SS_GAG对高糖状态下血管内皮细胞NO释放及ET_1分泌的影响_王瑞鑫

收稿日期:2007 12 11

基金项目:山东大学威海分校大学生科技创新项目(A07053)。

作者简介:王瑞鑫(1986-),男,2005级本科生。E mail:wrxshtc@126.c om

通讯作者:李裕强(1969-),男,副教授,研究方向:细胞与发育生物。E mail:yuqiangli@https://www.360docs.net/doc/f2675131.html,

文章编号:1671-7554(2008)04-0359-05

SS GAG 对高糖状态下血管内皮细胞NO 释放

及ET 1分泌的影响

王瑞鑫1

,王春波2

,罗世滨1

,李裕强

1

(1.山东大学威海分校海洋学院,山东威海264209; 2.青岛大学医学院,山东青岛266071)

摘要:目的 观察高糖状态下扇贝裙边糖胺聚糖(scallop skirt glycosaminogly can,SS GAG)对体外培养的血管内皮细胞(ECV 304)一氧化氮(NO)释放及内皮素 1(ET 1)分泌的影响。方法 在体外培养生长良好的EC V 304分别加入不同浓度葡萄糖,建立高糖损伤细胞模型,选择葡萄糖终浓度为55.5mmoL L 的培养液作为高糖环境,加入不同浓度SS GAG 继续培养至12、24、36、48h,倒置显微镜下观察细胞生长状态,特异性硝酸还原酶法检测细胞内NO,放射免疫法测定ET 1。结果 高糖能抑制ECV 304细胞生长,细胞形态发生改变。SS GAG 减轻高糖对ECV 304损伤,SS GAG 保护组细胞形态基本完好; 高浓度葡萄糖促进ET 1的分泌,与正常对照比较差异有统计学意义(P <0.01)。而NO 含量则随作用时间的延长表现出先升高后下降的动态变化过程,与正常对照比较差异有统计学意义(P <0.01)。SS GAG 对高糖状态下ECV 304细胞分泌E T 1、NO 具有调节作用,使其趋于正常,与正常对照比较差异无统计学意义(P >0.05),与高糖比较差异有统计学意义(P <0.01)。结论 高浓度葡萄糖对EC V 304具有明显的损伤作用,可直接导致ECV 304形态和功能异常,引起E T 1分泌增多以及损伤内皮NO 系统使NO 分泌失调。SS GAG 可减轻高糖对ECV 304细胞的损伤,通过调节ET 和NO 平衡,起到保护EC V 304作用。关键词:扇贝;糖胺聚糖;葡萄糖;血管内皮细胞;内皮素 1;一氧化氮中图分类号:R 文献标志码:A

Effect of SS GAG on ET1and NO secretion of vascular endothelial

cells damaged by highly concentrated glucose

WANG Rui xin 1

,WANG Chun bo 2

,LUO Shi bin 1

,LI Yu qiang

1

(1.Marine College of Shandong University at Weihai,Weihai 264209,Shandong ,China;

2.Medical College of Qingdao University,Qingdao 266071,Shandong,China)

Abstract :Objective To study the effects of scallop skirt glycosaminoglycan (SS GAG)on E T1and NO secretion of EC V304damaged by hi ghly concentrated glucose.Methods The vascular endothelial cell ECV304was cul tured i n vitro,and the damage mode1of endothelia1cells was es tablished by hi ghly concentrated glucose.Differen t concentrations of SS GAG were mixed with cell culture fluid containing hi ghly concentrated glucose (55.5mmol L),and cell morphology was observed after culturing for 12h,24h,36h and 48h.Ni tric oxide (NO)i nside cells was determined by the assay of nitric acid reductase.Radioimmunoassay was used to determine E T 1.Results Cell morphology was changed and proliferation was depressed under highly concentrated glucose,and a dose dependent reaction occurred.SS GAG reduced the damaging effects of highly concentrated glucose,and al lowed these cells to keep their normal morphology.The concentration of E T 1in the cell culture supernatant was increased com pared with the normal control group.Differences had statistics meaning compared with the normal control group (P <0.01).The NO inside cells initially increased,and then reduced.Differences had stati stical meaning compared wi th the normal control group (P <0.01).There were obvious differences between the SS GAG group and the negative control group.With modulation of

第46卷 第4期

Vol.46 No.4

山 东 大 学 学 报 (医 学 版)

J OURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)

2008年4月 Apr.2008

SS GAG,ET 1and NO inclined to the normal level,which showed no difference wi th normal cells,but differences occurred be tween the SS GAG and the highly concentrated glucose groups.Difference had statistics meaning compared wi th the highly con centrated glucose group(P<0.01)but not wi th the normal con trol group(P>0.05).Conclusions Highly concentrated glu cose has obvious damaging effects on vascular endothelial cells,which may induce cell morphology change,dysfunction,ET1in crease and NO secretion.SS GAG will reduce this damage and protect the cells by modulating the balance of E T1and NO. Key w ords:Scallop;Glycosaminoglycan;Glucose;Vascular endothelial cell;Endothelin1;Ni tric oxide

研究表明,内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(ath erosclerosis,AS)形成的始动环节,其中,内皮素(en dothelin,E T)与一氧化氮(nitric oxide,NO)平衡失调是动脉内皮受损的显著特征,在AS以及缺血性心脑血管疾病中起着重要作用[1]。引起内皮细胞损伤的因素很多,高血糖、低密度脂蛋白(LDL)发生氧化修饰后产生的氧化低密度脂蛋白(OX LDL)、活性氧自由基是内皮细胞损伤的主要原因,高血糖也是公认的损伤和致糖尿病血管病变的危险因素。

扇贝裙边糖胺聚糖(scallop skirt glycosaminogly can,SS GAG)是从栉孔扇贝裙边中提取的多糖成分。文献报道SS GAG具有降血脂、抗血管平滑肌增殖、保护血管内皮细胞等抗AS作用[2]。SS GAG 对OX LDL、氧自由基损伤血管内皮细胞具有保护作用已有文献报道[3 4],但对高糖所致血管内皮细胞(EC V 304)损伤是否具有保护作用,报道甚少。本研究通过SS GAG对高糖损伤的EC V 304释放NO及ET 1分泌的影响,探讨高糖状态下SS GAG对EC V 304的保护机制,为防治AS心脑血管疾病及糖尿病血管并发症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 SS GAG(由青岛大学医学院王春波老师提供);ECV 304细胞株(由山东大学医学院实验核医学研究所提供);DMEM LOW培养基(为HyClone公司产品);胎牛血清(FCS)为Gibco公司产品;葡萄糖(Glucose,Glu,分析纯,为天津市福晨化学试剂厂生产);胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠(ED TA),均为Sigma公司产品;NO检测试剂盒(为南京建成生物工程研究所产品);E T 1放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所);低温高速离心机(KCD 2046)、Gamma C ounter(均为科达创新公司产品);酶标仪(Model680型,为BI O RAD公司产品); LDZ5 2型低速自动平衡离心机(为北京雷勃尔离心机有限公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 EC V 304细胞培养 将冻存的ECV 304接种于培养瓶中,用DMEM LOW完全培养液(含15% FCS、100U mL青霉素、100 g mL链霉素,pH7.2~ 7.4),37!、5%C O2培养饱和湿度的培养箱中培养,待细胞生长良好,用0.25%胰蛋白酶消化液进行消化传代培养,将传2~3代后对数生长的细胞用于实验。

1.2.2 实验分组 将生长良好的EC V 304常规方法制备成1?105 m L的细胞悬液,按每孔100 L接种于96孔板,在37!、5%C O2培养24h,将贴壁生长良好细胞进行分组,实验分组: 正常对照组:加入D ME M LOW(含Glu5.5mmol L)完全培养液;

SS GAG组:加入含SS GAG终浓度为25、50、100、200mg L的DME M LOW完全培养液;#高糖损伤组:加入含Glu终浓度为18、30.5、55.5、105.5mmoL L的D ME M LOW完全培养液;?SS GAG保护组:加入含Glu终浓度为55.5mmoL L+不同浓度SS GAG的

D M

E M LOW完全培养液。

1.2.3 细胞形态学观察 取前述96孔细胞培养板,弃掉培养上清液,按上述分组加入不同的液体, 100 L 孔37!、5%CO2继续培养12、24、36、48h,不同时间倒置显微镜下观察各组细胞生长状况及形态学变化并拍照。

1.2.4 ECV 304细胞内NO含量测定 取前述96孔细胞培养板,弃掉培养上清液,按上述分组加入不同的液体,100 L 孔37!、5%CO2继续培养12、24、36、48h,在不同时间取出培养上清液-20!冰箱保存待测ET 1。将各组细胞消化制成细胞悬液,调整细胞密度为2?106 mL,离心后弃上清液,用PB S冲洗细胞2次。采用硝酸还原酶法测定内皮细胞内NO的含量,具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.5 EC V 304分泌E T 1的测定 取前述各组细胞培养液,按照ET 1放射免疫分析试剂盒要求进行操作,利用均相竞争原理直接测定内皮细胞培养上清液中E T 1的含量。由Gam ma Counter测定样品的放射活性,并根据预先编制的程序,直接给出标准曲线和样品浓度。

1.3 统计学处理 采用JMTJFX简明统计软件处理,计量资料用 x%s表示,行t检验。

358

山 东 大 学 学 报 (医 学 版)46卷4期

2 结 果

2.1 不同浓度SS GAG、Glu对ECV 304细胞生长状态及形态学的影响 见图1。倒置相差显微镜下观察,正常生长的EC V 304呈多角形,融合成片,单层致密排列、镶嵌排列成铺路石状、紧密贴壁、细胞边界清楚透明度高。损伤后细胞形态改变,细胞变圆,颗粒增多,大小不匀,分布不均,间隙增大,甚至细胞脱落溶解。正常对照组和SS GAG组细胞生长良好,细胞形态正常。Glu55.5mmoL L组在作用12 h细胞形态仍大致正常,24h后细胞内颗粒增多、细胞变圆、略浮起的细胞增多,但未脱壁;作用48h后较多细胞肿胀变圆、细胞膜模糊、细胞空泡增多、并可见部分细胞脱落变圆,悬浮培养液中。Glu 105.5mmoL L作用12h开始出现死细胞,并随时间延长死细胞越多。SS GAG保护组,细胞损伤明显减轻,SS GAG50~200mg L各浓度保护组细胞生长良好形态基本正常,连接较紧密,边界清晰,透明度好。且随SS GAG 浓度增高保护作用越明显。

图1 Glu和 SS GAG对ECV304形态的影响(?40)

a:正常对照组;b:SS GAG200mg L组;c:Glu105.5mmol L组;d:Glu55.5mmol L组;e:SS GAG100

mg L保护组;f:SS GAG50mg L保护组

Fig.1 Effects of Glucose and or SS GAG on morphology of EC V304(?40)

a:Normal control;b:SS GAG200mg L group;c:Glu105.5mmol L group;d:Glu55.5mmol L group;e:

SS GAG100mg L group;f:SS GAG50mg L group

2.2 不同浓度Glu对EC V 304分泌E T 1的影响 见表1。Glu105.5m moL L作用12~48h细胞培养液中的E T 1含量明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),Glu55.5mmoL L作用12~36h细胞培养液中的ET 1含量明显高于正常对照组差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),Glu30. 5m moL L作用12~24h细胞培养液中的E T 1含量明显高于正常对照组差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同浓度Glu对EC V 304分泌E T 1的影响( x%s,pg mL)

组 别12h 24h 36h 48h 正常对照组136.10%12.30195.67%32.33281.23%65.75328.50%69.31 Glu18160.29%12.32204.89%48.81304.59%21.61347.08%17.56 Glu30.5180.36%15.48*292.25%47.72*322.80%36.10376.23%26.17 Glu55.5302.58%38.36**345.20%68.70*396.18%56.12*412.15%31.28 Glu105.5356.27%28.17**378.77%56.56**408.17%43.16*452.42%21.16* *P<0.05,**P<0.01vs正常对照组

2.3 不同浓度SS GAG对高糖(Glu55.5mmoL L)状态下EC V 304分泌ET 1的影响 见表2。SS GAG 可明显降低高糖(Glu55.5mmoL L)状态下E T 1分泌,SS GAG50~200mg L在12h这种作用最明显,与Glu55.5mmoL L比较差异有统计学意义(P<0.01)。SS GAG100、200mg L可持续作用至48h,SS GAG 50mg L持续作用至36h与Glu55.5差异有统计学意义(P<0.05),且SS GAG的浓度越高效果越明显,接近正常,与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

王瑞鑫,等.SS GAG对高糖状态下血管内皮细胞NO释放及ET 1分泌的影响359

表2 不同浓度SS GAG在高糖(Glu55.5mmol L)存在下对EC V 304分泌E T的影响( x%s, pg&mL-1)组 别12h 24h 36h 48h 正常对照组136.10%12.30195.67%32.33281.23%65.75328.50%69.31 Glu55.5302.58%38.36**345.20%68.70*396.18%56.12*412.15%31.28 Glu55.5+SS GAG25187.21%16.37*221.21%26.04?262.15%18.15?378.84%16.19 Glu55.5+SS GAG50169.19%11.67*??208.27%16.28?269.15%21.36?366.17%12.30 Glu55.5+SS GAG100160.14%20.82??197.21%27.26?278.82%17.18?336.15%26.18?Glu55.5+SS GAG200145.32%19.15??186.38%20.17?299.98%14.60?329.28%16.17? *P<0.05,**P<0.01vs正常对照组;?P<0.05,??P<0.01vs Glu55.5

2.4 不同浓度Glu对EC V 304内NO含量的影响 见表3。高浓度Glu作用下E CV 304分泌NO随着作用时间延长表现出先升高后下降的动态变化过程, Glu30.5~Glu105.5m moL L在12h明显高于正常对照组,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05),在24、36、48h明显低于正常对照组,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 不同浓度Glu对EC V 304释放NO的影响( x%s, moL L)

组 别12h 24h 36h 48h 正常对照组26.82%0.5023.10%0.8921.49%0.9721.81%0.72 Glu1826.62%0.9923.56%0.8920.80%1.2518.52%1.34 Glu30.528.62%0.90*18.22%1.05**17.17%1.25**15.40%0.75** Glu55.529.17%1.21*16.16%0.78**15.62%0.99**12.09%0.21** Glu105.532.80%1.25**11.57%0.49**10.60%0.58**8.29%0.86** **P<0.01,*P<0.05vs正常对照组

2.5 不同浓度SS GAG对高糖(Glu55.5mmoL L)状态下EC V 304内NO含量的影响 见表4。SS GAG 对高糖所致EC V 304分泌NO失调有明显的调节作用,使NO的水平接近正常水平。在作用12h时降低NO,24~48h升高NO,SS GAG100~200mg L在24~48h作用效果最明显。

表4 不同浓度SS GAG在高糖(Glu55.5mmol L)存在下对ECV304释放NO的影响( x%s,c mol&L-1)组 别12h 24h 36h 48h 正常对照组26.82%0.5023.10%0.8921.49%0.9721.81%0.72

Glu55.529.17%1.21*16.16%0.78**15.62%0.99**12.09%0.21** Glu55.5+SS GAG2528.91%1.9217.98%0.59?**17.40%0.75??**16.67%0.56??** Glu55.5+SS GAG5027.68%1.7520.29%0.34??**18.40%0.35??**17.32%2.15?* Glu55.5+SS GAG10026.39%1.6221.66%1.08??19.52%1.34??19.97%1.02??Glu55.5+SS GAG20025.10%1.35?23.57%1.24??21.16%1.22??20.81%0.72?? P<0.05,**P<0.01*vs正常对照组;?P<0.05,??P<0.01vs Glu55.5

3 讨 论

糖尿病时异常升高的血糖可通过损害血管内皮细胞的形态和功能而导致糖尿病血管病变的发生。体外实验证实,高糖抑制血管内皮细胞增殖,使其形态改变和功能异常,导致细胞损伤和凋亡[5]。本实验利用体外培养ECV 304进行研究,结果显示,高糖状态下细胞生长受到抑制,细胞形态发生改变。Glu105.5mmol L作用12h开始出现死细胞,并随时间延长死细胞越多。Glu55.5mmol L作用12h细胞形态仍大致正常,24h后细胞形态发生改变,细胞损伤明显。由于葡萄糖浓度太大,可能会因高渗而引起细胞死亡,因此本研究参考文献[6 7]并结合本研究结果,选用Glu55.5mmol L作为EC V 304的高糖环境,观察SS GAG对ECV 304的保护作用。SS GAG 保护组,细胞损伤明显减轻,SS GAG50~200mg L 各浓度保护组细胞形态基本正常。说明SS GAG的使用剂量范围较大,实验中未发现其本身对细胞的损害SS GAG组细胞生长良好形态正常。

NO和ET 1是血管内皮细胞分泌的两种重要的细胞活性物质,它们相互作用共同维持血管的正常张力,NO具有松弛血管平滑肌、抗血小板聚集的作用,可减少氧自由基造成的内皮细胞功能障碍。E T 1是目前所知最强的血管收缩肽,与血管舒张因子NO构成一对拮抗因素,共同调节血管的活性。糖尿病时高浓度的葡萄糖可通过产生过多氧自由基造成氧化应激而对血管内皮细胞产生毒性作用,且血

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山 东 大 学 学 报 (医 学 版)46卷4期

管内皮持久处于高糖环境下,内皮细胞易受损,引起内皮功能障碍时,这种平衡机制受到破坏,就可能诱导血管病变。许多研究表明,高糖引起内皮细胞损伤使其释放ET 1增高。内皮细胞损伤后,内皮素释放增加,一方面促进平滑肌细胞增殖,另一方面激活磷脂酶的活性,促进钙从储备中释放,活化的内皮素受体促进钙内流而增高细胞内游离钙离子浓度,导致血管收缩。E T 1增多在动脉粥样硬化尤其糖尿病血管并发症中具有重要的作用[8 10]。本实验结果显示,高浓度葡萄糖呈浓度依赖性促进E T 1的分泌,并持续一定时间。SS GAG可明显降低高糖(Glu55.5 mmol L)状态下E T 1分泌,SS GAG50~200mg L在12h这种作用最明显,SS G AG100~200mg L可持续作用至48h,且SS GAG的浓度越高效果越明显。

有关高糖引起血管内皮细胞分泌NO一直存在争论,Graier等[11 12]研究显示,高糖使血管内皮细胞一氧化氮合成酶的活性增加,NO合成增加。也有文献报道[13 14]高糖环境下,血管内皮细胞多元醇通路亢进,且合成NO减少;糖基化终产物导致NO产生减少。有报道NO在糖尿病时的变化是一个随病程改变的过程,即早期NO代偿性合成增加,而晚期合成减少。本研究结果显示,在高糖作用下EC V 304释放NO随着作用时间延长表现出先升高后下降的动态变化过程,作用12h细胞内NO含量呈代偿性增加,作用24h至48h,NO合成逐渐减少。SS GAG对高糖(Glu55.5mmol L)所致血管内皮细胞分泌NO失调有明显的调节作用,在作用12h时可降低NO释放,在作用24~48h时可促进NO释放使其趋于正常。

本研究结果显示,高浓度SS GAG50~200mg L 对高糖引细胞损伤有明显的保护作用,对其损伤后ET 1、NO水平有较好的调节作用,低浓度SS GAG25 mg L对高糖引起的血管内皮的损伤具有微弱的保护作用,对其损伤后、E T 1、NO水平有一定程度的改善。同时还发现SS GAG对E T 1、NO水平异常的调节有着浓度依赖关系,随着SS GAG浓度的升高表现出较好的调节作用。SS GAG对血管内皮细胞的保护作用机制为,SS GAG可减轻氧自由基对内皮细胞膜Ca2+通道的激活,抑制氧自由基对细胞膜及线粒体的损伤,减轻高糖及其代谢产物对内皮细胞的直接毒害作用;SS GAG稳定细胞膜,从而减少细胞兴奋时Ca2+离子的内流,降低了由于Ca2+超负荷引起的细胞损伤,调节血管内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶的活性,并降低E T 1,更进一步说明了SS GAG 在维持心血管正常结构和功能,在防治心血管疾病糖尿病血管病变及动脉粥样硬化方面的重要作用。参考文献:

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(编辑:刘霞)

王瑞鑫,等.SS GAG对高糖状态下血管内皮细胞NO释放及ET 1分泌的影响361