细胞培养8
cck8细胞增殖实验原理
cck8细胞增殖实验原理CCK-8细胞增殖实验原理引言：细胞增殖实验是生物学和医学研究中常用的一种实验方法，用于测定细胞的增殖能力。
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖检测试剂，通过测量细胞中的还原型CCK-8转化为溶液中的发色体，从而间接反映细胞增殖的能力。
本文将介绍CCK-8细胞增殖实验的原理及其应用。
一、CCK-8细胞增殖实验原理：CCK-8细胞增殖实验原理基于细胞代谢产物对试剂的还原作用。
CCK-8试剂中含有一种能被还原的黄色酶，当细胞活力高时，细胞内的代谢产物会将CCK-8试剂还原为有色产物。
实验原理如下：1. 细胞培养：将待测细胞接种于培养皿中，培养至适当的细胞数和状态。
2. 细胞处理：根据实际需求，对待测细胞进行处理，例如给予药物处理、基因转染等。
3. CCK-8试剂处理：将CCK-8试剂加入培养皿中，与细胞共同孵育一段时间。
4. 反应终止：孵育一段时间后，加入一种酸性溶液终止反应，阻止进一步的细胞代谢反应。
5. 测量吸光度：将培养皿中的溶液转移到微孔板中，使用酶标仪或多功能酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。
6. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞增殖的相对程度，比较不同处理组的细胞增殖能力。
二、CCK-8细胞增殖实验的应用：CCK-8细胞增殖实验广泛应用于生物医学研究、药物筛选、细胞毒性评价等领域。
以下列举几个常见的应用场景：1. 药物筛选：CCK-8实验可用于评估药物对细胞增殖的影响。
将细胞分为不同处理组，给予不同浓度的药物处理，通过测量吸光度值，评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用。
2. 细胞毒性评价：CCK-8实验可用于评估化合物、材料或环境因素对细胞生存能力的影响。
通过测量吸光度值，判断待测物质对细胞的毒性程度。
3. 细胞增殖动力学研究：CCK-8实验可用于研究细胞增殖的动力学过程。
通过连续测量不同时间点的吸光度值，得到细胞增殖曲线，进一步分析细胞增殖速率和生长特性。
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，该方法通过评估细胞内脱氢酶的活性来间接反映细胞的代谢活性。
其操作步骤如下：1.常规细胞培养选择要测试的细胞系，并在合适的培养基中进行培养。
通常使用细胞培养瓶或培养皿，并在37摄氏度的培养箱中保持恒定的温度。
确保培养基中含有足够的养分和补充物，以支持细胞的正常生长和代谢。
2.细胞计数和均匀分布细胞生长到适当的密度后，使用显微镜和细胞计数板计数细胞数目。
根据需求，将细胞以适当比例分装到不同的瓶中，再将细胞以适当比例分装到96孔板中，以保证每个孔中的细胞数量和均匀分布。
3.平台适应性试验在进行正式的实验前，可以进行平台适应性试验。
为此，将不同细胞浓度的细胞悬液加入到96孔板中，并使用CCK-8试剂进行处理。
根据CCK-8处理后的细胞的吸光度读数，选择适当的浓度范围和时间点进行后续实验。
4.细胞处理在进行CCK-8实验之前，确保细胞在适当的生长条件下。
将上一步骤中准备好的细胞悬液加入到96孔板中，使每个孔中的细胞数目均匀分布。
可以提前设计不同实验组的处理方式，如对照组、实验组和阴性对照组等。
K-8处理按照CCK-8试剂说明书的建议将CCK-8试剂加入到96孔板中的每个孔中。
通常建议每个孔中加入10%的CCK-8试剂，并与细胞悬液充分混合。
注意避免气泡的产生。
6.孵育将96孔板放置在37摄氏度的培养箱中，孵育一段时间。
孵育时间可以根据实验要求设定，通常为1-4小时。
7.吸光度测量使用酶标仪或多功能板读取器测量每个孔的吸光度值。
通常使用450纳米的波长进行测量。
根据吸光度值的变化，可以评估细胞的代谢活性，并进行细胞增殖或毒性分析。
通过以上步骤，可以使用CCK-8试剂评估细胞的增殖和毒性。
这种方法快速、简单且灵敏，被广泛应用于细胞实验中。
需要提醒的是，在进行实验前要仔细阅读CCK-8试剂的使用说明，并根据实际情况进行操作。
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，可以评估药物、毒物和其他试剂对细胞增殖的影响。
本篇文章将介绍CCK-8实验的操作说明及检测步骤。
实验材料：1.细胞培养物：包括细胞培养基和要检测的细胞系。
K-8试剂盒：包括CCK-8试剂和添加剂（如无血清培养基）。
实验步骤：1.细胞预处理：a.将细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
b.用PBS洗涤细胞，以去除培养基中的血清和其他杂质。
c.加入细胞培养基（如无血清培养基）孵育一天以适应新的生长条件。
K-8溶液的制备：a.从CCK-8试剂盒中取出所需量的CCK-8试剂。
b.按照试剂盒说明书中的方法，将CCK-8试剂溶解于适当的溶剂中，以获得CCK-8溶液。
3.细胞处理：a.在细胞培养皿中加入适量的处理组（含药物/毒物/试剂）和阴性对照组（不含处理）。
b.孵育细胞以使其与处理组接触，一般孵育24小时。
c.如果需要在不同时间点进行测量，可以设置不同的处理时间。
4.检测步骤：a.将培养皿从孵育器中取出，加入CCK-8溶液。
一般将CCK-8溶液与培养基混合，使浓度为10%。
b.返回孵育器中继续孵育15至60分钟，以使CCK-8溶液充分与细胞相互作用。
c. 使用酶标仪测量细胞的吸光度。
一般使用450nm波长进行检测。
d.记录各处理组的吸光度值。
5.数据分析：a.根据实验要求，选择合适的数据分析方法。
常用的包括比较各示踪实验组与阴性对照组之间的吸光度差异，或者使用半数抑制浓度（IC50）来评估样品对细胞增殖的影响。
b.绘制呈现实验结果的图表和图形。
c.进行统计分析，如t检验或方差分析，并计算显著性水平。
注意事项：1.操作前应严格按照实验室安全规定进行，佩戴实验室所需的个人防护设备。
2.在各步骤中，应尽量避免细胞暴露在环境中的时间过长，以减少细胞的应激反应。
3.操作时要注意使用无菌环境和无菌操作，以防止细胞污染。
4.实验中的所有操作必须根据实验室方法进行，避免任何操作的偏差。
细胞培养方法
细胞培养方法
细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以提供大量的细胞用于实验研究。
正确的细胞培养方法对于细胞的生长、增殖和实验结果的准确性都至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法及注意事项。
首先，准备培养基。
培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长因子的混合物。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据不同细胞类型的要求选择适当的培养基。
在制备培养基时，需要注意无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
其次，处理细胞。
从细胞库中取出细胞后，需要进行细胞的处理和传代。
处理细胞时，要注意细胞的密度和活性，避免细胞凝集和死亡。
传代时，要根据细胞的生长状态和密度进行适当的稀释，以保证细胞的健康生长。
接着，进行细胞的接种和培养。
将处理好的细胞按照一定的比例接种到预先涂有培养基的培养皿中，然后将培养皿放入培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态，及时更换培养基，避免细胞过度生长或死亡。
最后，进行实验。
当细胞达到所需的数量和状态后，就可以进行相关的实验。
在实验过程中，需要注意培养皿的无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
同时，要注意细胞的处理和操作方法，避免对细胞造成损伤。
总之，正确的细胞培养方法对于细胞的生长和实验结果至关重要。
只有严格遵守操作规程，做好无菌操作，才能得到可靠的实验结果。
希望本文介绍的细胞培养方法能够对大家有所帮助。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
CCK8的原理优势及步骤
CCK8的原理优势及步骤CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性测定的分析方法。
它是一种基于细胞线粒体酶活性的颜色反应来评估细胞活力的快速、敏感的比色法。
CCK8的原理、优势及步骤如下所述。
原理：CCK8试剂是一种含有三脱氢琥珀酸（tetrazolium salt）的化学物质。
当CCK8溶液加入到细胞培养基中时，细胞线粒体内的酶（又称细胞色素C氧化酶）会还原CCK8试剂中的四氮唑盐成为橙黄色的水溶性产物。
这个产物的颜色与细胞活力成正比，也就是说，只要细胞活力高，产物就会形成越多，颜色就会越浓。
优势：1.灵敏度高：CCK8可以检测到低至10个活细胞的数量。
由于颜色反应与细胞活力相关，可以测量到各种细胞类型和样品数量。
2.快速：CCK8试剂仅需在培养基中静置4小时，就能完成细胞活力的测定。
3.简单易行：CCK8试剂只需要加入到细胞培养基中，无需任何特殊仪器和技巧，因此非常容易操作。
4.可靠性高：CCK8试剂的反应准确稳定、重复性好，可以得到可靠的结果。
步骤：1.细胞培养：首先需要培养所需的细胞种类，确保细胞以正常的饮食条件和环境条件生长。
2.处理样品：处理样品分为以下步骤：1）将细胞分装到孔板或其他培养器中，保证每个孔的细胞数量和处理条件相同；2）将不同浓度的处理物添加到细胞中，以观察其对细胞活力的影响；3）在一个孔中加入CCK8试剂，使其与细胞反应。
3.测定：CCK8试剂加入细胞培养物后，需要经过一定时间的孵育。
按照试剂说明书的要求，一般为4小时，试剂将与细胞反应后形成可溶性产物。
通过吸光度计以450纳米的波长测量吸光值，用于评估细胞活力。
综上所述，CCK8作为一种基于细胞线粒体酶活性的快速、敏感的比色法，能够准确、快速地测定细胞活力。
其优势在于高灵敏度、快速简单易行、可靠性好。
在临床研究和药物筛选等领域，CCK8已经成为一种重要的工具和方法。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK8实验是一种常用的细胞增殖和生存能力检测方法，可以用来评估其中一种物质对细胞生长的影响。
其原理是利用CCK8（Cell Counting Kit-8）荧光染料，通过还原因子将细胞内的NAD+ 还原为NADH，形成有色溶液，并使用分光光度计检测其吸光度，从而判断细胞的增殖和生存能力。
下面将详细介绍CCK8实验的步骤和原理。
实验材料和设备：1.细胞培养基（例如DMEM）K8试剂3.96孔板4.分光光度计5.无菌移液器和组织培养器具6.细胞类型需要的培养器具实验步骤：1.将细胞悬液以适当的浓度移植到96孔板中，使每个孔中有约10,000个细胞。
每个组设置至少3个重复。
2.孔板放入细胞培养箱中，使细胞与培养基充分接触，以37°C、5%CO2条件下培养一定的时间，使细胞附着并生长。
3.在培养一定时间后，取出培养板，将培养基倒出，用PBS洗涤细胞1-2次，使细胞处于无血清的状态。
4.加入含有CCK8试剂的培养基，使其与细胞接触，通常含有CCK8的培养基的体积约为培养基的10%。
5.将孔板放回培养箱中，继续孵育15-30分钟，以确保细胞充分反应。
6. 使用分光光度计检测每个孔的吸光度值（一般在450 nm波长处读取），得到吸光度值（OD值）。
7.通过比较吸光度值，得到不同处理组与对照组之间的生长差异，以评估物质对细胞的生存与增殖能力的影响。
实验原理：CCK8荧光染料是一种由WST-8 （Water-Soluble Tetrazolium Salt-8）还原剂构成的形式。
当CCK8溶液与细胞相互作用时，细胞内的细胞呼吸负责NADH的还原作用，将CCK8还原为可溶性的有色产物，形成橙红色溶液。
还原作用的化学方程式为：NAD++C12H7N4O2S·H2O→NADH+H++C12H8N4O2S在反应后的溶液中，由于产生的橙色产物在450 nm波长处具有明显的吸光度，可通过分光光度计测量。
cck8具体操作流程
cck8具体操作流程
以下是使用CCK8试剂盒进行细胞活力检测的步骤：
1. 准备细胞：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液。
如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，
如果是悬浮细胞，不需要预培养。
2. 制备培养基：在无酚红DMEM高糖培养基中加入双抗、谷氨酰胺和血清。
3. 准备96孔板：根据实验需求，准备适当数量的96孔板。
每孔加入
100ul细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞
毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul。
如果是贴壁细胞，可以直接在96
孔板中进行实验，如果是悬浮细胞，需要离心后取沉淀进行实验。
4. 加药处理：根据实验需求，在各组细胞中加入不同浓度的药物或对照组不加药。
5. 孵育：将96孔板放入37℃培养箱中孵育一定时间，通常为24小时。
6. 检测：在检测前，将CCK8试剂加入96孔板中，轻轻混匀后继续孵育1-4小时。
然后使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，记录数据并计算
细胞活力。
以上步骤仅供参考，具体操作请根据实验需求和实际情况进行调整。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
郎朗
第十章 组织培养细胞工程技术 一、建立突变细胞系 1.原理： 人工诱变:基因是遗传功能单位,每一个基因的突变可 视为一个突变点(也可小至仅一个核苷酸)。人体体细 胞是二倍体细胞，基因成对存在，分别位于两个同源 染色体的同一位点上(Allele ;等位基因)。一般情况 下突变点大多为单个(仅涉及一个基因座)。如当野生 型基因A(显性)突变成α’(隐性)时，根据基因型的不 同。a’的表达可能有以下几种情况:
二、细胞融合
1.原理：细胞融合过程中首先是细胞质的融合，然后 通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新的杂种细胞。 在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因 为各自存在完整的细胞膜。但是，在特殊诱导物的作 用下，细胞膜可发生一定变化能使两个或多个细胞发 生融合，形成巨大细胞。常用的诱导物为仙台病毒和 聚乙二醇(PEG)。
同理,HGPRT-小鼠细胞与人细胞杂交,在HAT培养基中 选出全部杂种细胞都保留人的X染色体。因为HGPRT 基因在X染色体上。将这些杂交克隆臵于高浓度6-杂 氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤培养液中回选,结果是丢失 人类X染色体的克隆才能生存。小鼠腹膜巨细胞与SV 40转化的人类LN-SV细胞融合，杂交克隆全部保留人 的第7号染色体。因这个染色体中包含SV40整合的基 因组。
细胞行为特性的选择: 利用细胞生长或贴壁行为不同的特点,也可用来筛选杂 种细胞。例如,鸡红细胞离体时不再生长,但可与其它 细胞(如HGPRT的人细胞)杂交。在HAT培养液中,HGPRT 细胞死亡,鸡红细胞也不生长,只有杂种细胞增殖。同 样,不贴附玻璃或塑料培养器皿表面的淋巴细胞,可以 与贴瓶壁生长的其它细胞(如果TK-的小鼠细胞)融合,在 HAT培养液中TK细胞死亡,淋巴细胞随着培养液简单冲 洗而被除掉,留下杂种细胞能贴壁生长。
利用选择培养液筛选杂种细胞，常用的系统包括: HAT系统:为次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷的缩 写。氨基喋呤能阻断核苷酸的主要合成IMP的途径。细 胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化成次黄苷酸、依次转 化AMP及GMP,通过“应急”通路依赖外源来合成核苷酸。 HGPRT-/TK-细胞与HGPKT+/TK-细胞为亲本作细胞杂交时, 在HAT培养液中未融合的亲本细胞及融合的同核细胞均 死亡,因为这些细胞的核苷酸合成的主要途径被阻断而 又不能利用外源核苷酸原料所致。只有融合的异核(杂 种)细胞由于酶的补偿成为HGPRT+/TK-细胞，能在HAT 培养液中生长而被筛选(保存)出来。
诱变剂:人工诱发突变可用射线、温度、药物、病毒 和化学致突物等。人工实验诱发突变多用化学致突物, 如甲基硝基亚硝基胍(MNNG)、甲基甲磺酸(MMS)、乙 基甲磺酸(EMS)、乙基亚硝基脲（ENU)等。 筛选方法:HGPRT基因位于X染色体上,该基因在两性细 胞中都呈机能性半合子状态(单倍性)。基因产物为次 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。该酶能促次 黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)间的转磷酸 核糖基作用而成磷酸次黄苷(IMP),这是细胞合成嘌呤 核苷酸的一条补救通路。
2.方法: 为获取更多的突变细胞,必须找出从突变作用后到 开始进行筛选的最佳间隔时间,此间隔时间可称作表达 时间或表型间隔,主要在于能使突变固定和允许DNA进 行复制。各种细胞的间隔不同,大鼠肝细胞约10d;又表 达时间间隔与基因也有关。HGPRT表达时间间隔一般为 7-9d。
细胞选择： CHO细胞系:为中国仓鼠卵巢细胞系,上皮型细胞,染色 体数21(2n=2)。其衍生的亚系CHO-K,染色体数为20,
(5)培养7-10d。
筛选: (6)细胞生长接近汇合时,传代,接种数为1×105-3×10 5瓶,24h后; (7)向培养液中加入10µ g/ml的6-巯基嘌呤,继续培养2 4-48h,野生型细胞因掺入6-巯基嘌呤而被杀灭,而HGP RT缺欠细胞(HGPRT-)对6பைடு நூலகம்巯基嘌呤有抗性而得以存活; (8)培养细胞接近汇合时,传代,更换不含筛选液的培 养基、继续培养，细胞80%汇合或接近汇合时冻存。
悬液细胞融合步骤: (1)将两种不同亲本细胞各5× 106混匀; (2)离心沉淀，吸去上清液; (3)加lml 50%PEG液,吸管吹打,使之与细胞接触lmin; (4)加9ml Eagle氏培养液,离心沉淀,吸去上清液; (5)加5ml生长培养液,分别接种5个直径60mm平皿每个 平皿加生长培养液至5ml,37℃的CO2培养箱中培养。624h后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
呈贴附生倍增时间12-14h，克隆形成率高达88%，本
细胞系染色体基因重排和等位基因失活较多，隐性基 因突变检出率比其它细胞高。V79细胞系:建自中国仓 鼠肺,成纤维细胞型,核型稳定,染色体数为22士1，倍 增时间12-16h，克隆形成率在75%-79%。 人二倍体成纤维细胞:如小儿包皮细胞系、人胚肺细 胞系(WI-38)等，克隆形成率一般达20%-50%。
诱发HGPRT-缺欠型过程 细胞培养和致突变:(1) 指数生长期的细胞;
(2)加入0.5-1µ g/ml营养液的MNNG，作用12-16h;
(3)培养:除去致突剂、用BSS冲洗;
(4)胰蛋白酶(0.05%)+EDTA (0.02%)1:1混合消化,将
细胞悬液, 按每个瓶皿中200-1000个细胞接种;
亚硝基羟基丙氨酸一腺嘌呤(AA)系统及其它： 阻断次黄苷酸向腺苷-磷酸转化,使细胞必须依赖外源 腺嘌呤维持生长,即通过腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT) 使腺嘌呤掺合,AA培养液维持正常细胞生长,但APRT细 胞死亡。2-氟腺嘌呤用以筛选APRT-细胞,用APRT小鼠细 胞与人成纤维细胞杂交，在AA培养液中选出的杂种细 胞全部包含人APRT活性,它的基因位干第16号染色体上。 此外,尚有其它选择方法,如建立HGPRT缺损及乌本箭 毒苷对抗的双重突变株,这种细胞可与任何其它啮齿类 或灵长类细胞杂交,因为它携带隐性(HGPRT)及显性(乌 本箭毒苷对抗)的突变物。
杂种细胞的选择： 人工方法：如用仙台病毒诱导细胞融合能形成双核与 多核细胞,在细胞融合过程中,不仅两类不同细胞间发 生融合,两类亲本细胞也能发生相互融合现象,含两个 不同亲本细胞核的细胞称异核体或异核细胞,由同一亲 本细胞融合形成的细胞称同核体或同核细胞,大部分多 核细胞在一周内死亡,只有少数异核细胞、尤其双核异 核细胞会存活,并通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的 染色体合并在一个细胞核中,形成合核体或合核细胞, 即杂交细胞。
仙台病毒:为圆形颗粒,由中央部的RNA和包在外面的脂 蛋白构成,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:①两种 细胞在一起培养,加入病毒,在4℃条件下病毒附着在细 胞膜上,并使两细胞相互凝聚;②在37℃中,病毒与细胞 膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需要Ca2+和Mg2+，最 适pH为8.0-8.2;③细胞膜连接部穿通,周边连接部修复, 此时需Ca2+和ATP;融合成巨大细胞，仍需ATP。 聚乙二醇(PEG):有与仙台病毒相同的融合效果,优点是 易得，用法简单，融合效果稳定，现已取代仙台病毒。
啮齿类/人类杂种细胞的选择中,可用某些选择法控制 保留人的特定染色体。例如APRT-小鼠细胞与人成纤维 细胞杂交,在AA系统能选出保留人的第16号染色体的克 隆。因为人的APRT基因位于该染色体上。TK-小鼠细胞 与人细胞杂交,在HAT中能选出全部保留人第17号染色 体的杂交克隆,因为这个染色体中包含TK基因。若将这 些杂交克隆臵于高浓度BUdR培养液中筛选,则只有丢失 人的第17号染色体(表达人TK活性)的细胞才能生存。
三、细胞同步化法
1.细胞分裂相脱离同步化法:有丝分裂时分裂细胞易底 物脱落,分离收集细胞进行培养,可获得一定数量的同 步化细胞群。一般细胞在指数生长期时，分裂期的细 胞仅占1%-5%数量还不够充分,为增加分裂相数, 可采 用如低温休克、秋水仙素阻滞分裂中期法等。 低温休克原理是:随培养温度降低,细胞DNA的合成会受 抑或停止,使很多细胞阻滞趋于C1期，当恢复37℃培养 液后，过一定时间，多量细胞可同步进入DNA合成期， 随之便出现一个明显的细胞分裂高潮。
2.聚乙二醇融合法
聚乙二醇:HOH2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大于200小于60 00者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后,与温热 的Eagle氏液混合,分子量较大的PEG在加入Eagle氏液 后常会凝固,需放臵70℃使之成为溶液,以后室温保存, 则不再凝固。通常用分子量1000的PEG作融合剂最好,5 0% PEG溶液能产生最多杂交细胞;若用分子量较小的PE G时,以55%浓度为好,PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最 高,融合时细胞密度不要太大,在汇成单层之前融合时 能产生更多杂种细胞。
此酶特异性不强,也能把嘌呤拟似物6-巯基嘌呤(MP) 和6-杂氮鸟嘌呤(AG)掺入DNA中引起细胞死亡。因此, 当HGPRT基因突变时,细胞就表现出对MP或AG的抗性。 在有MP或AG的条件下,它们能够生存,而野生型细胞却 能摄取MP或AG而死亡。其次是由于突变细胞嘌呤核苷 酸合成补救通路丧失,它就只能依赖于嘌呤的全程合 成途径。当此途径被氨基嘌呤(A)或氨甲喋呤(M)抑制 时，在有外源性次黄嘌呤存在的条件下,野生型细胞 能生存,而突变细胞则死亡。HGPRT可进行筛选突变细 胞的手段。
啮齿类/人类杂种细胞,显示人类染色体的丢失或分 离,能确立两个或更多表型之间的直线关系及绘制特定 染色体基因图。例如,小鼠/人杂种细胞培养最初几代 包含两个亲本细胞的全部染色体,但在传代增殖过程中, 人的染色体逐渐丢失,这种现象是杂种细胞进行人类基 因定位的基础。通过人类染色体丢失是大量的,大多数 杂交克隆留下不超过10-20个人的染色体;而且人类染 色体丢失不是随机的,某些染色体(如第7,11,12号染色 体)更多保留下来,另一些染色体(如第9号染色体)则更 易丢失。因此，筛选一定数量的杂交克隆，对体细胞 杂交作连锁分析、基因定位等是必需的。
2.胸腺嘧啶核苷酸双阻断法：
向培基加入过量TdR,能形成过量三磷酸腺苷,后者能反 馈抑制其它核苷酸磷酸化,产生阻抑DNA合成的效应。 (1)TdR处理:指数期细胞加入终浓度2mM TdR,18-20h; (2)离心:1000转/分,10min,去上清,制成悬液,接种入 瓶中继续培养9-12h; (3)TdR处理:加入TdR,终浓度为2mM,作用时间18-20h; (4)培养:倒掉营养液,胰酶消化,换入新营养液,吸管吹 打制成细胞悬液,接种入另一瓶中,臵37℃温箱培养,细 胞将进入同步生长状态。