等离子体磺酸化丝素蛋白膜聚四氟乙烯复合小口径人工血管的制备
丝素蛋白的磷酸化及其仿生矿化膜的制备
第39卷 第11期2018年11月 纺 织 学 报Journal of Textile Research Vol.39，No.11Nov.，2018 DOI ：10.13475／j.fzxb.20180101606丝素蛋白的磷酸化及其仿生矿化膜的制备 周 倩，袁久刚，李 澜，王 平，王 强 （生态纺织教育部重点实验室（江南大学），江苏无锡 214122） 摘 要 为制备功能性丝素基仿生矿化材料，将丝素蛋白通过三聚磷酸钠（STP）磷酸化，从而在仿生矿化过程中促进钙离子吸附，利于更多的钙磷酸盐的形成和沉积三探究了体系中pH 值和三聚磷酸钠用量对丝素磷酸化的影响，分析了磷酸化对丝素蛋白二级结构二热性能二粒径及膜力学性能的影响；以磷酸化丝素为原料制备冻干丝素膜，采用交替矿化法，在其表面沉积形成羟基磷灰石（HA）；借助扫描电子显微镜和能量色散X 射线光谱仪，评价了矿化膜表面结构形态和钙二磷元素含量变化三结果表明：在pH 值为10和STP 质量为0.24g 条件下，磷转移量达到 67.1％，且磷酸化丝素膜对阳离子有较好的吸附效果，力学性能较空白样略有下降；经交替仿生矿化处理后，磷酸化丝素膜表面沉积的羟基磷灰石较空白样结构更规整三 关键词 丝素蛋白；矿化膜；磷酸化；羟基磷灰石；仿生矿化中图分类号：TS 195.5 文献标志码：A Phosphorylation of silk fibroin and preparation of bionic mineralization membrane thereof ZHOU Qian，YUAN Jiugang，LI Lan，WANG Ping，WANG Qiang （Key Laboratory of Eco-Textiles （Jiangnan University ），Ministry of Education ，Wuxi ，Jiangsu 214122，China ）Abstract In order to prepare the silk fibroin-based bionic mineralization materials，silk fibroin （SF）was phosphorylated by sodium tripolyphosphate （STP），which can promote the adsorption of calcium ions，and facilitates the formation and deposition of calcium phosphate.The effects of two factors on the phosphorylated silk fibroin were explored by controlling pH and the amount of sodium tripolyphosphate.The secondary structure，thermal stability，particle size，mechanical properties were analyzed.Phosphorylated silk fibroin was freeze-dried to form a membrane，hydroxyapatite（HA）was formed on the surface by alternating mineralization method，and the surface morphology and content of calcium and phosphorus were evaluated by scanning electron microscopy and energy dispersive spectro-metery.The results show that the phosphorylated conditions is pH 10and the 0.24g of STP，phosphorus transfer rate reaches 67.1％，and the adsorption capacity of cationic dyes on the phosphorylated silk fibroin is better，and mechanical properties is slightly lower than the blank.Hydroxyapatite deposited on the surface of the phosphorylated silk fibroin membrane is more regular than the blank sample after alternating bionic mineralization.Keywords silk fibroin；mineralization membrane；phosphorylation；hydroxyapatite；biomimetic mineralization 收稿日期：2018-01-04 修回日期：2018-05-16 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31771039）；江苏省高校青蓝工程资助项目（苏教师［2016］15号）；中央高校基本科研 业务费专项资金资助项目（JUSRP51717A ） 第一作者简介：周倩（1993 ），女，硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三 通信作者：王平，E-mail ：wxwping＠https://www.360docs.net/doc/f010929473.html, 三 丝素蛋白不仅可用作纤维原料，因其良好的生物相容性，在生物材料制备中也有潜在用途［1］三为拓宽丝素在生物材料及医学领域中的应用，不少研 究者采用化学或生物的方法进行丝素改性加工，如 采用辣根过氧化物酶（HRP 酶）催化丝素接枝丙烯 酸，加速矿化中丝素表面钙盐沉积，制备仿生矿化材 料［2］；采用磷酸进行丝素磷酸化，赋予丝素膜抗凝血性，用于制作止血材料等［3］三万方数据
PVDF转膜实验步骤及注意事项
蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序） 转膜实验操作要点 1、SDS－PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于>=20KD蛋白；Tris－Tricine 系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）； 2、甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20％（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）； 3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作）； 4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤）； 5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中； 6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）； 7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色； 8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50％甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可； 转膜实验注意事项 1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量； 2）预电泳处理：低电流跑空胶2～2.5小时，防止胶内杂质污染； 3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液； 4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；
蚕丝蛋白膜
原生态蚕丝蛋白面膜 第五代的五星级面膜 青春的皮肤=弹力十足+净白无瑕。 一面膜的分类：1. 水洗膜 2. 硬膜 3. 软膜 4 无纺布面贴 5. 蚕丝面膜—仿生真皮（蚕丝薄膜）（代替无纺布） 二蚕丝面膜的特点： 本公司蚕丝蛋白膜采用100%高纯蚕丝纤维经世界先进的水织工艺精心制作，蚕丝是不同于麻纤维和毛纤维的一种生物蛋白质，它完全是由蚕的生命化成的，蚕吃进含有水、蛋白质、糖类、脂肪的桑叶后，经过消化分解，最后变成蚕丝，所以蚕丝中含有18种氨基酸，包括8种人体所必需的体内又不能自身合成的氨基酸。蚕丝不但可作药用，更有很高的美容价值。通过纳米技术提取。蚕丝面膜超薄透气，如真丝般服帖。面膜纸里的珠光膜千孔百洞，犹如会呼吸的毛孔，敷在脸庞就像皮肤的第二张脸，自动散发出皮肤的热气和废物。 100%天然蚕丝，不加任何香型，保留原生态特性，高含量蚕丝蛋白无任何破坏，结合于胶原蛋白湿润侵泡。高含量胶原蛋白大量填充到皮肤内 三蚕丝面膜的优势 1.薄如蝉翼，轻柔似水，3重保护—20分钟补水，长效保湿，紧实肌肤，快渗透， 水嫩透白。 2．轻，薄，软，透气性好，敷面时受地心引力小，敷面膜时能达到透明隐形效果，不仅不会滑落，还能防止皮肤被拉扯松垮,同时也不会有普通无纺布面膜所产生的反吸现象。敷面不影响正常活动，省时又方便；被誉为行业中的五星级面膜 3.蚕丝蛋白面膜本是用于医学界处理烫伤的仿生真皮——“蚕丝薄膜”。在美国和日本被广泛用于手术过后伤口敷料、烧伤创面敷料来使用，有助于创面愈合且无刺激，被著称为“人工皮肤”。蚕丝蛋白面膜目前正成为取代无纺布面膜的革命性产品。 4.让每个细胞都得到全方位的照顾，同时随意走动不会掉。 四蚕丝面膜的功效。 1、深层美白：深入肌肤底层，从根本上美白肌肤而无副作用； 2、长效保湿：NMF因子十倍于常规植物或化学保湿剂，给肌肤持续高效 补充水分； 3、抗衰活颜：能激活肌肤细胞，改善微循环，抗衰除皱，活颜悦色; 4、抗氧化：有效抵抗外部污染，保持皮肤PH值平衡，增强肌肤免疫力。
丝素蛋白复合材料的研究进展
丝素蛋白复合材料的研究进展 唐春怡宁晚娥毛文洁林海涛 (广西科技大学生物与化学工程学院，柳州545006) 摘要丝素蛋白作为天然高分子，具有良好的生物相容性、可降解性，在医用材料、食品、化妆品方面作为复合材料组分的研究越来越受到重视。综述了丝素蛋白分别与壳聚糖、纤维素、角蛋白、聚乙烯醇、聚电解质、聚氨酯、无机硅和羟基磷灰石互配所制得的复合材料的研究进展，分析了丝素蛋白复合材料的发展趋势。 关键词丝素蛋白，复合材料，进展 Research progress on silk fibroin composite materials Tang Chunyi Ning Wane Mao Wenjie Lin Haitao (College of Biological and Chemical Engineering,Guangxi Universit of Science and Technology,Liuzhou 545006) Abstract Silk fibroin as a natural polymer,possesses good biocompatibility and biodegradability.The studyon silkfibroin as the component of composites in medical materials,food,cosmetics are paid more and more attention.The re-search progress on the composite materials from the combination of silk fibroin with chitosan,cellulose,keratin,polyviny lalcohol,polyelectrolyte,polyurethane,inorganic silicon,hydroxyapatite were reviewed respectively .and the developingtrend of the silk fibroin composites was analysed. Key words silk fibroin,composite material,progress 近年来，天然高分子和合成高分子材料的应用范围已逐渐发展到临床修复和组织工程支架中。通常适合生物医用的材料必须具有良好的机械强度、良好的生物相容性、适度的生物降解性，尤其用作细胞生长支架时必须具有粘附细胞的能力。聚乳酸等聚酯类合成高分子虽然基本适于用作医用材料，但是其生物相容性不如天然高分子。随着材料科学、复合技术、临床医学以及生物工程等众多学科的交叉发展，尤其是组织工程学科的发展，利用天然高分子、改性合成聚合物或无机物材料之间复合改性的方法已成为制备创伤修复和组织重建功能材料的有效途径之一。 丝素蛋白由Gly、Ala、Ser等18种氨基酸组成，具有两性电荷，是一种天然结构性蛋白[1]。它由蚕茧经脱丝胶而得，是自然界中生物相容性、可生物降解性良好的天然高分子。自20世纪以来，丝纤维已在医用领域中被用作缝合线。然而，丝素蛋白在膜状、管状等酶固定化基体、传感器、药物载体、人工皮肤、人工血管的制备中存在一些缺陷。例如，丝素蛋白经过溶解、成膜、干燥后脆性变大，限制了其实际应用范围。丝素蛋白复合技术的开发及其复合材料的研制，成为克服这些缺点的理想途径，也拓宽了这种蛋白质的应用范围。本研究对几类丝素蛋白复合材料的制备方法及其性能特点进行了总结，并提出了近期的发展方向。 1 丝素蛋白/天然聚合物复合材料 1.1 丝素蛋白/壳聚糖复合材料 在多孔材料如海绵或支架材料的制造中，丝素蛋白分子虽然富含氨基酸的β-折叠晶区，但是非晶区的高收缩率通常使材料容易变形。为保持丝素蛋白的形状稳定性，Wongpanit等[2]将甲壳素晶须作为纳米填充剂，制得了一系列丝素蛋白/甲壳素复合海绵。甲壳素晶须不仅保持了复合海绵的形状稳定性，而且提高了抗压强度。同时，研究表明这种海绵具有多孔性和细胞相容性，有利于L929细胞铺展。Deveci等[3]利用丝素蛋白和壳聚糖通过凝聚法制
western转膜条件
western 转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“ Bio-Rad mini ”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa
丝素蛋白纤维材料
第五节丝素蛋白纤维材料 丝素是一种动物蛋白质，它作为纤维材料，在纺织领域中具有无可比拟的优越性。随着科学技术的进步和人们对蚕丝结构、性质研究的不断深入，丝素在生物材料及医药领域中的应用越来越引人注目。丝素蛋白具有良好的透气性、生物可降解性及生物相容性，其超微结车幻能j融杆伽话府人体的木几伙媚鲴|天lIH，经素譬白可用椎丰术燎缚陷形眼镜、人工皮肤、保健品和护肤品等，还可以与其他材料混合制作人工肌肉。丝素具有独特的氨基酸组成和丝朊蛋白的二级结构，并且，其中部分氨基酸对人体具有保健、医药功效，丝素上所带的甘氨酸，具有降低人体血液中胆固醇浓度的功能，特别是丙氨酸具有促进乙醇代谢的功能，酪氨酸具有预防痴呆症的功能，具有很好的预防和保健作用，符合人们生活水平不断提高的要求。 丝素蛋白，作为生物医药材料的研究正在不断深入，特别是在创面覆盖材料、药物释放材料、活性酶的载体及其生物传感器及智能材料的应用、生物材料、保健材料等方面的研究已取得了一定的进展，还要进一步研究和开发。 一、丝素膜的制备 1．丝素蛋白溶液及丝素膜的制备 取茧壳、废蚕丝按l：100的比例加人含有重量比1％的丝绸精练剂和0．2％无水碳酸钠的溶液中，在94～98。C处理60min，重复操作一次，取出脱胶后的丝素，用蒸馏水充分洗涤，然后提纯。 将提纯的丝素加人氯化钙、乙醇、水(1：8：2摩尔比)的溶液中，加热直至丝素完全溶解，然后，把溶解后的丝素溶液放入透析膜袋中，透析去除钙离子、氯离子，得到再生丝素溶液，再将丝素溶液浇在聚乙烯板上，经低温干燥即制成丝素膜。 这样制得的丝素膜主要结构是丝素I型，不稳定，需用80％甲醇或2．5％戊二醛适当处理，促进膜由丝素I型向丝素Ⅱ型转化，即交联，使膜的水溶性下降，稳定性提高，应用性能得到一定改善。 2．丝素酶膜及药物膜的制备 丝素酶膜的制备有包埋法和共价法两种方法： 包埋法：采用Asakura法制备，将药物、各种活性酶按一定比例加入再生丝素溶液中，混合均匀铺在聚乙烯板上干燥成膜，将酶膜用80％甲醇或2．5％戊二醛进行处理，即制得不溶性的丝素酶膜、丝素药膜。这种方法制得的酶膜、酶分子被包埋在丝素载体内。 共价法：采用Thomas法制备，将丝素膜用2．5％的戊二醛溶液活化后，把各种活性酶溶液按一定比例点在丝素膜上，干燥交联成膜。 二、丝素蛋白作为生物活性物的载体及应用 丝素蛋白的基本用途是，将丝素基础材料用生物技术来固定酶、抗体、抗原、动物细胞、微生物等活性物质。如酶在水中常温常压的稳定状态下，是良好的化学反应的催化剂，但是，酶极不稳定，对热、pH值等外界条件的变化较敏感，遇到一些杂菌极易失活，因此，必须将酶进行固定。丝素材料能够用来固定酶是由丝素独特的结构决定的，丝素非结晶构造中，以酪氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸组成的序列可以称为反应的活性部位，它们含有的大量的活性基团(如羟基、羧基、氨基等)不仅与分子内的氢键结合有关，而且处于反应的活性状态，可以通过共价结合成为酶固定的反应位置。此外，丝素的结晶构造主要由丝素I和丝素Ⅱ组成，当水溶性的丝素I结构向不溶性的丝素Ⅱ结构转化时，不需要任何交联剂，通过改变其溶剂、温度、pH值等外界条件即可实现，基于丝素蛋白的这一特性，其特别适合作为固定化酶的材料。 1．丝素蛋白作为生物活性物的载体
WB的转膜和染色(优质参考)
WB的转膜和染色 凝胶中蛋白的可视化 在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用铜染色法，因为考马斯染色不可逆。考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜效率；不需要转膜，只需观察 SDS-PAGE 结果。 考马斯染色 切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散（溶于水溶液）。为了防止蛋白的扩散，用 40% 蒸馏水、10% 醋酸、50% 甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。 为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比 0.25% 的考马斯亮蓝 R-250，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育 4 小时至过夜。接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到 67.5% 蒸馏水、7.5% 醋酸、25% 甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。 染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。 铜染色法 用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多 30 分钟），然后转移至 0.3 M CuCl2溶液染色5–15 分钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。凝胶可以用 0.1–0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 重复冲洗至完全脱色。根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。 转膜 转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS 提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。 转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。 在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵 > 滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸 > 海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。 湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入了甲醇至终浓度 20%。对于分子量大于 100 kDa 的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为 0.1% 的 SDS。 在半干法转膜中，三明治由滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。 半干转的转膜缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是 48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。
Western 转膜步骤 操作方法
Western 转膜步骤操作方法 Western转膜步骤(建议用伯乐电泳系统来操作完成) 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I. 所需材料：?Xcell SureLock?或Xcell Ⅱ?Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051） ?电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cm*9cm） ?预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003） ?转印垫（Cat. No. EI9052） ?甲醇 ?去离子水 ?转移缓冲液（配方见下文） ?用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘 II. 规格： 转印槽尺寸：14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module容积：约200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot尺寸：约9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。 Ⅲ材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（含20％甲醇的0.5X Towbin） 使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液：去离子水760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675）40 ml (25×未稀释液) 甲醇200 ml 总体积1000 ml 自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱(12mM) 1.45 g 甘氨酸(96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度）200 ml
丝素蛋白做为生物医用材料的研究进展
丝素蛋白作为生物医用材料的研究进展 前言 生物医用材料是以生物医用为目的，用于和活体组织接触，具有诊断、治疗或替换机体中组织、器官或增进其功能的材料。金属材料、合成高分子材料在生物医用材料中多有应用，但金属材料的生物力学性能不匹配，合成高分子材料的生物相容性较差以及生物降解性能可调性差限制了其作为生物医用材料的应用。丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶而得的纤维状蛋白[1]，是一种性能优异的天然高分子材料。丝素蛋白分子结构独特，除具备良好的生物相容性和稳定的生物安全性、出色的机械性能之外还具备吸湿保湿性能、透氧透气性能、细胞附着性。 因此，丝素蛋白在人造皮肤、人工角膜、人工肺、隐形眼镜、酶固定化载体、药物缓释载体、细胞培养基等生物医药领域有诸多潜在应用[2-3]。 1 丝素蛋白的结构组成 丝素蛋白中含有18种氨基酸，其中侧基较小的氨基酸残基，如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等按照一定序列排成较为规则的链段，构成结晶区，构成了丝素蛋白高强度力学的基础；带有较大侧基的苯氨酸、酪氨酸和色氨酸等构成非结晶区，赋予了丝素蛋白较高的弹性和较好的韧性[4-5]。 丝素蛋白有四种分子构象，分别是无规卷曲、sil kⅠ、sil kⅡ、sil kⅢ:丝素蛋白分子链按照α-螺旋和β-平行折叠构象交替堆积构成sil kⅠ型构象，其晶胞属于正交晶系；分子链按照反平行β折叠则形成sil kⅡ型构象；分子链按照β-折叠螺旋形成sil kⅢ型构象，其晶胞为六方晶系。sil kⅠ型丝素蛋白亲水性较好，不宜形成沉淀；sil kⅡ型丝素蛋白则亲水性差，易结晶沉淀，是丝素蛋白的主要晶型。 以β-折叠为基础，丝素蛋白可以形成直径大约为10nm的微纤维，微纤维又可以密切结合程直径大约1μm的细纤维，进而细纤维沿长轴排列可构成直径为10-18μm的丝素蛋白纤维[4]。 2 丝素蛋白的性能特点 丝绸的生产在中国已有千年的历史，真丝绸穿着舒适、手感柔软滑爽、色泽和谐、华丽高贵，同时，还具备保健功能，被称为保健性纤维。蚕丝最早应用在
高分子材料论文(丝素蛋白)
丝素蛋白的相关性质与用途 丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，由蚕茧缫丝脱胶而得到,来源丰富,是一种无生理活性的天然结构性蛋白。而蚕丝是由70％～30％的丝胶蛋白和70％～80％的丝素蛋白以及极少量的色素、碳水化合物等构成的。其中，丝胶蛋白是一种高分子量的球蛋白，其分子结构的支链上亲水基含量较高，链排列不紧密，故易溶于水、稀酸和稀碱，并能被蛋白酶等水解，还具有与明胶类似的凝胶、粘着等特性。丝素蛋白由分子量为5万左右的小肽链和分子量为3O万左右的大肽链组成。其蛋白质的氨基酸组成以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主，与人体的皮肤和头发的角朊极为接近，这成为一些研究中，将丝素用于人造皮肤制造的原因之一。丝素蛋白的结晶部分为较为紧密的B折叠结构，在水中仅发生膨胀而不能溶解，亦不溶于乙醇等有机溶剂，但可在一些特殊的中性盐溶液中发生无限膨胀形成粘稠的液体，透析除盐即可得到丝素的纯溶液。然后通过喷丝、喷雾或延展、干燥等处理，可得到再生丝、凝胶、薄膜或微孔材料等产品。 对丝素蛋白的研究发现，与明胶、清蛋白等普通蛋白相比，其固化结晶方式具有多样化的特点：既可沿用一般天然蛋白的传统固化工艺，采用戊二醛做交联剂；也可以通过一些独特的处理方式来达到目的，如冷冻、热蒸、拉伸及低毒性有机溶剂浸泡等?。特别是采用冷冻干燥，短时高温与乙醇浸泡的协同处理方式，可以很好地保持天然蛋白的高度生物亲和性，并适应药物载体应用中，一些对高温或某种固化剂敏感的负载药物的特殊要求，在应用方面体现出更大的灵活性。 在丝素蛋白的特性研究中，其良好的成膜性是最受人们关注的热点之一。与传统应用较多的天然高分子材料——壳聚糖与胶原等相比，丝素蛋白膜成膜方便性更好，还可以保持高达98％以上的透明性，在高湿状态下的柔韧性与形态保持性能也较为突出，有利于制造一些在临床或实验中要求透明性，以便观测提取生物信息或体内高湿环境使用的生物医学产
western转膜条件
w e s t e r n转膜条件 蛋白来源：RAW264.7总蛋白 蛋白名称（可保密）：一些转录因子 蛋白分子量：40~70KD WB用膜类型、孔径：0.45NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400mA 转膜时间：60~90min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，?曾经因为失误，转了15min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：occludin&AKT 蛋白分子量：65KD&56KD WB用膜类型、孔径：0.45PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100V 转膜时间：60~70min 设备名字是“Bio-Radmini”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：65KD&55KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理） 转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12V 转膜时间：30-40min 设备：“Bio-Radmini” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。? 蛋白来源：293T细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：95KD&35KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90V-110V，控制电流不要超过300mA。转膜时间：70min? 蛋白来源：肿瘤手术标本 蛋白名称（可保密）：转录因子 蛋白分子量：33KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流 转膜时间：150min
Western-blot转膜整个过程
转膜（Trarsmembran） 1 转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2 转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0.2 μm的膜了，如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： p 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； p 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； p 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
western转膜条件
western转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白 蛋白名称（可保密）：一些转录因子 蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“Bio-Rad min i”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理） 转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“Bio-Rad mini” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。 转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本 蛋白名称（可保密）：转录因子 蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流
western blot转膜常见现象及处理方法
1，转膜不充分/过转 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。 2，封闭时间不足 这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。 3，抗体与封闭液有交叉。 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低。 4，抗原-抗体浓度过高 一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。 5，暴光时间过长 降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。 6，抗原-抗体浓度过高 降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。 7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。 8，抗体交叉反应，形成非特异性条带 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有，我也遇到过。关于western 的抗体选择在此提出我的观点：最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，我觉得是实际中的首选。单抗虽然特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度会下降甚至为0，故不稳定。普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际我做的抗体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中我都能做出来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。 9，SDS非特异性结合蛋白条带 使用无SDS转膜液. 10，封闭液有杂质颗粒（静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层） 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在4度静置（最好放在尖底的管子内），这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀，我只吸上面的，下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。
Western 不同转膜方法的取舍
转膜: 小分子量的蛋白半干转效果比较好， 大分子量（100KD）以上建议湿转。 具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。 湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。 显影:转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。 显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？ 解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。 转膜时何为湿法，何为半干法？ 解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？ 解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Westernblot转膜整个过程
转膜（T r a r s m e m b r a n）1转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Westernblot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm 的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose,NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC
Western blot 转膜及膜的选择
Western blot 转膜及膜的选择 转膜： 经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作 画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实 验。 Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜 能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有 其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。 转膜 是对western blot最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。 首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF 膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的western blot用膜有NC膜、PVDF膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表： NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨 高 高 高 率