口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK-21细胞中的表达
第21卷5期中国病毒学21（5）：454-457
收稿日期：2006-02-20，修回日期：2006-06-16
* 基金项目：国家863高技术研究发展计划（2003AA241110）
作者简介：龚真莉(1981-)，女，汉，甘肃皋兰人，硕士，主要从事动物微生物学和病毒分子生物学研究。
** 通讯作者：刘湘涛(1962-)，男，汉，湖南衡阳人，研究员，主要从事动物病毒学研究。
Corresponding author. Tel: (0931)8342710, E-mail：hnxiangtao@https://www.360docs.net/doc/db17736194.html,
龚真莉, 等. 口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK–21细胞中的表达 455
血清型，是研究分子流行病学、毒株演化关系的主要基因。多年来，在FMD分子流行病学调查、疫源的追踪、毒株分型、基因工程苗的研制、诊断方法的建立等方面，P1基因均得到众多研究人员的关注[7,8]。2A蛋白为FMDV的非结构蛋白之一，为P1+2A间裂解提供识别序列，在病毒蛋白合成过程中，2A蛋白能促进核糖体对肽链（P1+2A）-tRNA 酯键的水解活性，从翻译的复合物中释放已合成的聚蛋白P1-2A[1]。本研究旨在利用pQE-Tri/P1+2A 真核表达重组质粒，在哺乳动物细胞BHK-21中高效表达口蹄疫病毒结构蛋白和部分非结构蛋白，获得高效、有反应活性的口蹄疫蛋白P1+2A，为研制诊断试剂及口蹄疫基因工程疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞)及FMDV各类抗血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室（以下称本室）提供。表达载体pQE-Trisystem、M15菌株及中量质粒提取试剂盒（DNA Midi Kit）购自QIAGEN公司；JM109菌株由本实验室保存；重组质粒pQE-Tri/P1+2A由作者构建[9]。转染试剂Lipofectamine 2000及Opti-MEM I Medium 购自Invitrogen公司。
1.2 高纯度重组质粒的获得及细胞转染
用中量质粒提取试剂盒提取阳性的重组菌质粒。提取的重组质粒浓度（OD260）应在0.1~1.0之间，纯度（OD260/OD280）应在1.5~2.0之间。在进行转染前，于分入细胞前每培养皿中放入1-2个严格灭菌的飞片，将细胞培养皿置于37℃ 5%CO2温箱中培养至贴于瓶底的细胞达到90%～95%左右满度，即可进行转染。DNA与转染试剂的配比应达到DNA(μg): Lipofectamine 2000=1:2～1:3。具体转染步骤参考转染试剂推荐方法进行。转染后将培养皿放入37℃ 5%CO2培养箱中培养18h～48h，用以检测目的基因的表达用。1.3 目的蛋白在细胞中表达的检测
1.3.1 间接免疫荧光抗体检测：分别用镊子小心取
出30h和48h的转染细胞飞片，同时取空白对照细胞飞片进行荧光染色。所用血清为FMDV阳性兔血清，血清按1: 800 PBS稀释；二抗为 FITC（山羊抗兔IgG 荧光二抗，1:40 PBS稀释）。
1.3.2 SDS-PAGE及Western-blotting检测：将转染后30h和48h的阳性细胞及对照细胞的上清吸出并收集，并将培养皿底部的细胞刮下收集。进行SDS-PAGE及Western-blotting检测。在Western- blotting检测时阳性血清为1:500倍稀释的豚鼠FMDV阳性血清，二抗为1:1000倍稀释的兔抗豚鼠IgG(二抗，没有标记)。
1.3.3 双抗体夹心ELISA检测：分别取转染30h和48h 的阳性细胞、阳性细胞上清、空白对照细胞样品及FMDV阳性抗原对照样品用于ELISA检测；酶标板用口蹄疫兔阳性血清包埋，一抗为口蹄疫豚鼠阳性抗血清，二抗为 HRP-兔抗豚鼠IgG。反应完成后在酶标仪(492nm紫外波长)下读取OD(optical density)值。
2 结果
2. 1 间接免疫荧光抗体检测结果
在转染后30h及48h分别取细胞飞片，在荧光显微镜下观察，发现转染重组质粒的细胞均有大量、明亮的荧光产生。细胞的原有形状没有发生变化，仍为典型长梭形，且荧光均出现在细胞质内，说明P1+2A蛋白在BHK-21细胞中成功表达。同时发现，转染后30h的荧光细胞在镜下相对数量较48h的多，但荧光的亮度没有多大区别，这也可能是细胞生长密度不同所导致的，但此结果可以证明转染后目的蛋白在30h左右就可达到蛋白的最高表达量。空白对照细胞没有荧光细胞产生（图1）。
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图1 免疫荧光抗体检测
Fig.1 Immunofluorescence Antibody Test
A: Cells at 30 hours past transfection; B: Cells at 48 hours past transfection; C: Blank cells control
收稿日期：2006-02-20，修回日期：2006-06-16
* 基金项目：国家863高技术研究发展计划（2003AA241110）
作者简介：龚真莉(1981-)，女，汉，甘肃皋兰人，硕士，主要从事动物微生物学和病毒分子生物学研究。
** 通讯作者：刘湘涛(1962-)，男，汉，湖南衡阳人，研究员，主要从事动物病毒学研究。
Corresponding author. Tel: (0931)8342710, E-mail：hnxiangtao@https://www.360docs.net/doc/db17736194.html,
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2.2 SDS-PAGE及Western-blotting检测结果
转染细胞经过SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果在约82kDa处出现了清晰的目的蛋白大小的条带，与预期大小相符，空白对照细胞没有在该位置出现条带（图1）。表达产物经SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上进行Western-blotting检测，表达产物能被口蹄疫阳性血清所识别，出现显色带，说明表达的外源蛋白具有良好的反应原性（图2）。
图2 表达产物SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression product.
1, Cells at 30 hours past transfection; 2, Blank cells comparison; 3, Cells at 48 hours past transfection; M, Protein molecular weight Marker.
图3 Western-blotting 检测
Fig.3 Western-blotting
1, Expression product; M, Protein molecular weight Marker.
2.3 夹心ELISA检测结果
结果显示，转染细胞与空白对照细胞及转染细胞上清相比，差异显著。与阳性抗原相比差异不显著。随着倍比稀释度的提高，转染细胞和阳性抗原对照的OD值同时逐渐降低，但转染细胞上清及阴性对照细胞的OD值变化不大。转染细胞上清液检测值很低，说明，口蹄疫蛋白P1+2A在BHK-21细胞中的表达在细胞质中，没有分泌到培养基上清液中。如表1
表1 夹心ELISA法检测BHK-21细胞中的目的蛋白表达情况
Table1 Expression of target protein in BHK-21 cells tested with sandwich-ELISA
Group undiluted
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Transfected 30h 1.456 1.456 1.180 0.910 0.694 0.513 0.382 cells 48h 1.574 1.528 1.332 1.013 0.889 0.774 0.416 Transfected 30h 0.313 0.190 0.158 0.145 0.135 0.132 0.133 cells
liquid 48h 0.345 0.217 0.176 0.157 0.138 0.131 0.132 Blank
cells 30h 0.530 0.634 0.675 0.614 0.462 0.322 0.226 comparison 48h 0.563 0.435 0.315 0.229 0.175 0.147 0.136 Positive
antigen 1.866 1.854 1.687 1.326 0.968 0.745 0.698
3 讨论
口蹄疫缺乏有效的治疗方法，发达国家成功扑灭的经验是扑杀销毁政策，但对目前大多数流行口蹄疫的发展中国家来说计划免疫和免疫监控仍是主要手段。传统的灭活疫苗存在着灭活不彻底以及防护不当而致病毒从生产车间散播的危险[5,6,10]。随着分子生物学技术的不断发展，以基因操作和抗原表达为核心内容的基因工程疫苗技术有望解决这一问题。目前已有外源基因在原核细胞中表达成功的例子，原核细胞的蛋白表达量高，成本低，制作工艺简单，但是许多在细菌中合成的外源蛋白的活性都比较低[11,12]。因此，发展在真核系统中表达外源基因就十分必要，利用真核表达载体表达产物的理化和生物学特性与天然产物相似，细胞培养简单，适合规模化生产。所以近年来越来越多的研究人员开始关注真核表达载体系统，并取得了理想的结果。
本实验利用此表达载体pQE-TriSystem构建了的口蹄疫病毒免疫基因P1+2A的真核表达重组质粒，成功在口蹄疫敏感细胞BHK-21中进行表达，并且蛋白的表达量较高，达到了SDS-PAGE可见水平。哺乳动物细胞表达技术与各种表达系统相比，有其独特的优越性，尤其是用于表达大的真核蛋白，主要优点有：①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因中的内含子，间接加工成成熟的mRNA，这是原核
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表达系统所不具备的。②哺乳动物细胞表达的蛋白质在翻译后被加工的机会较多，可提高产品正确构型的几率，加工后的蛋白免疫原性好。③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。适合于表达人类需用的珍贵而重要药物蛋白和安全、环保的人类及动物疾病疫苗[12]。口蹄疫是家畜的一类重要的传染病，是世界各国检疫和防疫的重点对象，其检测和预防具有十分重要的社会、经济和政治意义。所以本研究结果具有重大的现实意义，表达的蛋白适用于以下研究：(1)进行少量，小动物的免疫实验，初步检测其免疫保护力。
(2)可作为免疫诊断试剂用。(3)进行有构象活性的功能蛋白的纯化。(4)进行有关蛋白—蛋白和蛋白—DNA相互作用的分析。
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人巨细胞病毒
人巨细胞病毒 关键词：巨细胞内皮细胞北纳细胞网 巨细胞病毒(CMV)是一种可引起感染细胞肿大并出现巨大核内包涵体的病原体，自然界普遍存在，具有严格种属特异性，包括人、马、牛、猪、猫和鼠等CMV。感染人的巨细胞病毒称为人巨细胞病毒(HCMV)，也称为人疱疹病毒5型(HHV-5)。 一、临床意义 HCMV在全球普遍流行，各年龄均易感，感染率随年龄增长而升高，无季节性流行规律。感染来自患者的唾液、尿液、乳汁、泪液、粪便、阴道分泌物、血液及精液，包括先天性感染、围产期感染和后天性感染。先天性感染指母体HCMV 通过血液经胎盘感染胎儿，围产期感染指母体HCMV通过产道或乳汁感染新生儿，后天性感染通过呼吸道、消化道或输血、器官移植等途径感染HCMV。10％～15％HCMV先天性感染胎儿在妊娠期和新生儿期出现宫内生长迟缓、黄疸、肝脾肿大、皮疹、心肌炎、肺炎、中枢神经系统病变、耳聋及脉络膜视网膜炎等表现。围产期感染者出生3～12周开始分泌或者排泄病毒，通常无临床表现。性接触是HCMV 后天感染的重要途径。 大多数免疫功能正常者感染HCMV后无显著临床表现，少数出现EBV感染所致传染性单核细胞增多症的类似表现，包括持续2～3周的发热、乏力、非典型性淋巴细胞增多和轻症肝炎等。与其他人疱疹病毒一样，原发感染后HCMV会在宿主体内终身潜伏于内皮细胞、淋巴细胞以及多种组织细胞，当受到外界刺激，特别是免疫功能抑制时，潜伏的HCMV被激活开始复制。 二、生物学特性 HCMV病毒颗粒直径为120～200nm，有典型的疱疹病毒结构。最外层为病毒的脂质双层包膜，厚约10nm，现已知包膜含有至少10种病毒糖蛋白。包膜内为被膜，厚约50nm，含有至少14种病毒蛋白。被膜内为核衣壳，直径约100nm，由病毒壳体和包裹在内的病毒基因组组成。病毒壳体是由162个壳粒亚单位组成的对称20面体。最里面的基因组为线性双链DNA，长220～240kb，由长片段L 段和短片段s段连接而成，含约200个开放阅读框，分为立即早期基因IE、早期基因E和晚期基因L。晚期基因UL83编码的磷蛋白65(pp65)是病毒被膜内的最主要成分，占被膜蛋白致密颗粒95％，具有丝氢酸／苏氨酸蛋白激酶活性且高度保守。pp65表达与病毒复制呈明显的相关性，且在潜伏感染时表达量极低，
人类巨细胞病毒IgG
湖南省职业病防治院 作业指导书 标题：人类巨细胞病毒病毒（IgG）（酶联免疫法） 修改记录
湖南省职业病防治院作业指导书文件编号： 标题：人类巨细胞病毒IgG（酶联免疫法）版号：第 1 版页码1/2 1、目的 用于检测人体血清或血浆人类巨细胞病毒（IgG）. 2、范围 利用酶联免疫间接法原理（ELISA）定性检测人血清中的人类巨细胞病毒IgG 抗体，适用于人类巨细胞病毒病毒感染的辅助诊断。 3、职责 检测人员按照本规程进行检测操作。 4、原理 采用酶联免疫间接法原理定性检测人血清中的人类巨细胞病毒IgG抗体（HCMV-IgG），以纯化人类巨细胞病毒抗原包被酶联板。待检血清中的人类巨细胞病毒与包被抗原反应，再与酶标记鼠抗人IgG抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。加底物TMB显色，在酶标仪上比色后根据吸光度（A值）判定有无人类巨细胞病毒IgG抗体的存在。 5、样本要求 5.1仅限于检测人体血清或血浆。 5.2常规方法采集。 5.3血清：采血后，室温放置1-2小时，待血液凝固，再于3000转/分钟离心15分钟。 5.4血浆：采血后，样品与抗凝剂反复轻摇混匀，再3000转/分钟离心15分钟。 5.5如果样品没有在8小时内测定，应将其保存于2℃-8℃。如果样品不能在7天内测定，应将血清或血浆与血细胞分离， -20℃保存，避免反复冻融。 6．分析系统 6.1分析仪器：Thermo Mk3型酶标仪，检测波长450nm，参考波长630nm。 6.2 37℃恒温箱。 6.3 振荡器用于样品、试剂的混匀。 6.4 微量加样枪。 6.5 试剂准备： 试剂盒于冰箱保存，使用前应取出置37℃。 取试剂盒内洗涤液用蒸馏水作25倍稀释，置洗瓶中备用。 6.6 质控试剂：-20℃保存，溶解后随试剂一起冷藏，每天随样品一起检测并保存质控结果，每月一次质控小结，失控要有记录及纠正的结果。
八、检测口蹄疫病毒抗原的方法
八、检测口蹄疫病毒抗原的方法 （一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝） 红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。 1．试验材料 V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。 ２．试验方法 （１）稀释待检抗原取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。 （２）稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。 （３）稀释阳性抗原取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。 其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。经过上述稀释，各阳性抗原的稀释度依次为1：48、1：96、1：192和1：384。用于阳抗对照孔的只加第4管（1：384）的阳抗。（４）滴加待检抗原和对照抗原取第8管稀释的待检抗原（1：768）加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔，每孔50微升，取第7管待检抗原（1：384）加入1~5排的第7孔，取第6管待检抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均为50微升。1~5排的第10孔加入1：40的阴性抗原，每孔50微升。1-5排的第11孔依次加入O、A、C、 Asia-1型和SVD1：384稀释度的阳性抗原，每孔50微升（即第1排的第11孔加O型抗原；第2排的11孔加A型抗原；第3排的11孔加C型抗原；第4排的11孔加Asia –1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。1-5排的第12孔各加稀释液50微升作为稀释液对照。 （５）滴加反向被动血凝诊断液血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O 型诊断液，每孔25微升。第2排1~8孔和10~12孔加入A型诊断液，每孔25微升。第3排1~8孔和10~12孔加入C型诊断液，每孔25微升。第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型诊断液，每孔25微升。第5排1~8孔和10~12孔加
人巨细胞病毒与动脉粥样硬化相关性研究进展
人巨细胞病毒与动脉粥样硬化相关性研究进展 发表时间：2015-10-16T11:04:20.537Z 来源：《航空军医》2015年7期作者：李维维[导读] 河北大学临床医学院河北保定 071000 本文参阅大量国内外文献，就人巨细胞病毒（HCMV）与动脉粥样硬化（AS）的相关性研究进展进行综述。 河北大学临床医学院河北保定 071000 【摘要】动脉粥样硬化发病率逐年增高，且趋于年轻化，严重危害人类健康，但其机制尚不十分清楚，大量流行病学和实验室研究表明人巨细胞病毒感染在动脉粥样硬化发病中起重要作用，本文参阅大量国内外文献，就人巨细胞病毒（HCMV）与动脉粥样硬化（AS）的相关性研究进展进行综述。 【关键词】人巨细胞病毒；动脉粥样硬化；相关性动脉粥样硬化是严重危害人类，尤其是老年人健康的疾病之一，其致病机制一直备受关注，Fabrieant 等[1] 在1985年用鸟类疱疹病毒在火鸡体内诱发出冠状动脉粥样硬化斑，第一次证明HCMV与As之间存在密切关系，之后国内外许多学者的研究都表明H C M V感染在动脉粥样硬化发生中起着重要作用，本文就人巨细胞病毒与动脉粥样硬化相关性研究予以综述。 1.实验室检查与分子生物学证据 1.1 AS患者血清检测 许从峰等[2]对304例动脉硬化患者和164例非动脉硬化患者进行血清抗CMV的IgG抗体检测，结果显示动脉粥样硬化组血清中CMV的阳性率显著高于非动脉粥样硬化组（分别为82．2％和61．0％，P=0．02）。王凌燕等[3] 用ELISA方法对56例糖尿病合并冠心病（A组，及48例未合并冠心病组的（B组）血清人巨细胞病毒IgG、IgM 抗体进行检测，结果 A 组患者HCMV IgG、IgM 阳性率均明显高于B组。以上研究显示HCMV及其抗体在AS患者血清中含量显著高于正常人，表明HCMV可能在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用，1.2 AS患者动脉斑块检测 许从峰等[2] 对15例冠状动脉粥样硬化的组织标本和7例正常血管组织标本进行HCMV基因检测，显示结果动脉粥样硬化斑块中HCMV 基因出现率显著高于正常血管组织（13／15和2／7，P=0．O1），此实验证明AS患者动脉斑块中HCMV的含量较正常水平高，HCMV感染可促进动脉粥样硬化的发生与发展。 1.3 AS患者血管组织检测 陈瑞珍[4]等人利用原位杂交的方法检测了32例临床上AS患者的动脉血管组织以及32例患者的正常血管组织（22例取动脉，10例取大隐静脉）中HCMV DNA 序列，结果显示阳性分别为13／32及3／22，表明HCMV 感染与AS的发生有密切关系。而且HCMV DNA 主要见于内膜下平滑肌及中膜平滑肌．外膜组织及细胞外间质则少见，提示HCMV 感染血管组织后，在血管皮细胞核中增殖、复制，而后释放，自内膜逐渐向中膜肌层扩散。李心怡[5]等人对15例动脉粥样硬化患者的外周动脉标本，采用原位杂交及免疫组织化学染色的方法，定性及定位检测外周动脉中人巨细胞病毒核酸及抗原的表达情况，结果原位杂交结果为人巨细胞病毒核酸在15例动脉粥样硬化患者的外周动脉中均为阴性表达。免疫组织化学染色结果为人巨细胞病毒抗原pp65在15例标本中14例为阳性表达，1例为阴性表达；人巨细胞病毒抗原IE1 72在15例标本中为阴性表达。结论动脉粥样硬化动脉标本中存在人巨细胞病毒感染的证据2.流行病学证据 在80年代后期，Stanford大学医学院对301位心脏移植并使用大量免疫抑制剂患者进行研究发现，有91位患者发生HCMV感染，5年后，HCMV感染阳性组的患者有69％由于移植心脏加速出现了严重的冠状动脉粥样硬化而导致移植失败，而无非HCMV感染组中这一比例为27％[6]。美国Minnesota观察研究了102位接受心脏移植并接受大量免疫抑制剂的患者，移植术后2年有HCMV感染的患者有32％出现了冠状动脉粥样硬化，而无HCMV感染者的冠状动脉粥样硬化发生率仅为10％。这些研究都表明HCMV可增加发生冠状动脉粥样硬化的危险性。 综上可知，流行病学调查、实验室检查和分子生物学证据都表明人巨细胞病毒与动脉粥样硬化的发生存在着非常密切的关系，但HCMV导致AS发生发展的确切机制及影响因素有待进一步研究。参考文献： [1] Fabrieant CG，fabrican tJ，Litre nta M M，eta1.Journal of Experimental MediCine.1978，148：335-40. [2] 许从峰，陈瑞珍等.巨细胞病毒感染对动脉粥样硬化的影响[J].免疫学杂志，2003，19：451-53. [3] 王凌燕，吴金等.糖尿病合并冠状动脉粥样硬化血清抗人巨细胞病毒抗体检测[J]中国老年学杂志2002，3：225-26. [4] 陈瑞珍，李武，杨英珍.原位杂交检测人动脉粥样硬化斑块组织中人巨细胞病毒 D N A[J].中华医学杂志，1995，75：592-593. [5]李心怡，张宗泽等.人巨细胞病毒感染与动脉粥样硬化的相关性研究[J]山东医药，2002，52：73-73. [6]Grattan M，Moreno-Cabral C，Starnes V，et al.Cytomegalovirus infection is assosiated with cardiac allograft rejection and atherosclerosis [J].JAMA，1989，261（24）：3562-6
HIV病毒基因组
编码基因 病毒基因组是两条相同的正链RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb。两端是长末端重复序列（long terminal repeats, LTR），含顺式调控序列，控制前病毒的表达。已证明在LTR 有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列编码了至少9个蛋白，可分为三类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。 1．gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17， P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。 2．Pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。 3．env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。 4．TaT 基因编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。 5．Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列 （Cis-Acting repression sequance,Crs）去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。 6．Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。 7．Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。 8．VPU基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。 9．Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。 HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
65-人巨细胞病毒核酸检测标准操作程序
人巨细胞病毒核酸定量核酸检测标准操作规程 （荧光PCR法） 1.目的 规范人巨细胞病毒(HCMV)核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA分析。 2.应用范围 使用中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒(HCMV)核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）和PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、ABI Prism 7700等仪器进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA 检测。 3.职责 由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。4.内容 4.1 实验原理和临床应用 本品选取人巨细胞病毒珠（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp,利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。 本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者尿液、乳汁、血清或淋巴细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)感染的检测，用于人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控，不用于血源筛查。本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。 4.2标本采集 4.2.1 使用标本类型：尿液、乳汁、血清和淋巴细胞 4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。 4.2.2.1 尿或乳汁：取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中，离心取沉淀即为标本。标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。 4.2.2.2 血清：用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml,注入无菌1.5mlEppendoff管，4℃静置过夜。吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5mlEppendoff管中，即为血清标本。标本可立即用于测试（48小时以内），也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
病毒载体
基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件： 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 2、介导外源基因的转移和表达； 3、对机体不致病。 然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。 基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。 然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型： 重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。
口蹄疫病毒抗原
口蹄疫病毒抗原ELISA、病毒分離及RT-PCR敏感性之比較 報告人：黃郁珳 助理研究員（豬瘟研究組） 壹、緒言 口蹄疫(Foot and mouth disease；FMD)是一種急性偶蹄類動物傳染病，會造成嚴重之經濟損失。口蹄疫病毒(FMDV)是屬於正股單鏈RNA病毒，歸類於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)、口瘡病毒屬(Aphthovirus)。FMDV共有O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等㈦種血清型，各血清型病毒間無交叉免疫保護作用。而口蹄疫的實驗室診斷以抗原鑑定為主，目前本所使用的口蹄疫抗原鑑定方法包括病毒分離(Virus isolation)、抗原-酵素結合免疫吸附試驗(antigen enzyme-linked immunosorbent assay；Antigen-ELISA)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction；RT-PCR)等。病毒分離是根據世界動物衛生組織（O.I.E）出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」中口蹄疫的抗原診斷方法進行，以單層BHK21及EBK等㈱化細胞分離試材中的口蹄疫病毒。而抗原-酵素結合免疫吸附試驗則是利用抗原抗體間專一性鍵結的特性，檢測所稀釋試材中的口蹄疫病毒抗原，且鑑定其血清型別。反轉錄聚合酶連鎖反應是利用一對方向相反的寡核苷酸引子，先利用反轉錄酶將待測RNA轉錄成cDNA，再經由DNA聚合酶的作用，反覆進行變性作用、煉合作用及延展作用等三步驟，而將特定的DNA片段大量複製，從而提升檢測病毒核酸之敏感性達百萬倍之多。由於口蹄疫疫情的控制，首重快速而準確的診斷。本所目前使用的三種口蹄疫診斷技術均是世界動物衛生組織（O.I.E）出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」中所列舉之檢測方法，但是該手冊中並未針對其敏感性詳加描述，然而，在初步的診斷結果中，敏感性與診斷的準確度相關，若敏感性太低，將造成假陰性的診斷結果。因此，為了解此三種口蹄疫診斷技術之敏感性，乃進行此一實驗。 貳、材料與方法 本實驗，我們選擇一㈱源自細胞培養的口蹄疫病毒及一㈱口蹄疫病毒感染的水疱上皮組織10倍乳劑，分別以含2%胎牛血清之細胞培養液，進行10倍連續稀釋至10-8，再分別進行病毒力價回歸試驗、病毒分離、抗原-酵素結合免疫吸附試驗及反轉錄聚合酶連鎖反應等檢測。 一、病毒力價回歸試驗 將各稀釋階之病毒及BHK 21㈱化細胞同時加入96孔平底細胞培養盤，置於37℃含5% CO2之細胞培養箱中培養兩天，再以顯微鏡觀察細胞病變作用(CPE)產生情形，紀錄各稀釋階病毒所產生之CPE數目，再依據Reed 及Muench方法，計算病毒力價。
三种病毒转染的异同点
三种病毒转染的异同点 一、病毒表达系统简介 病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是目前最常用的基因导入方式之一。通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源目的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。病毒进而侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体表达。 病毒的基因组可分为编码区和非编码区。其中，编码区包含病毒的必需基因和非必需基因，可分别表达产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；非编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作用元件。 由于野生型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使用的病毒恢复成野生型，必须对病毒载体进行一系列的遗传改造。譬如删除病毒基因组的非必需区，将顺式作用元件和反式作用元件分开连接至不同的载体上，或结合利用不同种病毒的必需蛋白等，最大程度地保证实验的安全性。 哺乳动物病毒表达系统常常包含一到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因子的作用下，病毒复制、包装所需的顺式作用元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产生带有外源基因的病毒颗粒。经浓缩和纯化后的病毒液即可用于侵染目标宿主细胞或动物体，实现外源目的基因在宿主体的表达。 二、病毒表达系统的优势 病毒的转导效率比常规真核表达载体高很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。 三、辉骏生物病毒服务简介 辉骏生物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项目包括：各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建立等。 慢病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。 图1 慢病毒感染宿主细胞原理图 ..
口蹄疫病毒
口蹄疫病毒 最新2014年秋冬季口蹄疫病毒 （一）口蹄疫的流行形势又发生了变化 以缅甸98毒株（O/Mya98）（耿马97（GM）与缅甸98（Mya98）二者属于同一遗传谱系，但属于不同的进化分支，国际上称其为Mya98毒株。）为主的O型口蹄疫的流行还未减弱，又从境外传入了东南亚97毒株（A/Sea-97/G2）A型口蹄疫的流行，同时也有泛亚O 型口蹄疫发病的报道。缅甸98毒株的O型口蹄疫是继1999年之后，时隔10余年，我国再次向OIE报告疫情。被联合国粮农组织称为亚洲50年来最严重的一次大流行。影响力大，猪、牛、羊多种动物发病。 O型口蹄疫缅甸98（MY A）谱系病毒致病性：异常凶猛。病例:2010年5月，某地发生猪O型口蹄疫疫情，起因于一餐厅老板购进猪苗发病，该猪以前只免疫过一次疫苗（不是缅甸98（MYA）谱系病毒苗），起初只是右后肢跛行，未能确诊是口蹄疫，3～4 d后，同群3～4头猪发病，并引发当地发病，结果导致当地50%母猪死亡，2月龄以内仔猪死亡率100%，3月龄以上猪死亡率10%；流行特点表现为：发病急，死亡大，症状明显，3 d以上多以死亡告终；猪的蹄部肿的很厉害，有的似牛蹄大，水疱的直径很大。 东南亚97毒株（A/Sea-97/G2）A型口蹄疫在2012—2013年就在中亚和东亚流行。2012年10在泰国有确诊2013年2月28日，广东茂名市，猪感染。2013年3月1日，俄罗斯东南近中国边界，牛感染。2014 年6月30日，江苏省宿迁市泗洪县，猪感染。基因分析资料显示，正在快速扩散，对欧洲形成威胁。 全世界A型口蹄疫的流行范围和毒株复杂程度仅次于O型口蹄疫，而其致病性和抗原变异性则普遍强于O型。从遗传关系分类，全世界A型口蹄疫病毒可以分为3个大的遗传拓扑型，即Eu-SA型（欧洲-南美型）、Asial型（亚洲型）和Afri型（非洲型），每个型又包含有多个遗传谱系的毒株。 （二）病毒出现了跨种间传播 与以往不同，在自然流行过程中，A型口蹄疫病毒主要引起牛、羊感染和发病，猪的病例极少；然而本次流行的A/Sea-97/G2毒株对牛、猪都有致病性，并都有临床发病的报道，且猪有发病增多的趋势，在牛上，毒力高于2009年湖北武汉A型流行毒（A/Sea-97/G1株）约10倍之多。 2014年秋冬季口蹄疫病毒防治方案 发生口蹄疫的重疫区： 1. 尽早注射（口蹄一针灵），越早越好，病毒控制在潜伏期，提高猪群免疫力. 2. 已感染猪群（口蹄一针灵）注射两天，4-5天结痂脱落后完全恢复正常，可解除隔离。 3. 对感染后恢复的弱仔群体，每天加强消毒，五天后注射（口蹄一针灵）再加强一针，防止再次感 若刚起水泡，水泡没有破裂，只需用天行健动物药业的口蹄一针灵注射一次，水泡即可干瘪消失。若口鼻、蹄子周围的水泡已破溃，流血，甚至蹄壳已脱落，需用口蹄一针灵注射两次，同时防止心肌炎的继发。水泡破溃处可结痂。结痂脱落后完全恢复正常。
【免费下载】 习题-第四章病毒基因组
第四章病毒基因组 一、A型题： 1. 只含小分子量RNA而不含蛋白质的病毒称（） A. 类病毒（Viroids） B. 卫星（Satellites） C. 类病毒（viroid） D. 朊病毒（Prions） E. 拟病毒（virusoid） 2. 只含蛋白质而不含核酸的的病毒称（） A. 类病毒（Viroids） B. 卫星（Satellites） C. 类病毒（viroid） D. 朊病毒（Prions） E. 拟病毒（virusoid） 3. RNA病毒基因组的帽子结构与第二个核苷酸相连的化学键（） A. 5＇，5＇-三磷酸二酯键 B. 3＇，3＇-三磷酸二酯键 C. 5＇，5＇-磷酸二酯键 D. 3＇，5＇-磷酸二酯键 E. 以上都不是 4. HBV基因组是（） A. 完全双链DNA分子 B. 不完全双链DNA分子 C. 完全双链RNA分子 D. 不完全双链RNA分子 E. 单链DNA分子 5. 具mRNA模板活性的病毒基因组是（） A. 正链DNA病毒 B. 负链DNA病毒 C. 负链RNA病毒 D. 逆转录科的正链RNA病毒 E. 正链RNA病毒（逆转录科的正链RNA 病毒除外） 6. 关于逆转录病毒叙述不正确的是（） A. 迄今发现的RNA肿瘤病毒均属RNA逆转录病毒 B. 嗜肝DNA病毒科属DNA逆转录病毒。 C. 逆转录病毒RNA为正链 D. 病毒颗粒均携带逆转录酶 E. 前病毒DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA中 7. 逆转录病毒基因组的结构特点不包括（） A. 5＇端帽子结构 B. 3＇端poly(A)尾 C. 两端各有一个长末端重复序列（LTR） D. 编码逆转录酶 E. 神经酰胺酶 8. 分段基因组（segmented genome）是指病毒基因组（） A. 由数条不同的核酸分子组成 B. 由数条相同的核酸分子组成 C. 由数条互补的核酸分子组成 D. 由可分成不同功能区段的一个核酸 分子组成 E. 以上都不对 9. HBV基因组序列的利用率（编码基因效
口蹄疫病毒
（一）综述 口蹄疫病毒引起偶蹄兽的一种急性、热性和高度接触性传染病。特征为口腔粘膜、鼻吻部、蹄部及乳房皮肤发生水泡和糜烂，严重时蹄壳脱落，跛行、不能站立。口蹄疫的发病率很高，传染快，流行面积大，对仔猪可引起大批死亡。成畜死亡率不高。 本病主要通过消化道、呼吸道以及皮肤和粘膜感染、人工输精等直接或间接传播。另外,鸟类、鼠类、昆虫等也能机械性传播而发病。病猪和待毒猪是最主要的直接传染源；病猪的粪、尿、乳、呼出的气、唾液、污染的精液、肉、毛、内脏等,以及污染的猪舍、饲料、水、饲养工具都可有病毒存活，成为间接传染源。牛、羊、猪、驼可互相传染，但也有牛羊感染而猪不感染；也有猪感染而牛羊不感染的情况。 一年四季均可发生，但以冬春季、春秋季多发，多在秋季开始，冬季加剧，春节减缓。发病方式有蔓延式和跳跃式两种，还有呈2～3年一次的周期性流行。（二）临症 潜伏期短，高热（40～410C），食欲、精神不振。 蹄冠、蹄叉、蹄踵等部位发红、发热、敏感，后在病猪的口腔、齿龈、舌面、鼻镜、乳房也可见米粒大的水泡或融合呈大水泡和糜烂斑。水泡内的液体初期呈淡黄色，以后变成粉红色。水泡自行破裂后形成鲜红色烂斑，表面渗出一层淡黄色渗出物，干燥后形成黄色痂皮。如无感染，1周左右结痂痊愈；有感染的糜烂、溃疡，严重时蹄壳脱落，常卧地，跛行。 多取良性经过，大猪很少死亡。初生仔猪常因急性心肌炎和急性胃肠炎而突然死亡。病死率可达60～80%。在临床上与猪水庖病（病源为猪水疱病病毒）、猪水疱（病源为猪水疱性疹病毒）、猪水疱性口炎（病源为猪水疱性口炎病毒）、猪痘（病源为猪痘病毒、痘苗病毒）难以区别。 （三）病理 蹄部、口腔、鼻端、乳房等水泡、溃疡、烂斑。 咽喉、气管、支气管也有烂斑和溃疡，小肠、大肠出血性炎症。 仔猪心包膜弥漫性出血，心肌切面淡黄相间似虎纹，俗称“虎斑心”。 （四）防治 预防： 1. 平时注意加强检疫，严密监视疫情动态； 2. 不从疫区进猪与其它易感动物的畜产品；病愈之后仍然带毒和排毒（尿排），一般可超过150天。 3.疫区与受威胁区域定期注射疫苗接种。口蹄疫病毒共分七个血清型：A、C、O、南非一、二、三型（分别称为SAT1、SAT2、SAT3型）和亚洲Ι型。每个型下面又分亚型,巳知有80个以上亚型。我国的病毒型为A、C、O和亚洲Ι型。各型之间无交叉免疫，即各型之间不能相互免疫。无论猪、牛、羊、驼都是这七个血清型。是甚么型引起的必需用该型苗才能起免疫作用。所以注前要诊断清楚病毒类型。但己病的不能打。注普通苗时如发生过敏反应，要急时注射肾上腺素1ml进行抢救。最好注多肽苗。 4.加强饲养管理，改善环境卫生，增强畜群的抵抗力。 5.发现疫情后应及时上报疫请；瞒报要遭罚款。
抗病毒基因MxA在鸡体内的表达
抗病毒基因MxA在鸡体内的表达* 何湃1，刘莉2，3**，张焕相1，采克俊2，3，张易祥2，3，董顺利2 （1.苏州大学生命科学学院，江苏苏州215006； 2.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州313000； 3.湖州师范学院细胞工程研究所，浙江湖州313000） 摘要：大量提取人抗病毒基因MxA的重组质粒pEGFP-C1-MxA，肌肉多点注射未成年广西土鸡，RT-PCR及免疫组化方法检测MxA基因在鸡体内各组织的分布表达。 采用RT-PCR方法于注射后5d、10d在呼吸道上皮、脾脏、肌肉组织中均可检出MxA基 因的转录；采用免疫组化方法检测到GFP和MxA基因均能在肌肉组织中得到表达，且注 射5d后的表达量高于注射10d后。结果表明重组质粒肌肉多点注射可介导MxA在鸡体 内多种组织中转录、表达，为进一步探讨MxA的生物学活性以及禽类抗病毒免疫制剂的 研发奠定了基础。 关键词：体内表达；MxA基因；肌肉多点注射 Expression of Anti-virus Gene MxA in Chicken in Vivo* HE Pai1，LIU Li2，3**，ZHANG Huanxiang1，CAI Kejun2，3，ZHANG Yixiang2，3，DONG Shunli2 （1.School of Life Science and Technology，Suzhou University，Suzhou，Jiangsu215006； 2.School of Life Sciences，Huzhou Teachers College，Huzhou，Zhejiang313000； 3.Cell Engineering Institute，Huzhou Teachers College，Huzhou，Zhejiang313000） Abstract：Recombinant plasmid pEGFP-C1-MxA which contains the human anti-virus gene MxA was firstly large scale extracted and subsequently multi-point injected into the femoral muscle of Guangxi indigenous chicken.After injection，RT-PCR and immunohistochemistry was performed to detect the expression and distribution of MxA gene in different tissues.The transcription of MxA gene could be detected in the tissues of spleen，respiratory tract epithelium and muscle at5and10days after injection by the method of RT-PCR.Immunohistochemistry results also indicated the expression of both report gene GFP and target gene MxA，and the expression level in muscle tissue of5d after injection was relatively higher than that of10d after injection.The results that the transcription and expression of MxA gene mediated by the muscle multi-point injection of recombinant plasmid will establish the foundation for the further understanding bioactivity of the MxA gene and anti-virus immune preparation in avian. Key words：In vivo expression；MxA gene；muscle multi-point injection 收稿日期：2007-12-11 修回日期：2008-04-15 *基金项目：国家自然科学基金项目（30500270）， 浙江省科技计划重点项目（2005C22052），浙江省自然科 学基金项目（Y304194） **通讯作者，E-mail：liuli6655@https://www.360docs.net/doc/db17736194.html,
口蹄疫的诊断及防治方法
口蹄疫的诊断及防治方法 前言 口蹄疫病毒(foot and mouth disease，FMDV)作为人畜共患的急性接触性传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。在国际贸易日趋繁荣、物资交流和旅游活动日益便捷的情况下，很多国家都有可能再度遭到口蹄疫的侵袭。口蹄疫严重危害畜牧业的发展，给牧区造成严重的经济损失，也可使对外贸易和旅游业遭受惨重损失。全世界每年由此造成的经济损失可达数百亿美元，口蹄疫的暴发已经影响到国际关系、国家名誉和经济发展，在某些流行过程中病毒还可发生变异，也给防控和消灭口蹄疫带来困难。 【摘要】由口蹄疫病毒引起的偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病。本病传染性极强，发病率几乎达100%，往往造成广泛流行，引起巨大的经济损失和社会影响。了解其病毒的本质和流行规律、病源及传播方式、临床诊断的表现及防治措施等对该病的控制有现实意义。本文对其国内外的研究做一综述，为口蹄疫的防治工作提供基础依据。 【关键词】口蹄疫流行诊断防治 【正文】 1.口蹄疫(FMDV)的简介 口蹄疫病毒(FMDV)属微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，有个血清型和65个以上的亚型。是引起多种动物发生口蹄疫的病原。 1.1病毒特性 病毒颗粒呈球形，二十面体对称，无囊膜，核酸类型为单股正链RNA，核酸分子量2.4～2.8-l×106d，长2.62um，呈细丝状，有感染性，并能起而RNA作用。病毒在胞浆内增殖。 FMDV具有四种主要多肽，即VP1、VP2、VP3、VP4。 FMDV在血清学上分为7个型，即A、O、C、SAT，(南非1型)、SAT2(南非2型)、SAT3(南非3型)和AsiaⅠ(亚洲1型)，每一型又有许多亚型。目前7个型至少可分为65个亚型，其中A型有32个，O型有11个，C型有5个，SAT1有7个，SAT2有3个，SAT3有4个，Asia I有3个。各型间无交叉免疫原性，在同型内的亚型间有部分交叉免疫原性。病毒型和亚型的鉴定主要根据抗原差异，不同型之间完全没有抗原关系，可用各型标准血清来鉴定病毒型。 1.2抵抗力 病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂有抵抗力，不耐酸，在pH6.5、4℃条件下每14h灭活90%，在pH5.5、1min灭活90%，在pH5.0、ls灭活90%,pH3.0时瞬时失活。在pH7.0～7.5十分稳定。肉品酸化处埋可杀灭病毒，但骨髓、脂肪、淋巴结等产酸甚少，其中病毒可存活1年以上。 病毒对酚类、酒精等消毒剂抵抗力较强，但对碱类消毒剂极敏感。1～2%氢氧化钠或氢氧化钾、30%草木灰、4%碳酸钠、1～2%甲醛可用于环境消毒。 病毒在低温下可长期保存，在冰冻情况下，骨髓中病毒能存活70d，血中病毒能存活4-5个月，肉中病毒能存活30～40d。 盐水具有保护病毒作用，感染组织长期保存于此液中不会丧失毒力，尤其在低温，如水泡皮保存于50%甘油中。－50℃下可保毒360-470d。 紫外线能杀灭病毒，但仍保持其抗原性和吸附细胞的能力。直接阳光照射