蛋白质糖基化的研究和进展教育课件
蛋白质糖基化类型与点
1.2蛋白质糖基化类型与特点蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰,是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质,和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。
研究表明,70%人类蛋白包含一个或多个糖链,1%的人类基因组参与了糖链的合成和修饰。
哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为三种:N-糖基化、0-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。
大多数糖蛋白质只含有一种糖基化类型,但是有些蛋白多肽同时连有N-糖链、O-糖链或糖氨聚糖。
(l) N-糖基化:糖链通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH基共价连接,将这种2糖基化称为N-糖基化。
N-连接的糖链合成起始于内质网(ER),完成于高尔基体。
N-糖链合成的第一步是将一个14糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的特征序列为Asn-X-Ser/Thr(X代表任何一种氨基酸)的天冬酰胺上,天冬酰胺作为糖链受体。
核心寡聚糖是由两分子N-乙酰葡萄糖胺、九分子甘露糖和三分子葡萄糖依次组成,第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合,当ER膜上有新多肽合成时,整个糖链一起转移。
寡聚糖转移到新生肽以后,在ER 中进一步加工,依次切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖。
在ER形成的糖蛋白具有相似的糖链,由Cis面进入高尔基体后,在各膜囊之间的转运过程中,原来糖链上的大部分甘露糖被切除,但又由多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子,形成了结构各异的寡糖链。
血浆等体液中蛋白质多发生N-糖基化,因此N-糖蛋白又称为血浆型糖蛋白。
(2) O-糖基化:糖链与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的自由OH基共价连接。
0-糖基化位点没有保守序列,糖链也没有固定的核心结构,组成既可是一个单糖,也可以是巨大的磺酸化多糖,因此与糖基化相比,0-糖基化分析会更加复杂。
0-连接的糖基化在高尔基体中进行,通常第一个连接上去的糖单元是N-乙酰半乳糖,连接的部位为Ser、Thr或Hyp的羟基,然后逐次将糖残基转移上去形成寡糖链,糖的供体同样为核苷糖,如UDP-半乳糖。
糖基化蛋白质组学
糖基化蛋白质组学糖基化蛋白质组学是一种新兴的研究领域，它研究的是蛋白质与糖基化修饰之间的关系。
糖基化是一种常见的蛋白质修饰方式，它可以影响蛋白质的结构和功能，从而影响细胞的生理和病理过程。
糖基化蛋白质组学的研究可以帮助我们更好地理解糖基化修饰对蛋白质的影响，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
糖基化是一种常见的蛋白质修饰方式，它是指糖分子与蛋白质分子之间的共价结合。
糖基化修饰可以发生在蛋白质的氨基酸残基上，也可以发生在蛋白质的糖基上。
糖基化修饰可以影响蛋白质的结构和功能，从而影响细胞的生理和病理过程。
例如，糖基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、溶解性、活性和亲和力等性质，从而影响蛋白质的功能和相互作用。
糖基化蛋白质组学是一种研究糖基化修饰对蛋白质组的影响的新兴领域。
糖基化蛋白质组学的研究可以帮助我们更好地理解糖基化修饰对蛋白质的影响，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
糖基化蛋白质组学的研究可以从以下几个方面展开：1. 糖基化蛋白质的鉴定和定量糖基化蛋白质的鉴定和定量是糖基化蛋白质组学研究的基础。
目前，糖基化蛋白质的鉴定和定量主要依靠质谱技术。
质谱技术可以通过分析蛋白质的质量和荷电性等性质来确定蛋白质的序列和修饰。
糖基化蛋白质的鉴定和定量可以帮助我们了解糖基化修饰对蛋白质的影响，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
2. 糖基化蛋白质的功能研究糖基化修饰可以影响蛋白质的结构和功能，从而影响细胞的生理和病理过程。
糖基化蛋白质组学的研究可以帮助我们更好地了解糖基化修饰对蛋白质的影响，从而揭示糖基化蛋白质在细胞生理和病理过程中的作用。
例如，糖基化蛋白质可以参与细胞信号转导、细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等过程，从而影响细胞的生理和病理状态。
3. 糖基化蛋白质与疾病的关系研究糖基化蛋白质与疾病的关系研究是糖基化蛋白质组学研究的重点之一。
糖基化蛋白质可以参与多种疾病的发生和发展，例如糖尿病、癌症、神经退行性疾病等。
糖基化工程ppt课件
为了探讨寡糖合成加工过程中的控制因素，人们作了大量的实验。 从不同种类、不同组织中产生的同一种蛋白，对其寡糖分析有很 大的差异。在上述讨论中，特定的N-连接寡糖的合成取决于各种 糖基化酶的表达水平，在不同的细胞和组织中，这些酶的相对活 性的差异形成不同的寡糖结构。虽然大多数细胞都有能力将相同 蛋白连接的寡糖加工成很多不同的结构，如高甘露糖型、复合型 等。实际上，单个糖基化位点趋于有一个特征性的寡糖结构，而 且可与同一蛋白的其它位点的糖链相区别，其中一个原因是蛋白 质在细胞中定位。因此，留在NER上的糖蛋白，没有接触Golgi体 酶系，只有高甘露糖型。排出Golgi的糖蛋白由于其大小、构型 等方面的因素从而形成不同的糖链结构。
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CHO细胞表达细胞粘附分子
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1.3 糖基的合成
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糖蛋白到达Golgi体后，那些最终成为复合性结构的寡糖， 通过N-已酰葡萄糖胺转移酶I添加N-已酰葡萄糖胺残基，由 Golgi体内的α-甘露糖酶II切除两个甘露糖残基，随后由 GlcNAc转移酶加入天线上的GlcNAc残基。同时，Fuc转运酶可能 转运一个Fuc到糖链的GlcNAc上。复合型寡糖的合成最后步骤发 生在Golgi体的反面囊腔中。此时Gal或SA转运酶催化添加Gal和 SA。最后新合成的糖蛋白离开Golgi体，运送到最终目的地。 最终的寡糖结构在很大程度上取决于糖蛋白在处理过程中与糖 基化酶和糖基化转运酶的作用顺序，以及它们特异性作用，许 多不同的酶催化不同的反应，最后形成最终的寡糖结构。
糖基化工程
糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。糖 基化工程是通过对蛋白质表面的糖链进行改造，对 蛋白质的结构和功能有重要影响，从而改良蛋白质 性质的一种技术。
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当基因工程和蛋白质工程药物的生产正如火如荼时，人 们惊奇地发现，很多糖蛋白药物在不同细胞中表达所得的产物， 其免疫原性、半衰期、生物活性等各不相同，原因就是糖基化 的不同。如何使表达产物进行合适的糖基化这一问题的提出， 促使了糖基化工程（glycosylation engineering）这一新领 域的产生。糖基化工程的研究，主要集中于糖蛋白糖链功能的 分析和糖基化表达体系的构建。如科学家将昆虫细胞改造后， 可表达正确的糖链；日本Kirin公司则准备改造酵母。可以预 见，糖基化工程研究在理论上可阐明糖链的功能，在实践上则 可为解决基因工程药物的免疫原性、生物活性及药物设计等问 题提供指导。
蛋白质糖基化的研究及进展
展
望
由于糖蛋白本身的复杂性， 由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须 采取多元化的研究策略和技术， 采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不 断的被采用。 断的被采用。 随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断 随着各种分离技术的不断发展， 翻新。 翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热 点
蛋白质糖基化的研究策略
1.凝胶技术与质谱联用 凝胶技术与质谱联用
与磷酸化之间存在 “阴阳”关系 可以 被筛选和鉴定
细胞组织
双向电泳
切割 酶切
质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析
2.非凝胶技术与质谱联用 非凝胶技术与质谱联用
O-β-GlcNA pr 亲和层析 母离子扫描 366 数 据 库 搜 索 鉴 定
3 蛋白质糖基化常用研究方法
糖基化位点分析 糖基化蛋白分析 糖链分析
因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需 要多种方法组合完成。
单糖分析 糖链释放 蛋白酶水解 去糖基蛋白 糖链 氨基酸分析
糖蛋白
糖基肽
肽链
糖链释放
氨基酸序列分析
去糖基肽链
糖链
分馏/纯化 结构分析 酶解 糖基肽/寡糖多糖图谱 质谱 核磁共振
Mana1-6(Mana1-3)Manβ Mana1-2Mana1-6 (Mana1-3)Manβ 较强 最强
4 糖基化蛋白质的分离技术
缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH， 较弱 6-OH取代基团的Mana（α1-6）
Galectin LEC-6
半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的 可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且 具有分枝结构的N-连接糖链
糖基化及免疫博士课课件
保护糖蛋白分子或免疫分子。
在内质网中, 糖基化酶, Mannosidase I, Glucosyl Transferase 帮助未折叠好的糖蛋白进
一步折叠, 而错误折叠 或未包装好的糖蛋白将在内质网中降解。
糖基化及免疫博士课
Zhang XL*, et al. Microbes & Infection 2011
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6、 糖基化与免疫逃逸
O-糖苷介导免疫逃逸：
前列腺病人肿瘤细胞表面的粘蛋白MUC1 core 2
O 糖苷抵抗NK巨细胞介导的细胞毒作用，抑制NK细胞分泌颗粒酶（
granzyme B）， 并干扰肿瘤凋亡分子（TRAIL)接近肿瘤细胞，而
HCVE1的免疫原很弱,其糖链使病毒逃逸机体的免疫攻击,降低细胞免疫应答,
缺失病毒E1的某些N-糖苷后使病毒的免疫原性提高,可作为增强免疫原的新
型HCV疫苗!
Zhang XL* et al, vaccine, 2007, 15: 6572-6580
糖基化及免疫博士课
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改变N-糖基化可影响细胞因子IL-24的免疫功能
N-糖基化对IL-24抗伤寒沙门菌感染功能是必需的
IL-24N-糖基化突变体保护
小鼠抵抗感染功能下降
IL-24N-糖基化突变体刺激IFN-γ能力下降
Zhang XL*, et al, Eur J Immunol 2009
糖基化及免疫博士课
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改变细胞因子糖基化影响其介导的免疫功能
N-糖基化对IL-24抗TB感染功能是必需的
召开了糖免疫学的国际讨论会
糖基化引发蛋白质的折叠及功能的研究
糖基化引发蛋白质的折叠及功能的研究随着生物技术的迅猛发展，人们对蛋白质的研究也越来越深入。
糖基化是一种蛋白质后修饰的形式，它可以影响蛋白质的结构和功能，对生物学和医学有着重要意义。
本文将从糖基化的概念、机制以及影响蛋白质折叠和功能等方面进行探讨。
一、糖基化的概念糖基化是指糖类分子与蛋白质分子结合的化学反应。
在生物体内，糖基化反应一般会在未修饰的蛋白质分子中的羟基、胺基或硫基上发生，绑定到这些官能团上的糖会形成糖基化产物。
糖基化产物可能具有新的生物学活性，例如增强或降低蛋白质的稳定性、增强或减弱蛋白质的活性、提高或降低蛋白质的识别性等。
二、糖基化的机制糖基化反应可以分为两种类型：非酶促糖基化和酶促糖基化。
非酶促糖基化是指糖类分子和蛋白质分子在没有酶的催化下发生结合反应。
这种类型的反应通常是非特异性的，也就是说，糖类分子可能与蛋白质的各种官能团结合，形成多种不同的糖基化产物。
而酶促糖基化则是指一类专门催化糖基化反应的酶，这类酶被称为糖基转移酶。
糖基转移酶通常会在一定的底物（包括糖类和蛋白质）识别和结合之后，将底物上的糖基转移到其他底物上，形成新的糖基化产物。
酶促糖基化通常比非酶促糖基化更加特异性，可以产生特定的糖基化产物。
三、糖基化对蛋白质折叠和功能的影响糖基化反应可以改变蛋白质分子的化学性质，影响蛋白质的结构和功能。
糖基化反应可能影响蛋白质的折叠状态。
蛋白质的折叠是指蛋白质分子在特定条件下（包括温度、pH值等）下形成的三维空间结构，即蛋白质的构象。
如果蛋白质的糖基化产物不容易呈现正确的构象，那么可能会影响蛋白质的稳定性，加速其降解或使其失去活性。
在糖尿病患者中，糖基化产物可能增加胰岛素信号转导通路中的蛋白质的折叠状态，导致胰岛素阻抗。
糖基化反应还可能影响蛋白质的功能。
对于酶来说，糖基化产物可能影响酶活性，从而改变其对底物的催化效率。
对于结构蛋白来说，糖基化产物可能影响其与其他蛋白质的相互作用，影响其在细胞内的定位和识别等。
蛋白质糖基化修饰研究进展
期末考核课程：Glycobiology蛋白质糖基化研究进展姓名：***学号：**********班级：生命科学与技术基地班时间：2016.1.1蛋白质糖基化研究进展马春（西北大学生命科学学院，陕西西安，710069）摘要：糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。
本文综述了糖基化的分类、在生命体中的作用、糖基化位点分析及糖链分析方法等。
关键词：蛋白质糖基化;分析方法生命体是一种极其复杂且动态变化的有机系统，不断发生着各种生物化学反应，进行新陈代谢，并协调、控制各部分生物功能的发挥。
蛋白质是生命体内各种生化反应的载体和生物功能的执行者，如分子识别、信号转导、免疫应答等。
蛋白质功能的正常发挥保证着生命有机系统正确、有序、高效地运转。
基因在转录和翻译后产生具有特定序列的氨基酸长链，即蛋白质的前体，再经过共价修饰、折叠、卷曲并形成特定的空间构象后，成为具有正常功能的成熟蛋白质。
而共价修饰在这个成熟过程中发挥着重要的调节作用。
不仅如此，蛋白质成熟后的许多关键功能，特别是涉及控制、调节等方面的功能，都是通过共价修饰实现的。
这些发挥重要功能的共价修饰，就是蛋白质翻译后修饰它们使蛋白质的结构更为合理、功能更为完善、调节更为精细、作用更为专一。
翻译后修饰可以发生在蛋白质的任一位点上，并且种类繁多，目前有文献报道的翻译后修饰就多达数百种，常见的有碟酸化修饰、糖基化修饰、乙醜化修饰等。
蛋白质糖基化修饰是最广泛、最复杂、最重要的翻译后修饰之一，据推断有超过的蛋白质都发生了糖基化修饰。
这些糖蛋白广泛分布于生命体中，特别是在细胞膜上和体液中含量丰富，大部分膜蛋白和分泌蛋白都是糖蛋白。
糖基化修饰不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。
蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用3
蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用3张倩 杨振 张艳贞 王爱丽 安学丽 晏月明(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)摘 要: 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体的许多生命活动。
随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质糖基化研究越来越受到广泛的重视。
本文介绍了蛋白质糖基化修饰的研究内容与方法,并综述了最近的研究进展。
关键词: 糖基化 糖蛋白 糖链 质谱 糖基化工程Detection of Protein G lycosylation Modif ications and Its ApplicationsZhang Qian Yang Zhen Zhang Yanzhen Wang Aili An Xueli Yan Yueming(College of L i f e S cience ,Capital N ormal Uni versit y ,B ei j ing 100037)Abstract : G lycosylation is one of the most important post 2translational modifications of the protein ,which is related to many activities of life.With the development of the proteomics ,the studies of the glycosylation are atta 2ched more and more importance.This article has introduced the approaches for determination of the specific 2glycosy 2lation 2site ,the assay of sugar chains of the glycoprotein ,the glycosylation engineering ,and reviewed the progresses in their applications.K ey words : G lycosylation G lycoprotein Sugar chain MS G lycosylation engineering 糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰[1]。
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2 与凝集素联用的检测方法
蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育， 再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入 显色试剂进行检测。
6 质谱在蛋白质糖基化研究中的应用
1 位点分析 a 特征离子检测 寻找糖基特征离子，进而确定糖肽 如 NacGlc 特征离子为 m/z 204
b 酶处理前后酶解肽谱比对 在TIC图上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽， 根据去糖肽的相对分子量及MS/MS图确定糖基化位点
2．N-糖基化: 糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处
3．GPI-Anchor糖基化: 蛋白质通过肽链的C端共价连接 的 糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
3 蛋白质糖基化常用研究方法
糖基化位点分析
糖基化蛋白分析
糖链分析
因为糖链的复杂性，很难通过糖蛋单白 一的方法进行序列测定等研究，需
要多种方法组合完成。
单糖分析
糖链释放
蛋白酶水解
去糖基蛋白
氨基酸分析
糖链
糖基肽
肽链
糖链释放
氨基酸序列分析
去糖基肽链
糖链
分馏/纯化 结构分析 酶解 糖基肽/寡糖多糖图谱 质谱 核磁共振
蛋白质糖基化的研究策略
1.凝胶技术与质谱联 “阴阳”关系 可以
被筛选2.和非鉴凝定胶技术与质谱联用
“功能糖组学” 研究目标
阐明由蛋白质-糖链 所介导的细胞通讯机 基因组计划提制供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需 要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化 是最主要的翻译后修饰之一。
糖组学研究的重心便是蛋白 质糖基化的研究。
蛋白质糖基化研究的基本目标是：
基因组信息
寻找编码糖蛋白的基因
寻找糖基化位点
糖基化位点信息
解析糖链及糖基化肽段的结构 研究糖基化的功能
结构信息 功能信息
现代分子生物学的中心法则：
蛋白质的糖基化在生物体是广泛存在的。 真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化
糖链的多样性和复杂性
“连接方式异构体” “分枝形成”
2 蛋白质糖基化的分类
1．O-糖基化: 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr 等侧链的羟基处
蛋白质糖基化的研究和 进展PPT讲座
1概 述
1988年，牛津大学的 Raymond Dwek 在 Annual Review of Biochemistry上发表题为 “糖生物 学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的 诞生。
美国的新罕布什大学 首先开展了“糖组学” （glycomics) 的研究
美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研 究
2 糖链组成，连接顺序及连接方式的分析 ESI 串联质谱可以MS 和MS/MS谱图进行解析
质量数推断对于同质量异构的糖基无法分辨（Man/Glu) 利用 外切糖苷酶处理后，再分析
具体的糖链结构还需进行衍生化。（甲基化，还原胺化） 增强疏水性和离子化能力
离子肼和FTICR在分析糖链结构方面有其独特优势 Cancilla 利用碱性降解和MALIDY-FT-MS 成功分析了寡糖 连接方式
质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析
数
O-β-GlcNA pr
亲和层析
母离子扫描 366
据 库
搜
3.O-β-GlcNAc 糖基化研究
索 鉴
定
4 糖基化蛋白质的分离技术
是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链 具有高亲和性的植物凝集素， 同时也能结合复杂型 蛋白质混合物 的N-连分接离糖纯链化及糖双蛋分白枝的复糖杂肽型的N-连接糖链
Q-TOF-MS 高分辨 高 灵敏度 高精确度 母离子扫描 HexNAc+ (m/z 204) HexHexNAc + (m/z366)
MALDI-TOF-MS 能方便的 检测出衍生或未衍生的寡糖 可以直接分析分子质量较大 的糖蛋白，并分辨不均一性
展
望
由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须 采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不 断的被采用。
PNA
花生凝集素是组织化学中用于检测T抗原的。 T抗原在黏蛋白中广泛存在（如血型糖蛋白A） 可广泛结合于存在O-连接糖链的T抗原上
5 糖基化蛋白的检测技术
1 荧光染色检测法 丹磺酰肼 检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白 绿色荧光蛋白 即 Pro-Q Emerald 300 染色剂 SYPRO Rubby Pro-Q Emerald 488
随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断 翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热 点
主要参考文献
1 夏其昌 曾嵘等 蛋白质化学与蛋白质组学 科学出版社 2004 2 Hirabayashi J ,etc JCB 2002,771(1-2):67-87 3 Hirabayashi J ,etc Trends Glycosci Glyco ,2000,20(6):286-287 4 Courtenay Hart etc Electrophoresis 2003, 24, 588–598 5 Cristian I. Ruse etc Anal. Chem.2002, 74,1658-1664 6 STEVEN A etc Protein Science (1993), 2, 183-196. 7 Benjamin L. etc Anal. Chem.2002, 74,6088-6097 8 Wei Li,etc Anal. Chem.2002, 74,5701-5710 9 Rong Zeng,etc Eur. J. Biochem. 266, 352-358 (1999) 10 Pauline M.etc Proteomics 2001, 1, 285–294 11Schulz BL etc Anal Chem,2002,74:6088-6097 12Robbe C, etc Biochem J 2004 Dec1 ; 384：307-16 13Suzuki ,etc, Anal Chem, 2006 Apr 1;78(7):2239-2243 14Sparbier K，etc J Biomol Tech. 2005 Dec;16(4):407-13 15Fukui etc, Nat Biotechol,2002,20:1011-1077
凝集素
ConA
Mana1-6(Mana1-
较
3)Manβ
强
Mana1-2Mana1-6
最
(Mana1-3)Manβ
强
缺少三甘露糖核心结 构或含有阻碍性的3- 较 OH，6-OH取代基团的 弱 Mana（α1-6）
Galectin LEC-6
半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖 于金属离子的可溶性凝集素 很多生物具有保守 性 倾向于结合包含半乳糖且具有分枝结构的N连接糖链