Hydrophobic interaction chromatography
第八节 疏水层析法
盐析作用增强
洗脱作用增强
排在最左边的离子或盐，盐析作用最强， 洗脱能力最弱；排在最右边的离子或盐， 洗脱能力最强，盐析作用最弱。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分 离 后 蛋 白 质 的 活 性 都 很 重 要 。 (NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl和磷酸盐是疏水层 析分离常用的几种盐。
例如某些蛋白质在水溶液中溶解度很大，分子 的极性较大；在高盐溶液中疏水性明显增大， 溶解度降低，出现盐析现象；在低盐溶液中疏 水性减小，溶解度增大。 因此疏水层析可以通过改变盐溶液的离子强度、 控制蛋白质分子的极性或非极性，使样品中极 性相近的蛋白质组分形成具有一定差异的疏水 分子，然后利用它们之间的疏水特性进行层析 分离。
在分离过程中，溶液中的疏水分子经过疏水层析
介质时，介质上的疏水配基即与它们发生亲和吸
附作用，疏水分子被吸附在介质的配基上面，这
种吸附力的强弱与疏水分子的疏水性大小相关，
疏水性大（极性小）的组分吸附力强，疏水性小 （极性大）的组分吸附力弱，通过改变洗脱液的 盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的 不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下
多缓冲离子交换剂可利用普通的凝胶过滤介质偶 联特殊的离子交换基制备，如Amersham Biosciences公司生产的Polybuffer exchanger PBE系列（PBE118和94）即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte匹配 使用，后者与Polybuffer 96和Polybuffer 74匹 配使用。Amersham Biosciences生产的另一种 多缓冲离子交换剂为Mono P，其离子交换基为 具有不同pKa值的弱碱性氨基。Mono P可与上述 三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅l0um，用作高效 色谱聚焦柱的固定相。
蛋白质分离纯化的原理
蛋白质分离纯化的原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于不同蛋白质之间的化学性质和生物活性的差异。
以下是一些常用的蛋白质分离纯化原理：
1. 尺寸排除层析（Size Exclusion Chromatography）：利用各种不同孔径的柱填料，通过蛋白质在柱中流动时，根据分子量的大小来进行分离。
较大分子量的蛋白质会逐渐流过柱床，而较小分子量的蛋白质则会进入柱床的孔隙中。
2. 亲和层析（Affinity Chromatography）：利用蛋白质与特定配体之间的亲和性进行分离。
通常在柱填料上固定对目标蛋白质有选择性结合的配体，通过向柱中加入蛋白质混合物，目标蛋白质可以与柱填料上的配体结合，而其他非特异性结合的蛋白质则会迅速流出。
最后，通过改变条件，如改变pH或加入竞争性配体，可以使目标蛋白质从柱上解离。
3. 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）：利用蛋白质与固定的离子交换基团之间的静电相互作用进行分离。
在柱填料上固定有阴离子交换基团的柱填料，当蛋白质混合物从柱中通过时，具有不同电荷的蛋白质会与柱填料上的离子交换基团发生相互作用，从而实现分离。
4. 疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography）：利用蛋白质与柱填料上的疏水基团之间的疏水相互作用进行分离。
在柱填料上固定有疏水基团，当蛋白质混合物从柱中通过时，具有较强疏水性的蛋白质会与柱填料上的疏水基团发生相互作用，从而实现分离。
这些方法经常结合使用，以提高对目标蛋白质的纯化程度和产量。
在实际应用中，选择适当的分离纯化方法还需要考虑蛋白质性质、产量要求以及研究目的等因素。
04第五章__疏水层析
疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC) 从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸 吸 附层析一类。 附层析 疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离 生命物质的依据是一致的，即: 视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力 疏水力差 疏水力 异性大小，将有效成分分离出来。
1．亲水性吸附剂 基质主要是： 交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) 配体是： 苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的 苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂
2．非亲水性吸附剂 基质有： 硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等 配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等。 二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。
(如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4 或2mol／LNaCl，以使样品中的 有效成分变性，并能与固定相很好地相互吸附。)
把此样品溶液徐徐加入固定相(使有效成分与固定相之 间作用0.5-1h)后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐 浓度的平衡缓冲溶液洗脱， 与此同时，要用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液， 并对收集的每部分溶液进行检测。 固定相进行再生处理后可重复使用。
二、吸附剂
固定相 由基质 配体 基质和配体 基质 配体(疏水性基团)两部分构成。 配体对疏水性 疏水性物质具有一定的吸附力 吸附力。 疏水性 吸附力 基质则有亲水性和非亲水性之分。 亲水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成 的固定相，称亲水性吸附剂。 疏水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成 的固定相，称疏水性吸附剂。
第二节 操作与应用
一、层析柱的制备 1．层析柱规格 所使用层析柱之规格与普通层析的相似 2．固定相 在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)Sepharose Cl-4B吸附剂作固定相。 苯基-Sepharose Cl-4B适合于分离纯化与芳香族化合物 具有亲和力的物质。 辛基-SepharoseCl-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的 物质新鲜鸡胗(除去结缔组织)切成1cm3小块， 置组织捣碎机中，加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol／L TrisHCl，pH8.0，2mmol／L EDTA，1mmol／Lα-巯基乙醇)高速匀浆三 次(30s／次)， 离心(8000 r／min，4℃，0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重 复抽提一次)，合并抽提液， 加硫酸铵盐析(pH8.0，60％饱和度)，除去大量杂蛋白， 上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0)，离心收集含有效成分 的沉淀物， 加蒸馏水悬浮，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0，令其 缓慢溶解， 经透析，离心得到溶液
疏水相互作用色谱法
疏水相互作用色谱法
疏水相互作用色谱法（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是一种利用样品中溶液中非极性（疏水）相互作用与静
电吸引作用的分离方法。
在HIC中，样品在高盐浓度条件下，通过疏水性固定相与非极性样品分子之间的相互作用来实现分离。
HIC的原理是利用样品分子之间和样品分子与固定相之间的疏水相互作用来进行分离。
在高盐浓度的条件下，溶液中水分子与溶剂中的盐离子形成水化层，减少了水分子与样品分子之间的水合作用，使得样品分子能够更容易与疏水性固定相发生相互作用。
相对疏水性的样品分子在固定相上停留时间较长，而相对亲水性的样品分子则较快地从固定相上洗脱。
通过调整盐浓度和pH值，可以控制疏水相互作用的强弱，实现对样品分
子的选择性分离。
HIC广泛应用于生物分子的分离和纯化，特别适用于分离非极性的蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子。
它在制药、生物工程和生物医学研究等领域具有重要的应用价值。
与其他色谱方法相比，HIC具有较好的选择性、温和的条件和较高的纯化效率，因此受到广泛关注和应用。
完整版第九节疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。
此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。
目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。
而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。
当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
生物大分子分离纯化技术
5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
生物大分子分离纯化技术
三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
生物大分子分离纯化技术
四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水相互作用层析和反相层析
疏水相互作用层析和反相层析疏水相互作用层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）和反相层析（reverse phase chromatography，RPC）是两种常用的分离技术，广泛应用于生物制药、蛋白质纯化和分析等领域。
疏水相互作用层析是基于样品中疏水性成分与疏水性基质之间的相互作用而实现分离的一种方法。
在HIC中，固定相通常是由疏水性聚合物或疏水性修饰的材料构成，而样品溶液中的疏水性分子则会与固定相发生相互作用，从而被滞留在柱中。
相比于其他色谱技术，HIC具有操作简单、分离效果好、易于工业化生产等优点。
同时，HIC还可以在非变性条件下进行，保留了样品的天然构象和生物活性。
反相层析是一种常用的液相色谱技术，其分离原理是基于样品中成分与固定相之间的亲疏水性差异。
在RPC中，固定相通常是由亲水性材料表面修饰成疏水性的材料构成，而样品溶液中的亲水性分子则会与固定相发生相互作用，从而被滞留在柱中。
与HIC相比，RPC 在生物大分子的纯化中更为常用，尤其适用于蛋白质和多肽的分离。
RPC不仅可以根据亲疏水性差异实现分离，还可以根据分子的大小、电荷和极性等性质进行选择性分离。
疏水相互作用层析和反相层析在分离技术中具有广泛的应用。
它们可以用于蛋白质的纯化和富集，从而提高后续分析的灵敏度和准确性。
此外，它们还可以用于药物研发过程中的药物分离和纯化，以及生物制药工艺中的产品纯化。
在研究领域，疏水相互作用层析和反相层析也被广泛应用于蛋白质相互作用的研究，如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-药物相互作用等。
虽然疏水相互作用层析和反相层析都是基于亲疏水性的分离原理，但它们在柱填充物和操作条件上存在一定的差异。
疏水相互作用层析中，常用的固定相材料有羟基磷灰石、聚乙烯醇、硅胶等，操作条件通常在中性或弱酸性条件下进行。
而反相层析中，常用的固定相材料是疏水性的C18烷基硅烷，操作条件通常在酸性或中性条件下进行。
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Hydrophobic interaction chromatography • What is hydrophobic interaction chromatography?
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Purification of rhGM-CSF from inclusion bodies produced in E. coli
Renatured rhGM-CSF
HIC
Phenyl Sepharose FF
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Why should I use it?
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Complementary to ion exchange (IEX) and gel filtration (GF) Mild, non-denaturing High selectivity High recovery Concentrating technique
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What is it?
Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules aห้องสมุดไป่ตู้cording to their hydrophobicity
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Purification of recombinant α-mannosidase from Pichia pastoris
Technique Purification factor Ultrafiltration
UF
Y.-F. Liao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28348
Washing out unbound material
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution
Non-bound proteins
Abs
Conc. salt
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HIC vers 03 Aug 2000
Elution
The Hofmeister series
Increasing precipitation ("salting-out") effect Increasing chaotropic ("salting-in") effect
Anions: PO43-, SO42-, CH3·COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCNCations: NH4+, K+, Na+ Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+
Column: Sample: Load: Eluent A: Eluent B: Flow: BPG 300/500 packed with Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) 80 l yeast supernatant 0.36 mg EGF/ml media 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 + 0.5 M ammonium sulphate 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 300 cm/h during loading, 50 cm/h during elution
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Hydrophobic interaction chromatography
• What is hydrophobic interaction chromatography?
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• Underlying principles • How to do it
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Mild/stabilizing Very high selectivity Complements IEX, GF and affinity
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Hydrophobic interaction chromatography
• What is hydrophobic interaction chromatography? • What is it used for? • Underlying principles • How to do it
AIEX
Q Sepharose FF
63
HIC
Phenyl Sepharose HP
622
• 10 times purification • 82% yield
GF
Superdex 200 p.g.
719
7
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Capture of recombinant human EGF
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HIC vers 03 Aug 2000
Separation of α2-macroglobulin isomers
A 280
A280
Na2SO4
Na2SO4 1.0 M
0.04 0.04 AU AU
1.0 M
Sample: 60 µg active and 60 µg methylamine-treated, inactive α2-macroglobulin Column: Phenyl Sepharose High Performance packed in HR 5/5
Removes buffer constituents (GuanidineHCl, Berol 185, glutathione etc) •Purification factor: ca 2 •Recovery: 92% of activity •Concentration factor: ca 5
Phenyl
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HIC vers 03 Aug 2000
First trial, general conditions
• • • • •
Binding buffer: 50 mM phosphate buffer pH 7.0 with 1-1.5 M ammonium sulphate Elution buffer: 50 mM phosphate buffer pH 7.0 Gradient: 10-15 column volumes Flow rate: according to manufacturer's instructions Gel: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)
Abs More strongly bound proteins
Conc. salt
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HIC vers 03 Aug 2000
Hydrophobic interaction chromatography
• What is hydrophobic interaction chromatography? • What is it used for? • Underlying principles • How to do it
A280 mS/cm 100 3.0
rhEGF
2.0 50 1.0
0.0 50 100 liter
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HIC vers 03 Aug 2000
Purification of recombinant phosphatase
Sample: Column: Buffer A: Buffer B: System: 170 ml eluate containing rPhosphatase from a DEAE Sepharose run, adjusted to 1.6 M (NH4)2SO4, pH 7.0 HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose High Performance 25 mM Tris-HCL, 1.4 M (NH4)2SO4, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 25 mM Tris-HCL, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 ÄKTAprime, 5.0 ml/min (150 cm/h), 0-100%B in 20 CV
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Main stages in HIC
•
Equilibrate the gel and the sample to binding conditions Apply the sample Wash out contaminants Elute
• • •
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HIC vers 03 Aug 2000
Interaction principle
Ligands Water molecules Surface exposed hydrophobic groups Solute
Water molecules in bulk