miRNA提取与检测

miRNA提取与检测
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD

主要内容
1 2 3 4
什么是miRNA？ miRNA的作用 miRNA的研究路线 miRNA的提取及检测

miRNA的发现
1993年，Ambros和Rosalind C. Lee在线虫中克隆了lin-4基 并不编码蛋白， 因，并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白，而是产生一种小RNA 分子。 分子。这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3‘非 翻译端的特定区域相互作用来抑制lin-14的表达,最终导致lin-14蛋白 质合成的减少,这种现象叫做转译抑制。通过转译抑制，lin-4控制着 这种现象叫做转译抑制。通过转译抑制， 线虫幼虫由L1期向L2期的转化。 期的转化。 同时， 的作用。 同时，Ruvkun也发现了lin-4对lin-14的作用。
The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell,1993

miRNA的奠基者
姓名 Victor Ambros Gary Ruvkun David Baulcombe 单位 麻省大学医学院 麻省总医院 英国哥伦比亚大学 研究对象 秀丽线虫 秀丽线虫 植物

miRNA相关文献数量

miRNA 的相关文献
文章名称
Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity Opposing microRNA families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells Transcriptional Control of Gene Expression by MicroRNAs MicroRNA-206 Delays ALS Progression and Promotes Regeneration of Neuromuscular Synapses in Mice Therapeutic Silencing of MicroRNA-122 in Primates with Chronic Hepatitis C Virus Infection Active turnover modulates mature microRNA activity in Caenorhabditis elegans TUT4 in Concert with Lin28 Suppresses MicroRNA Biogenesis through Pre-MicroRNA Uridylation Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA–mRNA interaction maps The RNA-binding protein KSRP promotes the biogenesis of a subset of microRNAs
期刊
Nature Nature Cell Science Science Nature Cell Nature Nature
时间
2010.2.25 2010.2.4 2010.1.8 2009.12.11 2009.12.4 2009.9.24 2009.8.21 2009.7.23 2009.6
IF

什么是miRNA？
miRNAs（MicroRNAs）是一种不编码蛋白质， 大小约21-23nt的单链小分子RNA。它具有在翻 译水平或转录后水平调控基因表达的功能。 的功能。

miRNA的合成过程
基因组DNA 基因组
Pri-RNA（可达1000nt） （可达 ） Drosha酶 酶 Pre-miRNA（70～100nt） （ ～ ） Dicer酶 酶 成熟miRNA 成熟 RNA 诱导沉 默复合物 调控基因表达 Exportin 5

miRNA与靶mRNA的作用模式
1）二者不完全互补。即二者不完全时配对结合时，主要影响 即二者不完全时配对结合时， 翻译过程， 翻译过程，而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-4 的稳定性无任何影响。 2）二者完全互补。即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶 即二者完全配对结合后， mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR-39/miR-171 的结合， 3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对 时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因 翻译的作用。 翻译的作用。如let-7 果蝇/线虫

miRNA的作用
miRNA miR-1 miR-273 miR-451 miR-1 miR－398 物 种 果蝇 线虫 斑马鱼 小鼠 拟南芥 作 用 敲除导致果蝇在二龄幼虫期死 亡, 肌肉畸形, 体型变小 调控神经元不对称发育. 影响红细胞的成熟 调控心肌分化 抗氧化胁迫 文 献 Genes&Dev Nature PNAS Nature Plant Cell
miRNA的主要作用在胚胎发生，发育时序，器官 的主要作用在胚胎发生，发育时序， 分化，程序性细胞死亡和生长控制（癌症）。 分化，程序性细胞死亡和生长控制（癌症）。

miRNA研究方法
? 生物信息学 ? 构建文库 ? miRNA芯片 ? 荧光定量PCR ? Nothernblot ? 原位杂交

生物信息学
用途 miRNA数据库 miRNA的确认 靶mRNA的确认 数据库/软件名称 miRBase，noncode database…… MiRscan，miRseeker，Mfold…… RNAhybrid， TargetScan，miRanda ……
生物信息学
实验验证

构建文库
总RNA
按片段大小分离（PAGE） 按片段大小分离（PAGE）
5 ’ P-OH 3’ 3’
磷酸酶
5’ HOHO-OH 3’ 3’ 5 ’ P-P 3’ 3’ -P 3’ 3’
生物信息学
T4 RNA 连接酶
5’ HOHO-
T4 多核苷酸激酶
5 ’ P-OH 3’ 3’ -P 3’ 3’
T4 RNA 连接酶
-P 3’ 3’ 酶切位点
酶切位点
逆转录， 逆转录，PCR
-P 3’ 3’ 酶切位点
实验验证
Ban I 消化，再连接 消化，
连接到载体并测序

生产miRNA芯片的公司
Exiqon Affymetrix Febit Agilent Signosis illumina Phalanx LC Sciences CapitalBio

miRNA研究路线
选择样品
提取miRNA 生物信息学 miRNA芯片 荧光定量PCR 文献检索 miRNA 过量表达 靶mRNA 转染 沉默表达

miRNA的提取
裂 解
抽提和吸上清
裂 解
沉淀RNA
柱层析
PAGE电泳
洗 脱
切胶回收

miRNA的提取
?后续实验反应酶活 后续实验反应酶活
纯 度
?无法通过紫外来检测 无法通过紫外来检测
得 率 保 存
? 信息的完整性 ? 无法通过紫外和电泳来检测 ? -20度或 度冻存 度或-70度冻存 度或 ? 相对 相对RNA来说，不易降解 来说， 来说

检测方法——茎环反转录

检测方法——加尾反转录

荧光定量PCR
灵敏度
特异性
内参基因
5S rRNA
Pg级总 级总RNA 级总
单碱基差异
U6
A
B
C