柔红霉素C_14羟化酶基因在E_coli中的克隆_融合表达及酶的纯化
微生物药物与生物技术
谢丽萍，宫 倩，胡又佳，朱春宝*，朱宝泉
（上海医药工业研究院，上海 200040）
摘要：doxA 基因编码柔红霉素C-14羟化酶（DoxA ）。本研究将来自Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482的doxA 基因克隆至高效表达载体pET32a 中，并在E. coli 中表达。经Western blotting 实验证明产物融合蛋白表达正确且以包函体形式存在，并初步研究了DoxA 的分离纯化方法。
关键词：柔红霉素C-14羟化酶；包函体；融合蛋白；纯化
中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1001-8255（2006）09-0590-04
柔红霉素C-14羟化酶基因在E. coli 中的克隆、融合表达及酶的纯化
收稿日期：2005-10-31
基金项目：国家十五攻关项目（2004BA713B01-02）
作者简介：谢丽萍（1977），女，博士研究生，专业方向：微生物与生化药学。
通讯联系人：朱春宝（1950），男，研究员，从事微生物药物研究。Tel ：021-********×323E-mail ：zhucb@https://www.360docs.net/doc/e018544643.html,
来自链霉菌Streptomyces sp. C5的柔红霉素C-14羟化酶（DoxA ）是一种P450酶，分子量约47k ，最适pH 和温度分别为7.5和30℃［1］。在柔红霉素和多柔比星的生物合成中，由于DoxA 具有宽泛的底物特异性，可催化13-去氧柔红霉素生成13-二氢柔红霉素，继而将后者转化成柔红霉素和多柔比星［2］。因此是潜在的可将柔红霉素转化成多柔比星的生物催化酶。
大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统［3］，因其遗传背景清楚、易培养且有大量可供选择的克隆与表达载体，成为克隆表达外源基因的主要菌株［4］。本研究尝试从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌（Streptomyces coeruleorubidus ） SIPI-1482中扩增doxA 并将其克隆至高效表达载体pET32a 中进行融合表达，研究了DoxA 在大肠杆菌中表达的条件，为下一步的功能研究做准备。1 材料与试剂1.1 菌株和质粒
E. coli DH5á、E. coli BL21（DE3）、天蓝淡红链霉菌SIPI-1482、质粒pUC18、pET32a 均为本实验室保藏。
1.2 主要试剂
丙烯酰胺、Triton X-100、尿素、PEG 6000、异丙
基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG ）均为国产分析纯。亲和色谱所用溶液：离子化缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液均购自上海复旦悦达生物技术有限公司。Western blotting 试剂盒（美国Pierce 公司）；一抗、二抗购自美国Sigma 公司。His 标签亚氨基二乙酸（IDA ）型金属螯合亲和柱（德国Qiagen 公司）。
2 方法与结果2.1 试验方法
DNA 片段的回收、连接及转化参考文献［5］；SDS-PAGE 凝胶电泳参考文献［6］。
Western blotting 操作按试剂盒说明书进行。其中一抗以1∶37500稀释（0.8μl 稀释至30ml ），二抗以1∶30000稀释（1μl 稀释至30ml ）。2.2 溶液的配制
超声破壁缓冲液、包函体洗涤液、包函体溶解液、包函体复性液、磷酸盐缓冲液（PBS ）：均参考文献［7］配制。
10×PBS-T ：10×PBS 995ml ，吐温-20 5ml 。膜阻断剂：脱脂奶粉5g ，PBS-T 100ml 。抗体稀释剂：10×PBS-T 100ml ，H 2O 800ml ，牛血清白蛋白（BSA ）10g ，调至 pH7.4。加水定容至1L ，0.22μm 膜过滤。
转膜缓冲液/g·L –1：Tris 3.0，甘氨酸14.4，SDS 1.0，甲醇200m l 。
2.3 高效表达载体pYG914的构建
为从天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的染色体DNA 中扩增doxA 基因，设计了上游引物：AGGGATCC
AAACTCA TGAGCGGCGAG，含Bam HⅠ位点；下游引物：CGGAATTCGGCCCATCAACGCAGCCAG，含Eco RⅠ位点。PCR扩增条件：97℃预变性5min，95℃变性30s，72℃退火延伸5min。循环30次。
将PCR产物双酶切后连接至质粒pUC18中构建重组质粒pUC18doxA。经测序，克隆的doxA基因序列与G e n b a n k中报道的同源性为100％。从pUC18doxA中经双酶切（Bam HⅠ和Eco RⅠ）获含doxA的DNA片段，将其克隆至pET32a中构建重组质粒pYG914（见图1），挑取3个转化子进行PCR检验，并以其中一个进行酶切验证。结果表明获得了大小正确的片段（见图2）。
2.4 重组蛋白的表达及Western blotting验证
pYG914中的doxA基因处于T7 Lac启动子的控制下，在宿主细胞E. coli BL21（DE3）中表达。重组子的培养条件如下：取新鲜平板上单菌落接种至LB＋0.2％葡萄糖＋Amp培养基，培养至A600为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mmol/L。每隔1h取样。由图3可见，pYG914/DE3在诱导前未表达目的蛋白，而诱导1h即能表达大量目的蛋白，且随时间增加蛋白表达量提高。而对照E. coli BL21（DE3）诱导前后并无变化。为确证可溶性蛋白的量，经不同条件培养如37℃诱导3h及28℃培养过夜（转速150r/min）后，超声破碎（600W，工作5s暂停10s，循环50次）取上清液，发现其中几乎无表达蛋白。即使改变表达条件如降低目的蛋白表达速度或诱导剂浓度也未能获得可溶性蛋白，说明此目的蛋白以包函体形式表达。
为验证表达蛋白是否正确，根据pET32a带有His 标签，故表达的融合蛋白含有His标签的特点，将细胞抽提物经电泳分离，转移至膜上用anti-His标签抗体进行Western blotting免疫检测。如图4A所示，2、3为诱导前后的蛋白电泳图，诱导后产生一重组蛋白，对应于图4 B中blotting带的位置，表明表达的融合蛋白正确。
2.5 重组蛋白包函体的复性和纯化
2.5.1 包函体的溶解
超声破碎后所得包函体用“2.2”项下包函体洗涤液进行洗涤，用溶解液10ml溶解。为考察溶解情况，测定了10ml溶解液在不同时间内的A280
，见
图5。结果表明，包函体在1h内的溶解速度较快，5h后速度趋于平缓。为防止溶解液对目的蛋白氨基发生共价修饰，选择包函体溶解的时间为5h。
2.5.2包函体的复性及纯化
将包函体溶解液离心去除不溶物，加入溶解液至30ml装入透析袋中，用复性液透析过夜。次日，将复性液稀释5倍再透析12h后，换用纯水透析过夜。经PEG 6000浓缩后在His标签含IDA的金属螯合亲和柱中纯化。亲和色谱方法如下：用3倍体积无菌去离子水、5倍体积离子化缓冲液、3倍体积结合缓冲液依次清洗、离子化和平衡亲和柱，然后加入样品，分别以10倍体积结合缓冲液，6倍体积漂洗缓冲液上柱，最后加入6倍洗脱缓冲液后，每5ml收集样品。由图6洗脱曲线可见，第15ml 时蛋白量最高，随后在20～30ml也有蛋白洗脱。将15～30ml间洗脱的蛋白合并，再次通过PEG 6000浓缩，并进行蛋白电泳（图7）。结果表明，通过亲和色谱纯化能得到单一的蛋白条带。
3 讨论
由于密码子选择的偏爱性，高GC比的链霉菌基因在大肠杆菌中表达较困难。曾将来自天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的doxA克隆至 pET22b中的NdeⅠ位点直接进行天然蛋白的表达，但未获成功。也有将N端起始几个氨基酸的密码子改成大肠杆菌中常用的密码子而成功表达的报道［8,9］。而在本研究中，采用目的产物起始几个氨基酸的密码子也是大肠杆菌常用密码子的方式，通过融合蛋白表达，使doxA实现了过量表达，所得融合蛋白分子量约64k。
重组蛋白在宿主系统进行高效表达时易形成包函体，这可能与高效表达系统及缺乏蛋白折叠过程所需要的酶和辅因子有关。为增加重组蛋白的可溶
性表达，通常可以采取降低诱导温度或诱导剂浓
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in E. coli and Its Purification
XIE L i-Ping, GONG Q ian, HU Y ou-Jia, ZHU C hun-Bao*, ZHU Bao-Quan
（Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040）
ABSTRACT : doxA Gene coding for daunorubicin C-14 hydroxylase （DoxA ） was cloned from Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482 into a E. coli vector pET32a and expressed as a fusion protein with a His tag ．The expressed protein was confirmed to be correct by Western blotting. It was found that most of the fusion protein existed in form of inclusion body. Separation and purification of DoxA protein were also studied.
Key Words : daunorubicin C-14 h ydroxylase; inclusion body; fusion p rotein; purification
度、降低摇床转速及同时表达分子伴侣等办法［10, 11］。本研究采用降低诱导温度至28℃，摇床转速降为150r/min 进行过夜培养，或降低诱导剂浓度至0.2、0.05m m ol /L 等，但均未得到可溶性部分。而以Triton X- 100和低浓度尿素为复性液可以充分去除杂质，再对包函体进行不连续稀释即得到较好的复性效果。复性后表达蛋白在可溶性条件下溶解，通过His 融合标签进行亲和纯化得到单一条带，可用于下一步蛋白功能研究试验。
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