青藤碱对巨噬细胞吞噬能力的影响及机制探讨

青藤碱对巨噬细胞吞噬能力的影响及机制探讨

作者：邹同祥， 张翼冠， 张海港， Zou Tongxiang， Zhang Yiguan， Zhang Haigang

作者单位：邹同祥,Zou Tongxiang(第三军医大学药学院新药研究中心,重庆,400038;湖南省新化县人民医院,新化417600)， 张翼冠,Zhang Yiguan(四川省中医药科学院,成都,610041)， 张海港

,Zhang Haigang(第三军医大学药学院新药研究中心,重庆,400038)

刊名：

中药药理与临床

英文刊名：PHARMACOLOGY AND CLINICS OF CHINESE MATERIA MEDICA

年，卷(期)：2008，24(6)

被引用次数：1次

参考文献(10条)

1.李乐.张彩玲.宋必卫青麒碱的药理研究与临床应[期刊论文]-中药新药与临床药理 2006(07)

2.Doherty NS.Poubelle P.Borgeat P Intraperitoneal injection of zymosan in mice induces

pain,inflammation and the synthesis of peptidoleukotrienes and prostaglandin E2 1985(05)

3.Van der Ploeg J R.Giertsen E.Lǜdin B Quantitative detection of Porphyromonas gingivalis fimA gcnotypes in dental plaque 2004(01)

4.Tangirala RK.Rubin W Quantitation of atherosclerosis in murine models:correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta,and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice 1995(11)

5.黄坚.覃华丽.黄显凯CRH对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响[期刊论文]-创伤外科杂志 2006(01)

6.Stout RD.Suttlas J Functional plasticity of macrophages:reversible adaptation to changing microenvironments 2004(03)

7.Stout RD.Suttles J Immunosenescence and macrophage functional plasticity:dysregulation of macrophage function by age-associated microenvironmental changes 2005(01)

8.Bone RC Sepsis,sepsis syndrome,and the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) 1995(02)

9.梁瑞燕.曹柳英.王文君青藤碱抗炎作用机理研究[期刊论文]-广州中医药大学学报 2007(02)

10.杨德森.刘芳.曾繁典青藤碱对佐剂性关节炎大鼠血清及关节液细胞因子的影响[期刊论文]-中国现代应用药学2006(04)

相似文献(10条)

1.学位论文林永明青藤碱对THP-1细胞增殖、凋亡及其细胞因子基因表达的影响2006

背景：

类风湿关节炎是一种常见的自身免疫性关节炎症疾病，其主要的病理改变是巨噬细胞和淋巴细胞浸润，滑膜成纤维细胞增殖，关节骨质破坏。类风湿关节炎的病因目前尚不清楚。目前认为宿主的遗传易感性以及由此引起的持久的免疫反应是其主要的发病原因。类风湿关节炎可以影响全身任何覆盖有软骨和滑膜的骨关节。单核/巨噬细胞在类风湿关节炎的发病过程中起着重要的作用。单核/巨噬细胞不仅仅能够产生很多前炎症细胞因子和化学因子，而且它可通过很多机制引起类风湿关节炎的软骨和骨的损伤。

类风湿关节炎属祖国传统医学“痹病”范畴。痹病是由于风、寒、热、湿等因素引起的以疼痛，关节、肌腱、肌肉僵直为主要表现的临床病症。感受的外因的不同决定了临床证候特点和药物的治疗。“风气盛者为行痹”，行痹以关节疼痛游走不定，关节活动受限，发热恶风，舌质淡苔薄白，脉浮为主要特点。“寒气盛者为痛痹”，痛痹以疼痛剧烈，痛处固定，遇寒加重，得温痛减，舌质淡苔白脉弦紧为主要特点。“湿气盛者为着痹”，着痹以关节肌肉疼痛肿胀、重着，舌质白苔厚腻脉濡缓为主要特点。热痹可由上述三种证型发展而来，热痹以关节红、肿、热、痛，遇热加重，得温痛减，兼见发热、口渴，舌质红，苔干黄，脉滑数为主要特点。

中药青风藤治疗类风湿关节炎已经有两千年的历史。青藤碱是青风藤的生物碱单体提取物。过去的研究表明，青藤碱有广泛的药理学效应，包括

：抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛和抗心律失常等。青藤碱通过抑制单核/巨噬细胞分泌的炎症介质如前列腺素E2，白细胞三烯和—氧化氮等达到抗炎的作用。并且，青藤碱可以有效抑制体外淋巴细胞的增殖，改善大鼠佐剂关节炎和抗炎诱导的关节炎。临床研究已经表明青藤碱对类风湿关节炎患者的治疗效果确切。尽管青藤碱有着广泛的生物学活性，但是对其免疫抑制的机制研究十分有限。本文就青藤碱对人单核/巨噬细胞株——THP-1细胞的增殖、凋亡和细胞因子基因表达的影响做了深入的探讨。

目的：

1.探讨青藤碱对人单核/巨噬细胞株——THP-1细胞增殖、凋亡的影响；

2.探讨青藤碱对人单核/巨噬细胞株——THP-1细胞中细胞因子IL-1，IL-6基因表达的影响；

3.阐明青藤碱免疫抑制的机理及其治疗类风湿关节炎的作用靶点。

2.实验分四组：青藤碱高剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱低剂量组、空白对照组，培养液中青藤碱的终浓度分别为：0.3mmol/L、0.15mmol/L、0.075mmol/L；

3.应用四唑盐比色法分析青藤碱对THP-1细胞增殖的影响；

4.采用碘化丙啶染色流式细胞检测青藤碱对THP-1细胞凋亡的影响；

5.采用吖啶橙/溴已锭染色荧光显微镜观察青藤碱对THP-1细胞凋亡的影响；

6.半定量逆转录聚合酶链式反应检测青藤碱对THP-1细胞IL-1，IL-6基因表达的影响；

7.统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，结果以X±S表示，多组间均数比较采用Oneway-ANOVA，组间两两比较采用LSD检验

，P＜0.05为显著性差异。

结果：

1.青藤碱对THP-1细胞增殖影响的测定

MTT法检测细胞增殖率检测结果提示，与对照组相比，高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＜0.05)剂量组OD值均有所减低，差异有统计学意义；与低剂量组相比，高剂量组OD值降低有统计学意义(P＜0.01)，而中剂量组OD值降低无明显统计学意义(P＞0.05)，说明SIN可有效抑制THP-1细胞的增殖，抑制其增殖的效果与浓度呈依赖性。

2.青藤碱对THP-1细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测青藤碱对THP-1细胞凋亡结果提示，与对照组相比，高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＜0.05)剂量组凋亡率均有所增高，差异有统计学意义；与低剂量组相比，高剂量组凋亡率增高有统计学意义(P＜0.01)，而中剂量组凋亡率降低无明显统计学意义(P＞0.05)，说明青藤碱可有效增加THP-1细胞的凋亡，促进其凋亡的效果与浓度呈依赖性。

3.吖啶橙/溴已锭荧光染色法检测细胞凋亡率

镜下观察可见空白对照组细胞几乎所有细胞形态正常，核染色质着绿色；SIN低剂量组细胞可见少数细胞核着绿色呈固缩状，并有少数细胞膜不完整，EB透过后呈橘红色；SIN中剂量组可见胞膜损伤后被EB染色呈橘红色的细胞增多，并可见个别死亡细胞；SIN高剂量组可见较多细胞核染色质呈橘红色，并且死亡细胞增多。凋亡细胞计数显示，空白对照组及SIN高、中、低剂量组细胞凋亡率分别为：1％、17.5％、9％、3.5％。

4.青藤碱对THP-1细胞的IL-1基因表达的影响

IL-1基因及β-actin扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在预期位置出现相应条带。IL-1/β-actinPCR扩增产物的比值结果显示：与对照组相比，青藤碱高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＜0.01)剂量组IL-1基因表达均有所减低，差异有统计学意义；与低剂量组相比，青藤碱高(P＜0.01)、中

(P＜0.05)剂量组IL-1基因表达均有所降低，差异有统计学意义，说明SIN可有效抑制THP-1细胞的IL-1基因表达增殖，抑制IL-1基因表达的效果与浓度呈依赖性。

5.青藤碱对THP-1细胞的IL-6基因表达的影响

IL-6基因及β-actin扩增片段经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在预期位置出现相应条带。IL-6/β-actinPCR扩增产物的比值结果显示：与对照组相比，青藤碱高(P＜0.01)、中(P＜0.01)、低(P＞0.05)剂量组IL-6基因表达均有所降低，高、中剂量组差异有统计学意义；与低剂量组相比，青藤碱高

(P＜0.01)、中(P＜0.01)剂量组IL-6基因表达均有所降低，差异有统计学意义，说明SIN可有效抑制THP-1细胞的IL-6基因表达，抑制IL-6基因表达的效果与浓度呈依赖性。

结论

1.青藤碱可以抑制THP-1细胞的增殖，促进其凋亡；

2.青藤碱可以抑制THP-1细胞IL-1、IL-6基因表达；

3.青藤碱免疫抑制以及治疗类风湿关节炎的作用与抑制单核/巨噬细胞的免疫功能有关。

2.学位论文易丹丹青藤碱凝胶剂的研制及对大鼠佐剂性关节炎作用研究2002

第一部分青藤碱凝胶剂的研制及质量考察; 目的:筛选青藤碱凝胶剂最佳处方和制备工艺,并对其质量进行初步考察.方法:以卡波姆为基质制备青藤碱凝胶剂,选用L9(3<'4>)正交设计表优选处方.采用高效液相色谱(HPLC)法测定凝胶中青藤碱含量.按筛选出的最佳处方制备青藤碱凝胶,并对制剂的外观、含量、稳定性进行考察. 结论:该处方设计合理,制备工艺简单可行,质量稳定,检测方法可靠.第二部分青藤碱凝胶剂体外透度吸收研究; 目的:考察不同浓度氮酮对青藤碱凝胶透皮吸收的影响,进一步为青藤碱凝胶剂的处方筛选提供依据.方法:配制含不同浓度氮酮的青藤碱凝胶,采用透皮扩散装置进行离体鼠皮体外透皮吸收实验,用高效液相色谱(HPLC)法测定接收液中青藤碱的含量.结论:选择2.0﹪氮酮作为青藤碱凝胶剂的促透剂.第三部分青藤碱凝胶对大鼠佐剂性关节炎作用研究;目的:研究青藤碱凝胶对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及作用机制.方法:用Freund's完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎(adjuvantarthritis,AA),经皮给药,观察青藤碱凝胶对大鼠双侧后足跖肿胀度,脾淋巴细胞增殖反应,腹腔巨噬细胞产生白细胞介素-1(IL-1)的活性,以及血液流变学的影响.结论:外用青藤碱凝胶有抗大鼠佐剂性关节炎作用,其作用机制可能与其免疫抑制及改善血液流变性等有关.

3.会议论文李晓娟.王培训.刘良.周联.王文君.梁瑞燕.曹柳英青藤碱对J774巨噬细胞株炎症性细胞因子与炎症介

质合成及基因表达的影响2001

本文选择具有正常巨噬细胞显著特征的J774巨噬细胞株,观察青藤碱对其生长及炎症介质基因表达及生物合成的影响.

4.学位论文何小波青藤碱对巨噬细胞的凋亡诱导效应及其相关机制研究2004

中药在中国应用于临床治疗已有几千年的历史,但是对中药的药理作用和作用机理的研究上,以往多限于中药的表观、生长习性来解释药性(取象比性)和经验型用药.如果不从现代医学的角度阐释中药的药理作用,必将阻碍中药的推广和药理作用的进一步研究.近些年,随着中药提取和纯化的工艺的提高,中药中核心物质得以提纯,给中药的科学研究提供了物质基础,从而为中药研究提供了一个新的角度.我们的研究表明,青藤碱之所以能以时间和剂量依赖性的方式抑制巨噬细胞的增殖,在于它可以以同样的方式诱导巨噬细胞的凋亡.我们首次发现ERK活化可能是青藤碱抑制巨噬细胞增殖和诱导巨噬细胞凋亡的原因之一,此外,p27、Bax的活化和Bcl-2的抑制也可能参与了青藤碱诱导的巨噬细胞凋亡过程.我们的研究结果对于阐明青藤碱在治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病,发挥免疫抑制效应的作用机理上提出了新的观点.

5.期刊论文王勇.方勇飞.周新.钟兵.罗中华青藤碱对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞表达细胞因子的影响-中华

风湿病学杂志2003,7(7)

目的观察不同剂量的青藤碱体外作用对佐剂性关节炎(AA)大鼠腹腔巨噬细胞核因子-κB (NF-κB)活性及肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA、白细胞介素(IL)-1β mRNA、IL-10 mRNA的影响,以阐明该药抗炎和抗风湿的可能机制.方法以佐剂性关节炎大鼠为模型,收集腹腔巨噬细胞,电泳迁移率改变分析法(EMSA) 测NF-κB活性,反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)测TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-10 mRNA的表达.结果佐剂性关节炎后腹腔巨噬细胞内NF-κB活性与TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-10 mRNA的表达与正常对照相比均显著升高(P＜0.05),青藤碱在一定的浓度范围内抑制NF-κB活性与TNF-α mRNA 、IL-1β mRNA、IL-10 mRNA的表达.腹腔巨噬细胞NF-κB的变化趋势与TNF-α mRNA 、IL-1β mRNA、IL-10 mRNA的表达呈正相关.结论青藤碱通过下调NF-κB活性而降低腹腔巨噬细胞内TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表达.

6.学位论文靳小石中药预防大鼠小肠移植慢性排斥反应的实验研究2007

第一部分:大鼠小肠移植模型的建立和鉴定

目的：建立大鼠小肠移植模型并研究排斥反应机理。

方法：利用显微外科技术构建同系和异系大鼠小肠移植模型，分为3组：同系移植组、异系移植组、异系移植使用CsA组 (环孢素组)。分别在术后

7天、14天、28天、60天进行移植物活检，常规病理学检测，应用 Realtime-PCR 技术检测移植物内IL-4、INF-γ分子 mRNA 转录水平以观察急性排斥反应，采用免疫组织化学方法检测 C1368以观察单核巨噬细胞浸润情况，使用 Realtime-PCR 技术和 Western blot技术检测移植物内TGF β1、PDGF mRNA 转录水平及蛋白表达水平，并应用免疫组化方法对上述两种蛋白的表达进行定位，以明确其与排斥反应的关系。

。(4)CD68检测提示在术后第60 天环孢素组较同期的同系移植组显著升高。(5)环孢素组的 TGF-B1 及 PDGFmRNA 转录水平和蛋白表达水平在第60天也较同期的同系移植组显著升高，免疫组化可见 TGF-β1及PDGF在间质内高表达，表明环孢素组术后第60天开始出现慢性排斥反应，并同时伴有TGF-β1及PDGF分子的表达水平升高。

结论：(1)移植术后的早期存在急性排斥反应。(2)术后第60天环孢素组的单核巨噬细胞浸润严重。(3)异系大鼠小肠移植经环孢素治疗组术后60天即可出现慢性排斥反应表现，并同时伴有 CD68、TGFβ1、PDGF 因子的显著高表达，提示C1368、TGFβ1、PDGF对于判定慢性排斥反应具有指导意义。

第二部分:单味中药对慢性排斥反应的预防作用

目的：观察单味中药对于慢性排斥反应的预防作用并筛选有效药物。

方法：利用显微外科技术构建异系小肠移植模型，受体大鼠应用环孢素1个月后按照实验要求随机分组，分别给予雷公滕、粉防己碱、青滕碱，同时设立同系对照组及异系对照组。术后7天、14天、28天、60天、90 天行移植物活检，常规病理学检测，应用免疫组织化学方法检测 CD68 以观察单核巨噬细胞浸润情况，使用Realtime-PCR 技术及 Western blot技术和免疫组织化学方法检测TGF β1、PDGFmRNA 转录水平和蛋白表达水平，于实验终点应用流式细胞技术检测移植物和外周血T细胞亚群以观察受体和移植物的免疫功能。

结果:(1)慢性排斥反应病理评分在第90天各组间比较中出现显著差异，其中粉防己碱组、青藤碱组和异系对照组评分显著高于同期雷公藤组和同系对照组。(2)CD68 的检测结果在术后第90 天组间比较中有显著差异，粉防己碱组、青藤碱组、异系对照组中表达显著高于雷公藤组和同系对照组。(3)TGFβ1和PDGF mRNA 转录水平在术后第60天和第90天的组间比较中有显著差异，粉防己碱组、青藤碱组、异系对照组的转录水平显著高于雷公藤组和同系对照组，TGFβ1和PDGF蛋白定量及免疫组化结果与mRLNA转录水平一致。(4)实验终止时，外周血T细胞亚群检测表明雷公滕组和粉防己碱组

CD4+/CD8+显著降低，移植物T细胞亚群检测表明异系对照组CD4+/CD8+显著低于其他各组。(5)肝肾功能检测表明粉防己碱组和青藤碱组AST值显著升高。 结论:(1)粉防己碱组、青藤碱组和异系对照组的组织破坏程度和单核巨噬细胞浸润程度重于雷公藤组和同系对照组。(2)术后第60天和第90天，粉防己碱组、青藤碱组、异系对照组的 TGFβ1和PDGF因子较同时点各组处于较高水平。(3)雷公藤和粉防己碱对于免疫功能有一定的抑制作用。(4)异系对照组移植物CD8+淋巴细胞浸润增多。(5)粉防己碱和青滕碱对于肝功能有一定影响。(6)雷公滕组与其它中药治疗组相比可更为有效地减低 TGF β1、PDGF因子的表达，减轻和延缓慢性排斥反应的发生和发展。

第三部分:复方中药对慢性排斥反应的预防作用

目的：观察复方中药对慢性排斥反应的预防作用并进行筛选有效复方中药。

方法：利用显微外科技术构建异系小肠移植模型，应用环孢素1个月后，按照实验要求随机分组，在予以雷公藤的基础上分别给予黄芪、丹参、黄芪-丹参，同时设立同系对照组及异系对照组。分别于术后术后7天、14天、28天、60、90天行移植物活检，常规病理学检测，应用免疫组织化学方法检测CD68以观察单核巨噬细胞浸润情况，使用 Realtime-PCR 技术和 Western blot 技术及免疫组织化学方法检测TGFβ1、PDGF mRNA 转录水平及蛋白表达水平，以明确各移植组TGFβ1、PDGF 水平的变化，应用流式细胞技术检测实验终止时移植物和外周血T细胞亚群以观察受体和移植物的免疫功能。

结果:(1)慢性排斥反应病理评分在第90天各组间比较中出现显著差异，其中丹参组、黄芪-丹参组、异系对照组的病理评分显著高于同期黄芪组和同系对照组。(2)CD68的检测结果显示术后第90组间比较中有显著差异，其中异系对照组CD68表达显著高于同期各实验组和同系对照组。(3)TGFβ1和PDGF mRNA 转录水平、蛋白表达水平检测结果显示在第60天和第90天组间比较有显著差异。在第60天组间比较，异系对照组的转录水平显著高于同期各组，第90天组间比较表明异系对照组、丹参组、黄芪-丹参组的转录水平显著高于同期的黄芪组和同系对照组。(4)实验终止时移植物T细胞亚群检测表明，异系对照组移植物中CD4+/CD8+显著减低，外周血T细胞亚群检测中各组之间无显著差异。

结论:(1)丹参组、黄芪-丹参组、异系对照组的组织损伤程度要重于黄芪组和同系对照组。(2)异系对照组单核巨噬细胞浸润严重。(3)在第60天和第90天异系对照组、丹参组、黄芪-丹参组的TGFβ1和PDGF因子处于较高水平。(4)异系对照组移植物中CD8+淋巴细胞浸润增多。(5)雷公藤-黄芪配伍与其它配伍组相比可更为有效地抑制 TGFβ1、PDGF 的表达，减轻移植后期移植物中单核巨噬细胞的浸润，显著延缓小肠移植术后排斥反应的进程。

7.会议论文王培训.黄宇明等青藤碱对巨噬细胞J774增殖及其产生PGE2的影响

8.学位论文徐广全青藤碱对心脏移植大鼠急性排斥反应和COX-2活性的影响2006

观察环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂青藤碱在大鼠急性心脏移植物排斥反应模型中的作用。

方法以SD大鼠为供者，Wistar大鼠为受者，按照Ono等报道的术式进行腹部异位心脏移植，供心肺动脉与受者的下腔静脉端侧吻合，供心主动脉与受者的腹主动脉端侧吻合。青藤碱30mg/kg/d，评价生存时间，检测移植心切片，进行排斥反应的病理分析和评价的COX-2活性。

结果：生存时间明显延长：实验组存活时间为(12.5±2.6)d，对照组为(6.8±0.5)d，两组差异有统计学意义。移植心的细胞凋亡主要发生于心肌细胞，移植后第3、5d，青藤碱治疗组心肌细胞凋亡指数分别为：1.03±0.42和3.28±2.42；对照组分别为2.35±1.51和11.35±3.46；两组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。对照组移植后第3d表现为炎性渗出和局灶心肌损坏，移植后第5d出现明显的心肌水肿、炎性渗出、心肌损坏；实验组移植后第3d炎性渗出明显减轻，巨噬细胞明显减少，移植后第5d淋巴细胞和巨噬细胞数明显减少；实验组移植后5天COX-2蛋白和mRNA表达减少。

结论青藤碱能够延长移植大鼠的生存时间。

细胞凋亡存在于急性排斥的整个过程，并且随着排斥程度的加剧而增加，说明细胞凋亡参与了心脏移植排斥反应，是心脏移植急性排斥中细胞死亡的重要机制。

青藤碱对移植物的保护可能是通过抑制移植物细胞的凋亡来实现的。

青藤碱通过抑制COX-2的活性，明显减少移植心组织中炎症细胞的浸润，减轻急性排斥和移植物损伤，尤其在排斥反应较为严重的第5天最为突出。

9.期刊论文金晓琨.李卫东.滕慧玲.林志彬青藤碱对核转录因子κB及其抑制因子IκB的影响-中国药理学通报

2004,20(7)

目的探讨青藤碱对BALB/c近交纯系小鼠腹腔巨噬细胞核转录因子κB及其抑制因子IκB表达的影响,提供其抗炎治疗类风湿性关节炎作用机制的实验依据.方法应用荧光标记和激光共聚焦扫描显微镜技术检测药物对LPS(Lipopolysaccharides)刺激状态下腹腔巨噬细胞NF-κBp65(nuclear

transcription factors)核移位的影响;采用Westernblot方法检测药物对LPS刺激作用下的腹腔巨噬细胞IκB-α降解的影响.结果高、中剂量给药组与模型对照(control)组间NF-κBp65核移位和IκB-α降解的差异有显著性(P＜0.01).结论青藤碱的抗炎抗风湿的作用可能与其抑制NFκBp65核移位和IκB-α降解有关.

10.学位论文赵毅青藤碱对RA患者树突状细胞免疫功能的影响及机制研究2007

背景

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是最为常见的以关节炎症表现为主的自身免疫性疾病。在全世界，RA的发病率平均为1％，男女比例为1:3，RA可发生于任何年龄阶段，发病的高峰为40-60岁。虽然，RA的发病遍布世界各个地区，但工业化国家的发病率一般比其他国家至少高3倍。RA的临床表现较为广泛，持续性和进展性的外周关节滑膜炎症、血管翳形成以及由此导致的骨和软骨的损伤是RA发病的主要特点。

RA的发病机制目前仍然没有阐明，目前认为RA是一种多因素联合介导的自身免疫性疾病。在RA的发病过程中，滑膜组织的慢性炎症引起RA患者关节滑膜成纤维细胞增生、血管过度形成，T细胞、B细胞、浆细胞以及巨噬细胞在RA关节滑膜中浸润。RA的发病以及疾病活动性都与HLA-DR4或HLA-DRl相关，这证明了T细胞在RA的发病中具有举足轻重的作用。RA可以被看作是未知抗原诱导T细胞活化介导的自身免疫病。MHC分子给CD4+T细胞提呈自身抗原是T细胞活化的第一步。在抗原的刺激下，炎症细胞分泌、合成炎症因子，引起滑膜炎症。树突状细胞(dendritic cells，DC)是功能最为强大的专职抗原提呈细胞，能够激活初始免疫反应。DC在免疫监视的淋巴组织中捕获、处理抗原，而后在移行至外周淋巴组织的过程中逐渐分化成熟。成熟的DC可将抗原肽提呈给T细胞，并促使Th细胞向Th1型或Th2型细胞分化，同时DC可表达协同刺激分子诱导调节性T细胞和B细胞免疫反应，分泌细胞因子产生相应的生物学效应。成熟的．DC可活化淋巴细胞诱导免疫反应，而不成熟的DC则可诱导T细胞的对自身抗原的免疫耐受，减少自身免疫的发生。因此，DC在RA的发病中起着重要的作用。RA属于祖国传统医学“痹病”范畴。“痹病”是因人体遭受风、寒、湿、热之邪的侵袭，气血为病邪阴闭而引起的疾病。以筋骨、肌肉、关节酸痛、麻木、重着、屈伸不利和关节肿大、灼热等为临床主要表现。按病因的不同可分为行痹、寒痹、湿痹、热痹、风湿热痹等。临床上具有渐进性或反复发作的特点。其主要病机是气血痹阻不通，筋脉关节失于濡养。因此，“痹病”以祛风、除湿、舒筋活络为治疗大法，并随其寒热而兼行清热或祛寒。清风藤用于治疗关节炎已经有两千多年的历史。青藤碱是清风藤的单体提取物，现代药理研究显示，青藤碱具有良好的抗炎和抗风湿

理。

目的：

1．建立人外周血DC体外培养体系；

2．观察青藤碱对RA患者外周血DC免疫功能的影响；

3．建立Toll样受体(toll like receptor，TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA荧光定量PCR检测体系；

4．观察青藤碱对RA患者外周血DC中TLR2、TLR4mRNA和蛋白表达的影响；

5．观察青藤碱对RA患者外周血DC中核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活性和核易位的影响；

6．进一步揭示青藤碱免疫抑制的机理，进一步为青藤碱治疗RA提供理论和实验依据。

方法：

1．人外周血DC体外培养体系的建立分离人外周血单核细胞，RPMI-1640完全培养基培养，采用GM-CSF和IL-4联合刺激，于培养第8天收获，即

control DC。在培养结束前12h加入脂多糖(lipopolysacchar。ide，LPS)(1μg/ml)刺激成熟，即LPS-DC。光学显微镜、电子显微镜观察DC形态。分离、培养同种异体T淋巴细胞，采用同种异体混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)检测DC对T细胞的刺激作用。直接免疫荧光标记细胞，流式细胞仪分析细胞表型。

2．青藤碱对RA患者外周血DC免疫功能的影响将16名活动期RA患者随机分为青藤碱高、中、低剂量组和空白对照组，体外培养、诱导RA患者DC。于培养结束前12h在培养基中分别按照低、中、高浓度加入青藤碱溶液至终浓度为1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L，空白对照组加入等量溶解介质。MTT法检测青藤碱在0.1mM，2mM，5mM，10mM，15mM，20mM浓度下对DC的细胞毒性作用。收集青藤碱干预后的RA患者外周血DC，流式细胞仪检测，DC表型，MLR检测

DC对同种异体T细胞的刺激作用。收集DC培养上清，ELISA方法检测培养上清中IL-12p70含量。提取RA患者外周血DC总RNA，采用半定量R-T-PCR检测CD80 mRNA、CD86 mRNA、IL-12p35mRNA的表达。

3．青藤碱对RA患者外周血DC中TLR2和TLR4表达的影响青藤碱干预RA患者外周血DC，收集干预后的细胞提取DC总RNA并逆转录为cDNA。PCR扩增TLR2、TLR4、GAPDHcDNA片段，回收并纯化：PCR．产物。将TLR2、TLR4、GAPDH的PCR产物分别按10<'8>，10<'7>，10<'6>，10<'5>，10<'4>copies/μl梯度倍比稀释，荧光定量PCR仪检测并自动计算出样品的定量结果，描绘标准曲线。将各样本cDNA按照建立体系中的反应条件在荧光定量PCR仪上进行扩增，由电脑自动分析并计算出反应体系中待测样品cDNA达到设定阈值的循环数(Ct值)。以公式2<'-ΔΔt>计算出相对于空白对照组的青藤碱干预各组的DC中TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表达水平。提取RA患者外周血DC总蛋白，SDS-PAGE电泳分析后采用western-blotting检测TLR2、TLR4蛋白的表达。

4．青藤碱对RA患者外周血DC中NF-κB活性和核易位的影响收集青藤碱干预后的RA患者外周血DC，提取DC总RNA和蛋白。半定量 RT-PCR检测DC中RelB mRNA的表达，western-blotting检测青藤碱对RA患者DC中磷酸化p38MAPK和IKBα表达的影响。提取DC核蛋白，凝胶迟滞实验 检测RA患者外周血DC中NF-κB的活性。FITC标记DC内RelB蛋白，激光共聚焦扫描显微镜下观察DC中RelB核易位的情况。

5．统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，结果以X±S表示，两种处理因素设计的均数比较采用析因设计的方差分析，并进一步分析处理的单独效应、主效应和交互作用；单因素设计的多组间均数比较采用 One way-ANOVA，多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验；两组间均数比较采用两独立样本t检验，P<0.05为显著性差异。

结果：

1．在GM-CSF和IL-4联合刺激的作用下，单核细胞成功的分化为DC。在光镜和电镜下观察可见其呈现典型的树突状形态，流式细胞仪检测其表达CDla、CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR，并且随着DC数目的增多其对T细胞刺激能力逐渐增强。

2．经lmM，2raM，5mM，lOmM青藤碱溶液干预后的DC其细胞活力与对照组无显著性改变(P>0.05)，经15mM，20mM青藤碱溶液干预后的DC其细胞活力与空白对照组相比有显著性降低(P<0.01)。

3．经阳性梯度定量模板数与Ct值关系对数拟合作图，得到不同梯度定量模板的对数值与循环数(Ct值)之间关系的标准曲线，分别有着非常好的相关关系(r值分别为0.9985，0.9945，0.9912)。

4．PCR扩增结果显示，青藤碱4个剂量组之间RA患者外周血DC中RelBmRNA表达无显著性差异，Western-blot检测结果显示，经青藤碱干预后4组磷酸化p38和IKBα的表达均有所改变，但p-IκBα的改变有统计学差异。

结论：

1．以外周血单核细胞为前体，以GM-CSF和IL-4两种细胞因子为刺激，可充分诱导出具有免疫功能和特征形态、表型的人外周血DC。

2．青藤碱可能通过抑制RA患者DC的免疫功能而阻断RA患者自身反应性T细胞的活化，控制其介导的炎症损伤，最后达到缓解和治疗RA的作用。

3．青藤碱可能至少从以下几个方面抑制了RA患者DC的成熟或成熟DC的功能，从而抑制了RA患者自身反应性T细胞的异常活化：(1)青藤碱可抑制DC表达MHC Ⅱ类分子，阻断或减弱了DC对自身反应性T细胞的提呈自身抗原的能力，抑制了自身反应性T细胞的增殖；(2)青藤碱可抑制DC协同刺激分子的蛋白和基因的表达，阻断或减弱了DC为自身反应性T细胞提供的协同刺激信号，抑制了自身反应性T细胞的活化；(3)青藤碱可抑制DC合成和分泌IL-12，阻断了DC对活化后的自身反应性T细胞的诱导和分化能力，抑制了自身反应性T细胞的分化。4．青藤碱对DC免疫功能的影响可能通过对TLRs的作用而产生。

5．青藤碱对RA的治疗作用可能也与其阻断了TLRs对RA发病相关因素的识别，抑制RA发病因素对RA患者免疫的异常活化作用有关。

6．青藤碱可有效抑制NF-κB的活性，但不抑制NF-κB的表达。

7．青藤碱对DC免疫功能的影响可能与其抑制DC中IκB的磷酸化，降低NF-κB的活性，抑制RelB亚基的核易位有关。

引证文献(1条)

1.刘剑平.张国元.刘增荣.张海港.张翼冠青藤碱对NZB/W F1代狼疮鼠外周血CD4~+T细胞比例及Bax、BCL-2 mRNA表达的影响[期刊论文]-中药药理与临床 2009(6)

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下载时间：2010年11月21日