乳铁蛋白的分布与含量、理化性质、功能特性与作用机制、提取方法、安全性及发展趋势，乳铁蛋白在国内外的应用情况及乳铁蛋白的需求产量及市场价格。
关键词:乳铁蛋白；功能特性；应用
1 Lf的分布及含量
1.1 Lf的分布
Lf主要存在于哺乳动物乳清中的球蛋白中，是母乳中含量第二多的蛋白质，占普通母乳蛋白质的10%。另外，在牛、猪、山羊等的乳中也能分离到乳铁蛋白。但在商业上使用的乳铁蛋白一般是从乳牛的牛乳中提取的。除乳汁外，其他消化和生殖系统的外分泌液中也含有一定量的乳铁蛋白。
1.2 Lf的含量
Lf在乳汁中的含量随动物种类、泌乳时间、胎次、个体等而有所不同。山羊、猪乳中的Lf质量浓度约为0.02~0.2g/L，豚鼠、马乳中的Lf质量浓度可达0.2~2.0 g/L，人乳中的Lf质量浓度可达2.0g/ L以上[4]。人初乳中Lf含量6~8 mg/mL，常乳为2~4mg/mL.Hazer(1989)的资料显示，人分娩后的第1d初乳中Lf 的质量浓度可高达14.0g/L，第3d为4.9g/L，第50d为2.1g/L，第210d仍可维持1.6 g/ L的水平，在整个泌乳期都具有重要的生理功能[3]。相比之下，牛乳中的乳铁蛋白含量则要低得多。母牛产后第1d初乳中的质量浓度可达1g/L 以上，24h后降至0.42g/L，15 h以后降至0.22g/L，同一个个体常乳中质量浓度约为初乳的20%[4]。
2 Lf的基本结构
乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白，它的分子主体是一个大约有700个氨基酸残基构成的多肽链，相对分子量约为80ku.该多肽链可以折叠成两个球状叶，一端是氨基末端叶，一端是羧基末端叶，每一叶状结构都含有一个Fe3+和一个碳酸氢阴离子结构部位，每一叶都能高亲和性地可逆的与铁结合。其中，Fe3+结构位于一个很深的裂缝中，当铁离子缺乏时，每一片叶片可以曲折，使裂缝打开或关闭，但当多肽链已同铁离子结合时则裂缝处于闭锁状态[5]。
3 Lf的理化性质
3.1 乳铁蛋白的糖基化反应
乳铁蛋白中糖基成分约占7%~11.5%，天冬酰胺残基可与糖基相连，由唾液酸与果糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖形成聚—N一乙酰乳糖胺多糖与之相连，脱去糖基并不影响乳铁蛋白与受体的结合[6]。牛乳铁蛋白的N133，281，368，476，545位点可以进行糖基化反应，人乳铁蛋白有2个糖基化位点。这些糖化位点都具有异质性，是由唾液酸的成分及与之相连的糖链大小所引起的。
乳铁蛋白中糖链的作用尚不十分明确，可能与乳铁蛋白的功能活性、构象稳定性有关，也可能与免疫原性、微生物结合识别位点有关，或是与细胞膜上接触信号有关[7]。
3.2 乳铁蛋白的配基作用
乳铁蛋白可与多种小分子及生物大分子结合，如苔盼蓝、免疫球蛋白、血清蛋白、DNA， LPS，琼脂(糖)、两性电解质、肝素等，辛糖是其结合的最小糖基。肝素结合位点为BXBB，BXXBBXB，BBXB或BBBXXB，B代表碱性氨基酸残基。有人提出乳铁蛋白与DNA的结合是在严格的条件下发生的，具有高度的专一性，并激活了结合部位基因的转录[8]。
3.3 乳铁蛋白受体
小鼠、猪小肠绒毛刷状缘中发现了与乳铁蛋白结合的受体蛋白，其他生物及不同类型的细胞膜表面也存在这种受体位点。人乳铁蛋白N端部分(3281氨基酸残基)的CFQWQRN-MRKVRGPPVSC(20-37氨基酸残基)或KRDS(39-42氨基酸残基)能被识别，并具有抑制凝集的作用。在肝细胞中依赖钙离子而结合受体的决定因素是乳铁蛋白的C端被暴露出来，大量革兰氏阳性菌细胞膜表面都有专一性的乳铁蛋白受体，生物化学和遗传学分析证明与乳铁蛋白结合的是两种蛋白LbpA和LbpBo，与DNA的结合是在严格的条件下发生的，具有高度专一性，并激活了结合部位基因的转录。
4 Lf的功能与作用机制
4.1 参与铁代谢
人体中的乳铁蛋白有助于人体对铁的吸收。这是因为乳铁蛋白通过它的氨基和羧基末端两个铁结合区域能高亲和的、可逆的与铁结合，并维持铁元素在一个较广的pH值范围内完成在十二指肠细胞的吸收和利用。除两个铁结合位点外，其他部位也可吸附铁离子。而且，如果体内铁处于过剩状态下，乳铁蛋白则可明显减缓铁对肠道的刺激作用。一是因为乳铁蛋白螯合了铁，避免了铁离子对肠道直接刺激作用。二是进食乳铁蛋白可以减少无机离子的摄入量。
4.2 广谱抗菌作用
体内外试验表明，乳铁蛋白具有广谱的抗菌作用，并能预防微生物感染。乳铁蛋白对细菌有3种不同的作用机制。
(1)乳铁蛋白的抑菌作用。这与它的高度铁结合亲和性有关，它能使细菌失去所需生长的基本养份铁。
(2)乳铁蛋白的杀菌作用。这是通过乳铁蛋白N一末端强阳离子杀菌区域(一个独特的铁结合区域)，直接起到杀菌作用。这个杀菌区域增加了细菌的膜渗透性，从而引起革兰阴性菌的脂多糖从外膜渗出。
(3)除了乳铁蛋白的抑菌和杀菌作用之外，从激活的中性白血球中释出的乳铁蛋白能通过调节全身免疫应答而发挥出抗微生物活性。目前已在一些细胞中发现对乳铁蛋白具有高度亲和性的受体，它们包括:淋巴细胞、单核白血球、巨噬细胞、血小板。乳铁蛋白对全身免疫应答作用的分子机制还有待继续阐明，但已有有关调节细胞因子释放的报告。
4.3 调节免疫
乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力[9]。而且嗜中性粒细胞是含乳铁蛋白最多的细胞，当机体受感染时就可将乳铁蛋白释放出来，释放出的乳铁蛋白夺取致病菌的铁离子致使后者死亡。由脂多糖组成的微生物细胞膜结合在乳铁蛋白上，因此乳铁蛋白可以防止细胞膜免疫失控的发生，体外模拟
实验和对鼠类动物和小猪的体内实验都证实了乳铁蛋白具有调节免疫的功能。用牛乳的乳铁蛋白治疗猫的口腔炎，发现嗜中性粒的噬菌细胞活性明显被激活，在人体内也发现类似现象。对照实验证实，连续4周给老鼠进食乳铁蛋白能刺激其肠道和脾内的IgA和IgG分泌，Debbabi等认为，乳铁蛋白是黏膜免疫系统的一激发因子，并且只有粘附在黏膜细胞上才能发挥激发作用。
4.4 抗病毒
乳铁蛋白可以抑制HIV和细胞巨化病毒、疤疹1和2型病毒、肝炎病毒、流感病毒和旋病毒等。乳铁蛋白抑制病毒的机制不是很清楚，可能是其能与病毒结合或与宿主细胞结合，从而阻断病毒与宿主细胞的结合。
4.5 阻断氧自由基
由于乳铁蛋白能结合Fe3+，抑制了由铁引起的脂氧化作用，阻断氧自由基的生成。铁是产生能导致心血管疾病、肠道癌等氧自由基的重要催化剂。因此，铁是人体代谢不可缺少的元素，但过量的铁在机体内也会引发负面影响。在氧自由基反应(Haber - Weiss反应)中，Fe3+将过氧负离子(O2-)氧化为氧气和Fe2+，Fe2+又将H2O2还原为氧自由基(OH)，(OH-)和Fe3+，最终完成了由过氧负离子(O2-.)和H2O2生成氧自由基、氧气和OH-的反应。Haber-Weiss反应式为：
O2- +Fe3+———O2+Fe2+
H2O2+Fe2+———.OH+OH- +Fe3+
O2- +H2O2———.OH+OH- +O2
嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等是通过过氧负离子(O2-.)将侵入机体的致病菌杀死，而聚集在炎症或受感染处的Fe3+和Fe2+会催化上述自由基反应，导致机体出现过多的氧自由基。乳铁蛋白能结合铁，使其不再会催化H一W反应。虽然只有嗜中性粒细胞能传递乳铁蛋白，但单核细胞和巨噬细胞的表面也有乳铁蛋白的接受体。通常只要有痕量的铁或铜等催化剂存在，就会导致氧自由基的产生，因此用鳌合剂(如乳铁蛋白)可以减少自由基的生成。
4.6 避免刺激肠胃
乳铁蛋白能增加肠道中铁的溶解性，避免过量摄入铁的副作用(如胃肠道紊乱、铁毒性)。有一系列实验证实，给婴儿进食1~2.8g/L乳铁蛋白，连续喂养38~90d 无任何异常反应，健康成年人每天进食2g乳铁蛋白，连续进食4周无异常。
4.7 刺激双歧杆菌生长
乳铁蛋白与母乳其他因子共同作用可刺激人体内双歧杆菌的生长，所以母乳喂养的婴儿较用配方奶粉喂养的婴儿体内的双歧杆菌的数量要多。
4.8 细胞繁殖中的作用
乳铁蛋白可调控细胞增殖，作为反馈因子参与骨髓生成调控。在大鼠成维L 一M细胞中表现出促进神经生长因子和分泌的作用，另外也可促进细包内质增殖。乳铁蛋白的胰蛋白酶水解物同样具有促进细胞生长作用，该片版段是由15个氨基酸残基组成的多肽，占水解物的2%左右，对应于乳铁蛋白79- 93位氨基酸残基，在牛、人及鼠中有较高的保守性。
4.9 抗肿瘤作用
乳铁蛋白对癌细胞有明显抑制作用。大鼠服用乳铁蛋白后，消化道中大量腺癌细胞减少，并对舌癌起到抑制作用；口服后能抑制小鼠结肠癌的转移。但皮下注射无上述功能。
5 Lf的分离提取
5.1 色谱法
5.1.1 吸附色谱法
它是利用固定基质和吸附物质间物理或化学吸附强度的不同来分离物质的一种方法，硫水性相互作用色谱在乳铁蛋白的分离上有着重要应用，它一般以Toyopearl为基质，在(NH4)2SO4溶液中达到吸附平衡后装柱，用去离子水、浓度
为0.25 mol/ L的HAC，浓度为0.2 mol/ L的NaOH洗脱，得纯度为80%的乳铁蛋白，其缺点是吸附容量小、效率低。
5.1.2 离子交换色谱法
Groves利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离出较纯的乳铁蛋白，此后他又开发出磷酸纤维素交换色谱法，并由Foley加以改进，得到乳铁蛋白的纯度为81%左右。羧甲基阳离子交换色谱法被应用于乳铁蛋白和乳过氧化氢酶的分离，用pH 值为7.7，浓度为0.05mol/ L磷酸钠或浓度为0.3 mol/ L的NaCl洗脱液洗脱，它可把乳铁蛋白分为a，b两种变异体，树脂能用浓度为0.2 mol/ L的NaOH和浓度为0.2 mol/ L的HCl 再生，此法较DEAE纤维法更有效。
5.1.3 亲合色谱法
亲合色谱是一种新兴的分离技术。它的一般结构为:不溶基质?连接物?隔离臂连接物?配体，基质多用琼脂糖、隔离臂多为有一定长度且可连接基质的有机物如NH2--(CH2)n-NH2(n=6- 11)。肝素琼脂糖亲合色谱可从脱脂乳中进一步分离乳铁蛋白。电泳分析表明其纯度极高。交换Cu2+的1.4一丁二醇二环氧甘油醚亚氨二乙酸琼脂糖应用于分离乳铁蛋白和免疫球蛋白，琼脂糖首先用丁二醇二环氧甘油醚活化交联，再加入亚氨乙二酸使其和活化琼脂糖结合，此树脂用Cu2+交换后呈兰色，装柱时上面1/2或2/3为栽铜树脂下半部分直接未交换Cu2+ 树脂，洗脱液为pH值为8.0~2.8浓度为0.05mol/ L的Tris- HAC 或浓度为0.5 mol/L的NaCl，25mL树脂可以吸附1L干酪乳清的乳铁蛋白和免疫球蛋白，产品纯度极高。亲合色谱法由于操作简单.分离效果好纯度高，且没有生物活性损失，是生产医药用高纯乳铁蛋白最有效的方法之一。
5.1.4 固定化单系抗体法
载有单系抗体的免疫色谱亦是一种亲合力色谱。它较成功地实现了乳铁蛋白的一步分离，在6~8周的鼠腹腔中注入人或牛的乳铁蛋白，经一系列复杂的操作分离出它的抗体((5~6 g/ L)。用抗体和异丙醇活化亲合凝胶混合制得免疫亲合色谱，洗脱液pH值为2. 7和浓度为0.2 mol/ L的HAC或浓度为0.15 mol/ L的NaCl，
洗脱后立即调至pH值为7渗析冻干。该方法的优点是分离效果好、纯度高、抗体被固定可重复使用，其缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂责(100美元/g)，难以工业化生产。
5.2 超滤法
日本学者岛崎敬一提出了超滤法分离乳铁蛋白的新方法。他选用孔径10PS，30PS，50PS，100PS，300PS，l000PS和3000PS的7种膜. 其截留分子量别为104，3×104，5×104，105，3×105，106，3×106，具体操作如下:在A法中先用300PS 膜处理，当透过液达0.5 L时，在浓缩液中加入同容生理盐水，反复操作4次得2.5 L (A-1)过滤液分子量>5×104，0.5 L浓缩液(A- 2)，浓缩液用l000PS再浓缩得到0.25L滤液(A- 4)，其分子量<105，此法乳铁蛋白的回收率为69%，浓缩2.7倍。产品蛋白质分子量介于5×104~105间，B法利用类似的原理处理。超滤法操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，其缺点是乳铁蛋白纯度较低，膜需经常清洗，此法是生产食品用乳铁蛋白最具实现工业化潜力的方法之一。
6 Lf的安全性
乳铁蛋白是从牛初乳中提取的一种天然物质，安全可靠. 其作为食品成分或食品添加剂的使用在许多国家和地区已经得到法律的承认。美国日本等许多国家有实验表明其安全可靠，无毒副作用。但是，某些地区也限制了乳铁蛋白的使用量。如台湾曾有规定:乳铁蛋白限于补充食品中不足营养使用，并且每日不得超100 mg，还可用于特殊营养食品中，可根据实际需要适量使用。
7 Lf的发展趋势
乳铁蛋白具有特殊的作用和功能，并应用了当今世界先进的生物技术: 重组基因，转基因动物来研制生产，因此正不断受到国内外研究机构、制造商的重视。利用转基因技术在牛乳腺中生产药用蛋白是生物反应器技术中最活跃最有商业化前景的研究领域之一。随着乳铁蛋白作用机制的不断阐明和开发应用范围的不断扩大，乳铁蛋白将在治疗、营养补充、食品和药品的防腐、化妆品等方面有着
广阔的应用前途，特别是婴儿食品中添加乳铁蛋白可增强免疫力，促进生长发育。目前，应用乳铁蛋白主要是从乳清中分离的天然蛋白，每公斤价格约为1 000美元。为了能更广泛的应用乳铁蛋白，必须获得廉价的重组蛋白，因此应得到高效表达的重组乳铁蛋白的转基因生物，以满足市场需求。这正是乳铁蛋白研究发展的趋势。
8 国内外Lf的应用情况
8.1 国外Lf的应用情况
在许多国家乳铁蛋白早已引起关注。如美国的Baylor医学院、Agennix公司、Genpharm公司，荷兰的Pharming公司、日本的Moriage Milk Zndustry Co Ltd，Snow Brand Milk Prod Co Ltd等都对乳铁蛋白进行了深入研究。Baylor 医学院开发了乳铁蛋白的重组生产和在真菌、酵母、细菌及哺乳动物细胞中表达的技术，克隆和表达了人乳铁蛋白基因。Agennix公司主要是从事于人乳铁蛋白的重组生产技术，并利用重组乳铁蛋白开发新的治疗药物和抗微生物化合物。Genpharm 公司主要是通过动物生产乳铁蛋白。荷兰Pharning公司利用转因牛乳汁中生产乳铁蛋白的收率为1 g/ L。日本Snow BrongMilk Prod Co Ltd、MorimagaMilkIndustry Co Ltd等在这一领域也开展了大量的研究工作。制备了在大肠杆菌中表达乳铁蛋白基因的重组质粒载体，在酵母、动物细胞内产生乳铁蛋白的表达载体。日本北里研究所和企业合作，通过临床试验证实牛奶中的乳铁蛋白能使丙型肝炎病毒减少，可望成为一种辅助治疗方法。日本三重大学和歌山劳灾区医院和森永乳业公司共同发现了人及牛乳中的乳铁蛋白能减少生长在胃上皮表面易引发胃癌等疾病的幽门螺杆菌。除此以外，美国食品药品管理局( FDA) 允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动、功能性食品。在日本、韩国也允许乳铁蛋白作为食品添加剂。
8.2 我国乳铁蛋白的应用
在我国，中国农业大学农业生物技术国家重点实验室李宁等首先从牛基因文库中克窿了aS1酪蛋白基因的启动区，并对启动区的部分核酸序列作了分析，这
为进一步研究奠定了基础。另外，江南大学食品学院和无锡日用化工应用研究所合作，采用膜分离技术和色谱技术结合的生产工艺从初乳中分离出乳铁蛋白。初乳的批处理量为300 kg。鉴定专家一致认为该工艺降低了生产成本，攻克了工业化分离纯化技术难点，属国内首创，达到国际先进水平。降低了生产成本，攻克了工业化分离纯化技术难点，属国内首创，达到国际先进水平。
9 LF的应用前景展望
目前，LF已被作为抗溃疡药、抗菌剂、抗氧化剂、抗真菌剂在临床上广泛应用，国内所使用的药品主要依赖进口，价格十分昂贵。值得欣慰的是，国内不少单位已尝试采用基因工程的方法生产LF，并获得初步成效。如曹阳采用分子生物学技术从乳腺癌患者的乳腺中克隆了人LF基因cDNA，并将之整合进体外培养的山羊乳腺上皮细胞中，经激素诱导，从培养液中检测到具有抗菌活性并结合有铁离子的重组人LF。此外，国内也有人尝试采用转基因动物乳腺生产人LF，可以设想，一旦这些方法获得突破，势必打破LF生产的瓶颈，从而拓宽LF在临床上的应用领域。
参考文献
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致谢
大学生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实，当我写完这篇毕业论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。首先诚挚的感谢我的论文指导老师吕艳。她在忙碌的教学工作中挤出时间来审查、修改我的论文。还有教过我的所有老师们，你们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。感谢三年中陪伴在我身边的同学、朋友，感谢他们为我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实的度过了三年的学习生活。