POD_测定方法

植物体POD的测定

※<原理>

了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。

过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。

※<实验材料、试剂与仪器设备>

1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵

2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］

3、实验材料任何植物材料

※<实验步骤>

1、粗酶液的提取称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。

2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。

※<结果计算>

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之。也可以用每min 内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。

过氧化物酶活性[u/(g.min)]=

式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。

VT ——提取酶液总体积，mL。Vs ——测定时取用酶液体积,mL。

t——反应时间，min。

3.POD的测定方法

试剂配制：

（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中

B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O

（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）

（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）

方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min

过氧化物酶(POD)活性的测定

【实验原理】

植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。

(CA T)催化如下反应：

2 H202→2 H20+ 02

本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性。

在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【试剂药品

1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液

2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸缓冲液至50ml

3.0.2% 愈创木酚:秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至100ml

【实验步骤】

酶液的制备

1.称取叶片0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨15000r/min

离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。

2. CAT活性的测定

在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液

启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

3. POD活性的测定

在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。

4. 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量.

【实验结果及计算】

CA T和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。