鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用
鸭肠炎病毒的提纯和间接ELISA诊断方法的建立及应用的开题报告
鸭肠炎病毒的提纯和间接ELISA诊断方法的建立及
应用的开题报告
介绍：
鸭肠炎是由鸭肠炎病毒感染引起的一种急性、高度传染性的疾病，
常发生于家禽养殖中，给养殖业造成了巨大的经济损失。
因此，建立快速、准确的诊断方法和有效的疫苗是十分必要的。
本文旨在研究鸭肠炎
病毒的提纯方法及间接ELISA诊断方法的建立和应用。
一、鸭肠炎病毒的提纯方法
使用鸭肠炎病毒株进行感染和复制，采用低速离心、高速离心、HOME、GE等多种方法逐步去除细胞碎片、蛋白质、核酸等杂质，最终
得到较为纯净的病毒颗粒。
采用SDS-PAGE等方法检测病毒纯度，为后
续的诊断方法提供基础。
二、间接ELISA诊断方法的建立
1.制备抗体：使用提纯的鸭肠炎病毒制备兔抗血清，检测抗体效价。
2.制备抗原：将提纯的鸭肠炎病毒加入固相板，通过化学交联将病
毒固定在板上，用PBS等缓冲液冲洗去其他杂质，得到抗原。
3.检测抗体：将样本加入含有抗原的固相板孔中，待抗体反应，加
入检测二抗，通过酶作用反应终止后测量OD值，根据OD值判断是否感染鸭肠炎病毒。
三、间接ELISA诊断方法的应用
1.检测感染率：采集禽类粪便或血清样本，通过间接ELISA方法检
测其是否感染了鸭肠炎病毒。
2.监测疫苗效果：采集接种过疫苗后的禽类粪便或血清样本，通过
间接ELISA方法检测其是否产生了抗体，评价疫苗的效果。
综上所述，鸭肠炎病毒的提纯和间接ELISA诊断方法的建立及应用是一项重要的研究工作，该方法的建立将为鸭肠炎的防治提供重要的技术支持。
鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立
Chinese Journal of Veterina/Medicine中国兽医杂志2020年(第56卷)第3期53鸭甲肝病毒的间接ELISA方法的建立,张，闫艳新，任慧英，刘文华(青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109)摘要:为建立一种切实可行的鸭甲肝病毒抗体的检测方法，将1株临床分离的3型鸭甲肝病毒的VP3基因进行原核表达的纯化蛋白作为包被抗原，初步建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。
通过条件优化，得到VP3蛋白最佳包被浓度为0.1595"g/mL,血清最佳稀释倍数为1：200。
结果显示,建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，与商品化的双ELISA的符合率为92.5%，且该方法1型和3型鸭甲肝病毒抗体，因而可用于临床免疫鸭毒的种鸭水平的和卵黄的效价测定。
关键词：3型鸭甲肝病毒；VP3蛋白；间接ELISA中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：0529—6005(2020)03—0053—04Establishment of Isdirect ELISA for Detection of DuckHepatitis A Virrs(DHAV)AntibodyYIN Yin，ZHANG Yan-jia，YAN Yan-xin，REN Hui-ying，LIU Wen-hua(Co e geoeVeeeainaayMedicine，QingdaoAgaicueeuaaeUniveasiey，Qingdao266109，China)Abstract:In order to establish a method to detect the antibodies against duck hepa/Os A virus(DHAV)，an indirect ELISA meehod eoadeeeceion oeDHAVaneibodywaseseabeished byusingehepuaieied paoeein ascoaeinganeigen，which waspaokaayoeicei-pressed VP3gene from a clinically isolated DHAV-3.Optimized conditions were as following，the optiGai concentration of coating VP3paoeein was0.1595"gLmL，and eheopeimaedieueion aaeiooeseaum was1：200.Resueesshowed eheELISA meehod had good specieiciey，sensieivieyand aepeaeabieiey，and ehecoincidenceaaeewieh commeaciaedoubeeaneigen sandwich ELISAwas92.5%.Fua-eheamoae，eheindiaeceELISAcoued deeeceaneibodiesboeh againseDHAV-1and DHAV-3.Theaeeoae，iecan beused eodeeeceseaum aneibodyeeveesoeceinicaebaeed ducksimmunized wieh DHAVvaccineand eheeieeaoeyoek aneibody.Key wordt:DHAV-3；VP3Paoeein；indiaeceELISACorressonding author:LII Wen-hua，E-mail:wenhua/u2688@鸭肝炎病毒！Duck hepatitis virus，DHV)可引起鸭急性高度性感染，尤其是3周龄内最易感，亡率高达80%，给养鸭业造成大经济损失[1]o DHV可分为I、)、皿三个血清型，其中I型DHV属于小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭毒(Duck hepatitis A virus，DHAV),)型DHV和III型收稿日期：2019—03—29基金项目：山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队项目(SDAITC11C3)作者简介:殷茵(1993-)，女,硕士生，主要从事兽医微生物与免疫学研究，E-mail：2313354988@张琰杰(1995-)，男，硕士生，主要从事兽医微生物与免疫学，E-mai e:745261031@:张琰杰与殷茵对本文具有同等贡献通讯作者:刘文华,E-mail：wenhua/u2668@126-com DHV属于星状病毒状病毒属鸭星状病毒(Duck astro v irus，DAstO)*2+o其中DHAV又根据基因性差异分为3个基因型,分别为1型DHAV、2型DHAV和3型DHAV[3]%前临床鸭肝炎主要是由1型和3型DHAV引起⑷％我国临床对DHAV商品化的生物制品主要是1型DHAV弱毒苗，3型DHAV疫苗到审批％由于3型DHAV的广在，大分种鸭场也会利用3型DHAV临床分离株活苗与1型DHAV疫苗免疫％商品鸭场为防鸭，通常在3~5日龄进行卵黄 射，目前临床应用的是1型+3型的双联抗体，对DHAV建立一种、、特异的法是非的％虽对鸭毒的商品化ELISA，但昂贵％由于DHAV颗粒太小，不易得到纯化病毒，而54中国兽医杂志2020年（第56卷）第3期Chinese Journal of Veterinai/Medicine以全病毒作为包被抗原对病毒的纯化要求又较高，本试验达蛋白作为包被,建立一匚测DHAV抗体的间接ELISA方法,为临床种鸭免疫效果的判定及DHAV卵黄抗体效价测定%1材料表达载体pCold TF,为TaKaRa公司产品；弗氏完和弗氏不完，为Sigma公司产品；山鸭IgG酶标二抗,为国KPL产品；鼠抗His标签单克隆,为Top Science公司产品;3型DHAV双ELISA ,为海岚派生物产品;其他,为Sola/io公司产品;试验用各类病毒阳性，为山东省农业科学院黄兵员％2间接ELISA方法的建立2-1包被抗原和抗体最佳工作浓度确定将实验室前期表达鉴定的DHAV的VP3蛋白通过切胶回法进行纯化*5+%纯化蛋白用包被液分别进行1：10、1：100、1：1000、1：2000、1：4000的倍比稀释,加入酶中4l包被过夜。
Dot-ELISA检测鸭疫里默氏杆菌抗体的建立及应用研究的开题报告
Dot-ELISA检测鸭疫里默氏杆菌抗体的建立及应用研究的开题报告标题：Dot-ELISA检测鸭疫里默氏杆菌抗体的建立及应用研究一、研究背景和意义鸭疫是由里默氏杆菌感染引起的一种病毒性疾病，常常在禽类中出现，对禽类养殖业造成了严重的损失。
目前，传统的鸭疫检测方法主要包括培养、PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，但存在的问题是操作繁琐、耗时长、检测复杂等，制约了鸭疫快速诊断和疫情监测的效果。
随着近年来生物技术的快速发展，快速高效、敏感、特异的检测方法已成为鸭疫诊断和监测的主流，因而对新型鸭疫检测技术的研究具有重要的现实意义和科学价值。
二、研究目的本研究旨在建立一种Dot-ELISA检测鸭疫里默氏杆菌抗体的检测方法，对其敏感性、特异性和稳定性进行评估，为鸭疫快速诊断和疫情监测提供新的技术手段。
三、研究内容和方法1. 菌种培养和制备：采用里默氏杆菌作为研究对象，通过菌液培养和提纯方法制备纯净的里默氏杆菌抗原。
2. 免疫动物的制备：将里默氏杆菌抗原免疫BALB/c小鼠，制备出高效的鼠抗里默氏杆菌抗体。
3. Dot-ELISA检测方法的建立：根据已有文献和方法，建立Dot-ELISA检测方法。
优化Dot-ELISA检测过程中的反应条件和浓度，选用最佳检测抗体和底物，评估其敏感性、特异性和稳定性等指标。
4. Dot-ELISA检测方法的应用：用建立的Dot-ELISA检测方法检测从不同地区采集的鸭血清样本中里默氏杆菌抗体的含量，评估其在临床应用中的准确性和可行性。
四、研究预期成果1. 建立一种敏感、特异、稳定的Dot-ELISA检测方法，能够快速、准确、简便地检测鸭疫里默氏杆菌抗体。
2. 评估该检测方法的敏感性、特异性和稳定性等指标，为实现鸭疫快速诊断和疫情监测提供技术保障。
3. 为推动我国禽类养殖业的发展，提供切实可行的技术手段。
五、研究进度目前已完成初步实验，并取得了较好的效果。
接下来将继续深入开展研究工作，争取早日完成本研究任务。
鸭坦布苏病毒E蛋白包被抗原间接ELISA方法的建立_傅秋玲
１∶２００、１∶４００、１∶８００、１∶１ ６００、１∶３ ２００、 １∶６ ４００ 进行梯度稀释，包被于酶标板， 每孔１００ μＬ，血清从１∶５０、１∶１００ 稀 释 到 １∶２００， 组 成 方阵，进行 间 接 ＥＬＩＳＡ， 分 光 光 度 计 测 定 ＯＤ４５０ｎｍ 值，Ｐ／Ｎ ＝ 标 准 阳 性 血 清 ＯＤ４５０ｎｍ 值／阴 性 血 清 ＯＤ４５０ｎｍ值，比值 最 大 时 的 抗 原 包 被 浓 度 及 抗 体 稀 释度为最适工作浓度。 １．２．３ 酶 标 二 抗 稀 释 倍 数 的 优 化 采 用 直 接 ＥＬＩＳＡ 法， 以 最 佳 浓 度 稀 释 的 血 清 包 被 酶 标 板， 每孔１００μＬ，４℃ 过 夜 后， 将 ＨＲＰ 标 记 的 羊 抗 鸭 ＩｇＧ 稀释成１∶１ ５００、１∶３ ０００、１∶４ ５００、１∶６ ０００、 １∶９ ０００ 后，３７℃ 孵 育 １ｈ。 重 复 测 定 ２ 次。 取 ２ 次 ＯＤ４５０ｎｍ值的平均值，并比较 Ｐ／Ｎ 值的变化。 １．２．４ 酶标二抗最 佳 孵 育 时 间 的 确 定 在 优 化 酶 标二抗 工 作 浓 度 后， 于 ３７℃ 下 分 别 作 用 ３０、４５、 ６０、９０ｍｉｎ， 用 ＤＴＶ 阳 性、 阴 性 血 清 进 行 检 测， 重复测 定 ２ 次。 取 ２ 次 ＯＤ４５０ｎｍ 值 的 平 均 值， 并 分 析 Ｐ／Ｎ 值变化情况。 １．２．５ 最 佳 封 闭 剂 的 确 定 分 别 选 用 １％ＢＳＡ、 ５％脱脂奶粉、１％ 明 胶、１０％ 胎 牛 血 清、５％ 胎 牛 血清作 为 封 闭 剂， 每 孔 ２５０μＬ，３７℃ 封 闭 １．５ｈ。 每份血清重复２孔，且做不加封闭剂作为对照孔。 测定 ＯＤ４５０ｎｍ值，并分析 Ｐ／Ｎ 值变化情况。 １．２．６ 间接 ＥＬＩＳＡ 结果的判定 判定标准：Ｐ／Ｎ ≥ ２．１ 判 为 阳 性， 小 于 １．５ 为 阴 性，１．５ ≤ Ｐ／Ｎ ＜ ２．１ 判为可疑，重检后仍可疑者定为阴性。 １．２．７ 特异 性 试 验 以 ＤＴＶ 阳 性、 阴 性 血 清 为 对照，用已建 立 的 间 接 ＥＬＩＳＡ 检 测 禽 流 感、 新 城 疫病毒、１型鸭肝炎病毒、 胰 腺 型 鸭 甲 肝 病 毒、 禽 霍乱和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清，分析该方法的 特异性。 １．２．８ 批内重复性 试 验 以 同 一 批 制 备 的 重 组 抗 原包被的酶标板，随机取５份血清，每份血清重复 ６孔，在同等 条 件 下 按 间 接 ＥＬＩＳＡ 的 程 序 进 行 检 测，结果进行统计学方法分析。 １．２．９ 批间重复性 试 验 用 不 同 批 制 备 的 重 组 蛋 白包 被 酶 标 板， 取 ５ 份 抗 体 水 平 不 同 的 ＤＴＶ 血 清，用此方法在４个不同时间段按上述已优化的间 接 ＥＬＩＳＡ 方法反 应 条 件 进 行 操 作， 每 份 血 清 重 复 ２个孔，同时设定对照，结果用统计学方法分析。 １．２．１０ 敏 感 性 试 验 将 ＤＴＶ 血 清 作 梯 度 稀 释， 用建立的 ＥＬＩＳＡ 方 法 进 行 检 测， 测 定 阳 性 检 出 的 最大血清稀释度即为此方法的敏感性。 １．２．１１ 间接 ＥＬＩＳＡ 方 法 的 应 用 利 用 该 方 法 对 ２３７ 份来自福建 省 开 产 麻 鸭 的 血 清 样 品 进 行 检 测，
检测坦布苏病毒病抗体 NS1-ELISA方法的建立与初步应用
异系数分别为 ６ ． ７ ％和 ８ ． ２ ％， 显示 该方法具有很好的稳定性 。用间接 Ｎ Ｓ １ 一 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方法对 ８ １ 份疑似 鸭坦 布苏
病 毒病 血清样品进行检测 ， 有４ ３份样品呈现 阳性 ， Ｅ — Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ有 ４ ８份呈 阳性结果 ， 证明该方法具有较高的敏感 性 。Ｎ Ｓ １ 一 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方法 的建立 为 Ｔ Ｖ Ｂ的诊断和流行病 学调查 提供了一种新的方法 。 关键词 ： 坦布苏病毒 ； Ｎ Ｓ １ 蛋 白； 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ； 抗体
检测坦布苏病毒病抗体 Ｎ Ｓ １ ． Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方 法 的 建 立 与初 步应 用
谢星星 ， 李祥瑞 ， 李 银 ， 赵冬敏 ， 黄欣梅 ， 韩 凯凯 ， 刘宇卓 ， 游 园
（ 南京农业大学 动物医学院 ， 江苏 ， 南京 ， ２ １ ０ ０ ９ ５； 江苏省农 业科学 院 兽医研究所 ， 农业部 兽用生 物制品工程 技术重点 实验室 ， 江苏
谢星 星 ， 李祥瑞 ， 李银， 等．检测坦布苏病毒病抗体 Ｎ Ｓ １ 一 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方法 的建立与初 步应用 ［ Ｊ ］ ． 浙 江农业学 报 ， ２ ０ １ ４ ， ２ ６ （ １ ） ：
Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ４ － １ ５ ２ ４ ． ２ ０ １ ４ ． ０ １ ． ２ ５
ａ ｐｐｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
ＸＩ Ｅ Ｘｉ ｎ ｇ— ｘ ｉ ｎ ｇ ， ＬＩ ， Ｘｉ ａ ｎ ｇ — ｒ ｕｉ ， ， ＬＩ Ｙｉ ｎ ， ， ＺＨＡＯ Ｄｏ ｎ ｇ． ｍｉ ｎ。 ＨＵＡＮＧ Ｘｉ ｎ — ｍｅ ｉ ，ＨＡＮ Ｋａ ｉ — ｋ ａ ｉ ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｙｙ ｕ —
间接elisa的原理及应用
间接ELISA的原理及应用1. 什么是间接ELISA间接ELISA全称为酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用的免疫学检测方法。
它依靠特定抗原和抗体之间的高度专一性反应，通过酶标记抗体或抗原的相互作用来检测目标物质的存在和浓度。
2. 间接ELISA的原理间接ELISA的原理是将待测物与特定抗原偶联到固定在微孔板上的抗原表面上。
然后引入与待测物特异性结合的酶标记抗体，使其与待测物结合。
接下来，通过添加底物，酶标记抗体催化底物的变色反应，从而间接检测出待测物的存在。
间接ELISA的步骤如下：1.固相涂布：将抗原溶液均匀涂布在微孔板上，使其在孔壁上固定。
2.阻断：加入一定浓度的非特异性抗体，使其与未吸附的表面结合，防止非特异性的结合。
3.加入待测物：将待测物标本加入到微孔板中与固相抗原发生特异结合。
4.加入检测抗体：加入配有酶标记的抗体，该抗体有望与待测物结合形成夹心免疫复合物。
5.洗涤：洗涤微孔板以去除未结合的物质。
6.加入底物：加入含有底物的试剂，底物受到酶催化产生变色反应。
7.阅读测量：使用酶标仪对底物反应产生的颜色进行定量检测。
3. 间接ELISA的应用间接ELISA广泛用于医学、生命科学研究、生物制药和农业领域。
以下是间接ELISA在不同领域的应用：3.1 医学领域间接ELISA在医学领域的应用非常广泛，主要用于以下几个方面：•临床诊断：可以用于检测疾病的早期诊断，如艾滋病、肝炎、结核病等。
•药物监测：可以测定药物的浓度，监测药物治疗的疗效和剂量。
•免疫学研究：可用于研究免疫系统的功能和疾病发生机制。
3.2 生命科学研究间接ELISA在生命科学研究中也有广泛的应用，主要用于以下方面：•蛋白质检测：可以用于检测目标蛋白质在细胞或生物体中的表达量。
•抗体研究：可以用于检测抗体在细胞或液体中的浓度，了解免疫应答和抗体产生的情况。
•基因表达：可以用于检测转基因植物或动物中目标基因的表达水平。
鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立
鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立郝明飞;张琳;胡北侠;崔言顺;张秀美【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(33)12【摘要】为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3 ku.Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法.对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件.优化后确定的抗原最适包被浓度为7 μg/mL,血清的最佳稀释度为1；320,酶标抗体最适稀释度为1:1 000.在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4.本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段.【总页数】6页(P17-22)【作者】郝明飞;张琳;胡北侠;崔言顺;张秀美【作者单位】山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 [J], 姬希文;闫丽萍;颜丕熙;李国新;张七斤;李泽君2.鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用 [J], 余斌;华炯钢;刘跃生;赵灵燕;倪征;叶伟成;云涛;陈柳;徐辉3.一种针对鸭Tembusu病毒包膜蛋白Ⅱ结构域hi环独特交叉反应性表位的中和抗体可保护鼠动物模型感染鸭坦布苏病毒 [J],4.鸭坦布苏病毒、鸭肠炎病毒和番鸭细小病毒TaqMan三重实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用 [J], 吴双;姜勇;徐建生;吴植;谢军;宋海港;魏若瑶;高悦;朱善元5.鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒及番鸭呼肠孤病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与临床应用 [J], 谢守玉;吴双燕;刘惠心;尹彦文;施开创;屈素洁;陆文俊;黄小武;廖东安;王露霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立及应用
ｄｏｉ：１０．１１７５１／ＩＳＳＮ．１００２－１２８０．２０１８．１１．０３鸭坦布苏病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立及应用邹敏１，张青１，王红１，刘东１，刘新文１，范根成１∗，吴发兴２∗（１．青岛易邦生物工程有限公司动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛２６６１１４；２．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛２６６０３２）［收稿日期］２０１８－０９－０５㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１８）１１－００１４－０５㊀［中图分类号］Ｓ８５２．６５［摘㊀要］㊀为建立一种能快速检测鸭坦布苏病毒（Ｔｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓ，ＴＭＵＶ）的分子生物学方法，从ＧｅｎＢａｎｋ中下载了５１个具有代表性的黄病毒全基因组序列及白洋淀病毒等５个禽源黄病毒株Ｅ基因序列，进行了黄病毒Ｅ基因序列分析，应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计了一对引物，扩增目的片段为５４９ｂｐ，进行了ＴＭＵＶＲＴ－ＰＣＲ检测方法的特异性㊁敏感性㊁重复性试验，建立了ＴＭＵＶＲＴ－ＰＣＲ检测方法应用该方法对收集的１４份临床疑似蛋鸭鸭坦布苏病毒病发病样品进行了检测，共检出６份ＴＭＵＶ核酸阳性样品，检出率达４２．８６％㊂结果表明，该方法可用于水禽坦布苏病毒病的临床快速诊断㊁检测及流行病学调查㊂［关键词］㊀鸭坦布苏病毒；Ｅ基因；ＲＴ－ＰＣＲ基金项目：青岛市动物保健品行业智库联合基金（１６－１０－１－１－ｊｃｈ）作者简介：邹敏，高级兽医师，从事兽用生物制品研制工作；张青，从事兽用生物制品研发与质量管理工作，为并列第一作者㊂通讯作者：范根成，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｇｃｈｅｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；吴发兴，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｆａｘｉｎｇ＠ｃａｈｅｃ．ｃｎＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＴ－ＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｕｃｋＴｅｍｂｕｓｕＶｉｒｕｓＺＯＵＭｉｎ１，ＺＨＡＮＧＱｉｎｇ１，ＷＡＮＧＨｏｎｇ１，ＬＩＵＤｏｎｇ１，ＬＩＵＸｉｎ－ｗｅｎ１，ＦＡＮＧｅｎ－ｃｈｅｎｇ１∗，ＷＵＦａ－ｘｉｎｇ２∗（１．ＱｉｎｇｄａｏＹｅｂｉｏＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．Ｌｔｄ．，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＶａｃｃｉｎｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２６６１１４，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｈｉｎａＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ，Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２６６０３２，Ｃｈｉｎａ）㊀㊀Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ：ＦＡＮＧｅｎ－ｃｈｅｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｇｃｈｅｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；ＷＵＦａ－ｘｉｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｆａｘｉｎｇ＠ｃａｈｅｃ．ｃｎＡｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｐｒｏｖｉｄｅａｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｕｃｋＴｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓ（ＴＭＵＶ），ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ５１ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ，ＥｇｅｎｅｏｆｔｈｅＢＹＤｖｉｒｕｓａｎｄ５ＡｖｉａｎＦｌａｖｉｖｉｒｕｓｗｅｒｅｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍｔｈｅＧｅｎＢａｎｋ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＦｌａｖｉｖｉｒｕｓＥｇｅｎｅｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ，ａｎｄｕｓｉｎｇｔｈｅＰｒｉｍｅｒ５．０ｓｏｆｔｗａｒｅ，ａｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｔｈｅｍｏｔｉｖｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓ５４９ｂｐ．ＡＴｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｈａｄｓｏｍｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｓｕｃｈａｓｆａｓｔ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｒｅｐｅａｔａｂｌｅ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔ１４ｓｕｓｐｅｃｔｅｄｃｌｉｎｉｃｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ６ＴＭＵＶｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓ４２．８６％．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｄｅｔｅｃｔａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｗａｔｅｒｆｏｗｌＴｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｕｃｋＴｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓ；Ｅｇｅｎｅ；ＲＴ－ＰＣＲ㊀㊀２０１０年４月以来，我国浙江㊁江苏㊁山东㊁福建㊁河北㊁北京等省份的蛋鸭发生一种以产蛋率急速下降甚至停产及不同程度死亡为特征的疫病，俗称鸭卵巢出血症，亦称为 鸭黄病毒感染 ，现命名为鸭坦布苏病毒病（ＤｕｃｋＴｅｍｂｕｓｕＶｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅ）［１－２］㊂各品种蛋鸭㊁种鸭㊁鹅等家禽均有发生，但主要见于开产蛋鸭㊂产蛋鸭发病后出现长时间（４０ ６０ｄ）的产蛋率低下，恢复后所产种蛋的受精率和孵化率出现下降㊂发病鸭群采食量显著下降，拉绿色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滞，体重减轻；少量病鸭出现站立不稳㊁震颤㊁行走困难和姿势异常；主要病变为出血性卵巢炎㊁间质性肝炎和非化脓性脑炎㊂该病近期成为危害中国养鸭业的重要疫病之一㊂产蛋率高的鸭群患病后４ ５ｄ从产蛋高峰或高产蛋率迅速下降至２０％ ３０％，严重的于发病后７ｄ左右停产；刚开产蛋鸭产蛋率上升缓慢或减蛋，长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现㊂不同地区㊁不同品种鸭群发病率高低不一，群发病率几乎１００％，病死率０％ １２％［３－５］㊂由于是新发传染病，人们对该病原及由其感染导致的发病认识很不充分㊂对病原的生物学性状㊁实验室检测㊁诊断㊁治疗和疫苗等的研究尚处于起步阶段，缺乏能够快速诊断或检测方法㊂２０１１年３月，从临床表现产蛋骤降的病死蛋鸭的７份发病组织样品（卵巢㊁肝脏等）中，成功分离到４株坦布苏病毒地方流行毒株（另文发表），借鉴现代分子生物学技术，在查阅已公开发表的黄病毒快速检测方法以及分子流行病学研究文献基础上，开展了本病的实验室快速ＲＴ－ＰＣＲ检测研究㊂１㊀材料与方法１．１㊀毒株㊀鸭坦布苏病毒（ＤｕｃｋＴｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓ，ＤＴＭＵＶ）ＪＮ株㊁禽流感病毒（Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）㊁新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）㊁减蛋综合症病毒（Ｃｈｉｃｋｅｎｅｇｇｄｏｗｎｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）㊁鸭肝炎病毒（Ｄｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＤＨＶ）㊁传染性法氏囊病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ）㊁传染性支气管炎病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＢＶ）㊁番鸭呼肠孤病毒（Ｍｕｓｃｏｖｙｄｕｃｋｒｅｏｖｉｒｕｓｉｓ，ＭＤＲＶ）以及禽网状内皮增生症病毒（Ａｖｉａｎｒｅｔｉｃｕ⁃ｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＲＥＶ），由青岛易邦生物工程有限公司动物基因工程疫苗国家重点实验室保存并提供㊂１．２㊀临床发病样品及预处理㊀共１４份，由青岛易邦生物工程有限公司技术服务部提供㊂每份样品主要包括发病鸭的肝脏㊁卵巢组织等㊂样品的预处理方法是：取每份样品约５．０ｇ并剪碎，再加入４倍体积的ＰＢＳ（ｐＨ７．２），混匀后研磨至糊状，在－２０ħ㊁室温条件下反复冻融３次，再经４ħ㊁１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液分装后－８０ħ冻存备用㊂１．３㊀试剂㊀ＤＮＡｚｏｌ㊁ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＯｎｅＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲＫｉｔＶｅｒ．２试剂盒㊁ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ均购自宝生物（大连）工程有限公司；ＤＮＡ胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司㊂１．４㊀引物设计㊀登录ＧｅｎＢａｎｋ，分别下载了５１个具有代表性的黄病毒全基因组序列及５个禽源黄病毒株的全部或部分Ｅ基因序列，经ＤＮＡｓｔａｒ７．０软件比对分析后，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件自主设计了１对检测引物，ＤＴＭＵＶ－ＴＦ：５＇－ＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴ⁃ＣＡＴＣＡ－３＇，ＤＴＭＵＶ－ＴＲ：５＇－ＴＣＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴＣ⁃ＣＣＡＣＴＴＣＴ－３＇，扩增片段大小为５４９ｂｐ，交由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，稀释成工作浓度（２０ｐｍｏｌ／Ｌ）－２０ħ保存备用㊂１．５㊀病毒核酸的提取㊀按照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司生产的Ｔｒｉｚｏｌ或ＤＮＡｚｏｌ说明书分别提取上述９种病毒及１４份样品中可能含有的ＴＭＵＶ总ＲＮＡ或其他ＤＮＡ病毒总ＤＮＡ，－２０ħ保存备用㊂１．６㊀ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立１．６．１㊀ＲＴ－ＰＣＲ反应体系及程序㊀总体系２５μＬ，包括Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ１ｓｔｅｐｅｎｚｙｍｅｍｉｘ２μＬ㊁２ˑ１ｓｔｅｐｂｕｆｆｅｒ１２．５μＬ㊁ＤＴＭＵＶ－ＴＦ和ＤＴＭＵＶ－ＴＲ各０．５μＬ㊁ＤＴＭＵＶ－ＪＮ株总ＲＮＡ２．５μＬ，最后用ＤＥＰＣＨ２Ｏ补至２５μＬ，反应程序：５０ħ３０ｍｉｎ㊁９４ħ５ｍｉｎ㊁３５ˑ（９４ħ４０ｓ㊁４／５４．５／５５／５５．５ħ４０ｓ㊁７２ħ５０ｓ）㊁７２ħ１０ｍｉｎ，最后４ħ冷却１０ｍｉｎ，ＰＣＲ结束后取５μＬ扩增产物进行１％琼脂糖凝胶１００Ｖ４５ｍｉｎ电泳检查并成像㊂１．６．２㊀特异性试验㊀用确定的最佳条件分别对阳性对照及其他相关的８种病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，对其特异性进行评价㊂取ＰＣＲ产物５μＬ，在１％琼脂糖凝胶上电泳㊂回收５４９ｂｐ的目的条带，用上海生工生物工程技术服务有限公司生产的ＤＮＡ胶回收试剂盒回收目的片段进行测序，并与黄病毒代表成员的Ｅ基因相应核酸片断进行在线Ｂｌａｓｔ分析，以进一步验证本方法的特异性㊂１．６．３㊀敏感性试验㊀将所提取的ＤＴＭＵＶ－ＪＮ株总ＲＮＡ进行定量，１０倍梯度连续稀释，按上述ＰＣＲ反应进行扩增，测定模板最低检出量，判定该ＲＴ－ＰＣＲ方法的敏感度㊂１．６．４㊀重复性平行检测㊀将所提取的ＤＴＭＵＶ－ＪＮ株总ＲＮＡ平分为５份，分别交给５位实验室技术人员，按照１．６．１项下的条件进行ＲＴ－ＰＣＲ，验证该方法的可重复性㊂１．６．５㊀临床样品的检测㊀对１４份疑似鸭坦布苏病毒感染的样品按照建立并优化的ＲＴ－ＰＣＲ方法进行检测㊂２㊀结㊀果２．１㊀反应条件的确定㊀按１．６．１项配制好反应体系进行梯度ＰＣＲ，电泳检测结果见图１㊂筛选出ＤＴＭＵＶ的最佳一步法ＲＴ－ＰＣＲ检测退火温度是５５ħ，时长４０ｓ㊂２．２㊀特异性试验㊀用确定的ＲＴ－ＰＣＲ条件对阳性对照ＪＮ分离株㊁８个参考毒株进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果仅有阳性对照有预期目的条带出现，其他８个参考毒株没有目的条带（图２），说明本方法的特异性极佳㊂回收目的条带测序获得５４９ｂｐ的特异性核酸序列（图３）㊂２．３㊀敏感性试验㊀用设计的特异性引物对不同浓度的ＤＴＭＵＶ－ＪＮ株ＲＮＡ直接进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果可检测出即使是将提取的核酸稀释至１０－６，仍能检出目的条带（图４）㊂２．４㊀临床样品的检测㊀应用建立的方法对１４份临床疑似发病样品按照优化的ＲＴ－ＰＣＲ条件进行检测，有６份阳性（图５），经克隆测序表明均是阳性目的判断扩增，检出率为４２．８６％㊂Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：５３ħ；２：５３．５ħ；３：５４ħ；４：５４．５ħ；５：５５ħ；６：５５．５ħ；７：阴性对照图１㊀ＤＴＭＵＶＲＴ－ＰＣＲ检测条件的确定Ｆｉｇ１㊀ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒＤＴＭＵＶ１：阳性对照；Ｍ，ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；２：ＡＩＶ；３：ＮＤＶ；４：ＥＤＳＶ；５：ＤＨＶ；６：ＩＢＤＶ；７：ＩＢＶ；８：ＭＤＲＶ；９：ＲＥＶ；１０：ＤＴＭＵＶ－ＪＮ１：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；２：ＡＩＶ；３：ＮＤＶ；４：ＥＤＳＶ；５：ＤＨＶ；６：ＩＢＤＶ；７：ＩＢＶ；８：ＭＤＲＶ；９：ＲＥＶ；１０：ＤＴＭＵＶ－ＪＮ图２㊀特异性实验Ｆｉｇ２㊀ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙ图３㊀ＤＴＭＵＶ－ＪＮ株Ｅ基因扩增区域基因序列Ｆｉｇ３㊀ＧｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｇｅｎｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｇｉｏｎｏｆＤＴＭＵＶ－ＪＮｓｔｒａｉｎ１：阳性对照；Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；２：１０－９；３：１０－８；４：１０－７；５：１０－６；６：１０－５；７：１０－４；８：１０－３；９：１０－２；１０：１０－１１：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；２：１０－９，３：１０－８，４：１０－７，５：１０－６，６：１０－５，７：１０－４，８：１０－３，９：１０－２，１０：１０－１图４㊀敏感性分析Ｆｉｇ４㊀ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙ１：阳性对照；Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；２－１７：待检疑似ＤＴＭＵＶ发病样品１：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｋｅｒ；２－１７：ＳｕｓｐｅｃｔｅｄＤＴＭＵＶｓａｍｐｌｅｓ图５㊀应用性检测Ｆｉｇ５㊀Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ３㊀讨㊀论在前期调查研究以及曹贞贞等人研究基础上，已基本明确该病毒可能属于黄病毒科成员［６］㊂根据国际病毒分类委员会第五次病毒分类报告，黄病毒科黄病毒属分为蜱传病毒㊁蚊媒病毒和节肢动物媒介未知的病毒，其中，蚊媒病毒类又分为Ａｒｏａ病毒群㊁登革热病毒群㊁日本脑炎病毒群㊁科科贝拉病毒群㊁恩塔亚病毒群㊁斯庞德温尼病毒群和黄热病病毒群［７］㊂依据现有研究结果，黄病毒的基因组为单股正链ＲＮＡ，全基因组长约１０９９０ｂｐ，分别编码３种结构蛋白（Ｃａｐｓｉｄ㊁ＰｒＭ和Ｅｎｖｅｌｏｐ）㊁８种非结构蛋白（ＮＳ１㊁ＮＳ２Ａ㊁ＮＳ２Ｂ㊁ＮＳ３㊁ＮＳ４Ａ㊁２Ｋ㊁ＮＳ４Ｂ和ＮＳ５），另外在其基因组５＇端和３＇端均有一段非翻译区［８］㊂为此，我们在设计检测引物时为便于今后开展分子流行病学研究，以Ｅ基因为检测靶基因，从ＮＣＢＩ上下载了５１个黄病毒的全基因序列以及率先发表的白洋淀病毒（ＢＹＤｖｉｒｕｓ）及相关水禽黄病毒的Ｅ基因进行了多序列比较，设计了一对黄病毒通用检测引物，以期获得较好的检测结果㊂结果证实，该方法是成功的，具有极佳的扩增效果㊂准确㊁快速地诊断疫病是畜禽疫病防控工作的首要环节㊂传统的实验室诊断方法如病毒分离㊁免疫荧光法等不仅操作繁琐，而且耗时费力，而ＰＣＲ或ＲＴ－ＰＣＲ技术主要针对病原体的基因组，具有良好的敏感性和特异性，对样品的要求不高，已广泛应用于多种病原体的检测和流行病学调查［９－１１］㊂本研究设计了具有通用性的针对黄病毒Ｅ基因核酸序列的特异性引物对，建立的ＤＴＭＵＶＲＴ－ＰＣＲ方法具有较好的特异性，即使将阳性对照模板稀释至１０－６仍能够检测到目的片段，具有极好的重复性；对临床病料中的１４份疑似病例进行检测，检出阳性样品６份，该种黄病毒感染阳性率达４２．８６％，表明试验建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可用于该病的实验室检测／诊断㊂参考文献：［１］㊀ＳｕＪ，ＬｉＳ，ＨｕＸ，ｅｔａｌ．Ｄｕｃｋｅｇｇ－ｄｒｏｐｓｙｎｄｒｏｍｅｃａｕｓｅｄｂｙＢＹＤｖｉｒｕｓ，ａｎｅｗＴｅｍｂｕｓｕ－ｒｅｌａｔｅｄｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯＮＥ，２０１１，６（３）：ｅ１８１０６．［２］㊀范根成，刘东，栾栋祖，等．一种新发鸭病的流行病学调查报告［Ｊ］．中国动物检疫，２０１１，２８（１）：６８－６９．㊀ＦａｎＧＣ，ＬｉｕＤ，ＬｕａｎＤＺ，ｅｔａｌ．Ａｎｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｓｕｒｖｅｙｏｆａｎｎｅｗｄｕｃｋｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＱｕａｒａｎｔｉｎｅ，２０１１，２８（１）：６８－６９．［３］㊀滕巧泱，颜丕熙，张旭，等．一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡［Ｊ］．中国动物传染病学报，２０１０，１８（６）：１－４．㊀ＴｅｎｇＱＹ，ＹａｎＰＸ，ＺｈａｎｇＸ，ｅｔａｌ．Ａｎｎｏｖｅｌｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｃａｕｓｉｎｇｄｕｃｋｅｇｇｄｒｏｐｓａｎｄｄｅａｔｈ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２０１０，１８（６）１－４．［４］㊀张大丙．鸭出血性卵巢炎发生的本质与危害［Ｊ］．中国禽业导刊，２０１２，２９（６）：８ ９．㊀ＺｈａｎｇＤＢ．Ｅｓｓｅｎｃｅａｎｄｄａｍａｇｅｏｆｄｕｃｋｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｏｔｉｓ［Ｊ］．ＧｕｉｄｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｏｕｌｔｒｙ，２０１２，２９（６）：８－９．［５］㊀韦天超，农海连，磨美兰，等．鸭出血性卵巢炎病原学研究进展［Ｊ］．广西畜牧兽医，２０１２，２８（３）：１８２－１８４．㊀ＷｅｉＴＣ，ＮｏｎｇＨＬ，ＭｏＭＬ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｅｔｉｏｌｏｇｙｏｆｄｕｃｋｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｏｔｉｓ［Ｊ］．ＧｕａｎｇｘｉＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｃｉｎｅ，２０１２，２９（３）：１８２－１８４．［６］㊀曹贞贞，张存，黄瑜，等．鸭出血性卵巢炎的初步研究［Ｊ］．中国兽医杂志，２０１０，４６（１２）：３－７．㊀ＨｕａｎｇＺＺ，ＺｈａｎｇＣ，ＨｕａｎｇＹ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｄｕｃｋｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｏｖａｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，４６（１２）：３－７．［７］㊀李泽君．鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究［Ｊ］．中国家禽，２０１ｌ，３３（１７）：３４－３５．㊀ＬｉＺＪ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｄｕｃｋｔｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＰｏｕｌｔｒｙ，２０１１，３３（１７）：３４－３５．［８］㊀ＹａｎＰ，ＺｈａｏＹ，ＺｈａｎｇＸ，ｅｔａ１．ＡｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｕｃｋｓｃａｕｓｅｄｂｙａｎｅｗｌｙｅｍｅｒｇｅｄＴｅｍｂｕｓｕｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｉｎｍａｉｎｌａｎｄＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１１，４１７（１）：１－８．［９］㊀ＬａｎｃｉｏｔｔｉＲＳ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．ＡｄｖｅｎｔｕｒｅＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６１：６７－９９．［１０］万春和，施少华，程龙飞，等．鸭出血性卵巢炎病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．福建农业学报，２０１１，２６（１）：１０－１２．㊀ＷａｎＣＨ，ＳｈｉＳＨ，ＣｈｅｎｇＬＦ，ｅｔａｌ．ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＲＴ－ＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｄｕｃｋｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｏｖａｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＦｕｊｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１１，２６（１）：６７－６９．［１１］王林川，李庆阳，陈瑞爱，等．鸭出血性卵巢炎广东病例报道及其ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立［Ｊ］．广东畜牧兽医科技，２０１１，３６（６）：２７－２９．㊀ＷａｎｇＬＣ，ＬｉＱＹ，ＣｈｅｎＲＡ，ｅｔａｌ．ＤｕｃｋｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｏｖａｒｉｔｉｓｉｎＧｕａｎｇｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃ⁃ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｃｉｎｅＳｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３６（６）：２７－２９．（编辑：李文平）。
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清为 本实 验室 以 Ｄ Ｔ ＭＵ Ｖ Ｚ Ｊ ４ ０ ７病 毒 鸭 胚 尿 囊 液 浓 缩 的灭活 苗免 疫麻 鸭 制 备 ， 标 准 阴 性 血 清 为采 集 未 毒 性 肝 炎病 毒 （ Ｄ Ｈ Ａ Ｖ） 、 鸭 源新 城 疫 病 毒 （ Ｎ Ｄ Ｖ） 、 禽 流 感 病 毒
之 间为可 疑。该方 法检测禽流感病毒 、 鸭源 新城疫 、 鸭 甲肝病毒 、 鸭 圆环病 毒 、 鸭 细小病 毒 、 经典 呼肠孤病 毒
及新 型鸭 呼肠 孤病 毒 等血 清均 为 阴性 ， ４个 批次 批 内与批 间重 复试 验 的 Ｏ Ｄ值变 异系 数分 别为 ６ ． ２ １ ％～
７ ． ２ ７ ％和 ３ ． ４ ％ 一 ７ ． ２ ％， 显示该法具有 很好 的特异性 、 稳定性 和重 复性 。用建立 的间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ与 中和试 验分 别对 １ ０ ８份疑似鸭坦布苏病血 清样 品进行检测 ， 两种方 法的阳性 符合 率为 ８ ３ ． ３ ％。
构域 ＤⅢ在病毒 吸附、 与宿主细胞膜融合以及病毒 组 装过 程 中起重 要作 用 。
基金项 目： 浙江省重 点科技 创新 团队 （ ２ ０ １ ０ Ｒ ５ ０ ０ ２ ７） ， 浙 江省科
２ ０ １ ４年 第 ５期
（ ＜＜ ＜
浙 江 畜牧 兽 医
试 验
研 究 ＞ ＞ ＞ ＞ ７ １
鸭 坦布 苏 病 毒抗 体 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检 测 方 法 的 建 立和 应 用
余 斌 ， 华 炯钢 ， 刘 跃生 ， 赵 灵燕 ， 倪 云 涛 ， 陈 柳 ， 徐 辉¨ ， 张 征 ， 叶 伟成 ， 存ｈ
放 式 阅读 框 （ Ｏ Ｒ Ｆ ） ， 从５ ， ＿ ３ 依 次 编码 Ｃ蛋 白 （ 核 衣 壳 蛋 白） 、 ｐ ｒ Ｍ ／ Ｍ 蛋 白（ 衣壳蛋 白） 、 Ｅ蛋 白（ 囊 膜 蛋 白） 、 非结 构 蛋 白 Ｎ Ｓ １ ． Ｎ Ｓ ２ ． Ｎ Ｓ ３ 一 Ｎ Ｓ ４ ． Ｎ Ｓ ５ 。其 中 Ｅ 蛋 白为主要 的结 构 蛋 白 ， 有 ３个 结 构域 组成 ， 其 中结
（ １ ． 浙 江省农 业科 学院 畜牧 兽 医研 究所 ， 浙 江杭 Ｊ ＇ Ｉ ３ １ ０ ０ ２ １ ； ２ ． 嘉 兴职业技 术学 院 ；
３ ． 浙 江省 动物 疫病预 防控 制 中心 ） 摘要： 为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒（ Ｄ Ｔ Ｍ Ｕ Ｖ） 抗体检测方法， 采用原核表达系统对
减， 甚至 停 产 ， 发病率达 １ ０ ０ ％， 死亡率约 ５ ％ ～ １ ０ ％ 。 目前 ， 华北 、 华 中、 华 南 和 西南 等 地 均有 该 病
本研 究对 鸭坦 布苏 病毒 Ｅ蛋 白的 ＤⅢ结构 域进 行 了克 隆 ， 然 后 串联表 达 ， 并 进行 表达 产物 的免疫 原
关键 词 ： 鸭坦布苏病毒 ； ＤⅢ结构域 ； 串联表达 ； 间接酶联免疫 吸附试 验
中 图分类 号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ３ ２ 文献标 识 码 ： Ａ 文章 编号 ： １ ０ ０ ５ — ７ ３ ０ ７ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ５ — ０ ０ ０ １ — ０ ０ ６
鸭坦 布 苏 病 毒病 是 由鸭 坦 布 苏 病 毒 （ Ｄ Ｔ ＭＵ Ｖ） 引起的一种传染病 ， 该病 ２ ０ １ ０年 ５月在浙江 、 江苏 、 福建 等地 发生 感染 ， 主要 引起 蛋 鸭 和 种 鸭 产 蛋 量 骤
性检 测 。 以串联 表达 的 ＤⅢ结 构域 蛋 白作 为包 被抗 原， 初 步 建 立 了快 速 检 测 Ｄ Ｔ ＭＵ Ｖ 抗 体 的 间 接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方 法 ， 该 方 法 的 建 立 为该 病 的快 速 检 测 和流
发 生 的报 道 ， 流行 区域几 乎遍 及 我 国主要 水禽 产 区。 据 国家 水 禽 产 业 技 术 体 系 ２ ０ １ ０年 １ １月 份 调 查 显
ｚ Ｊ ４ ０ ７由本 实验 室 分 离 并 保 存 ， 鼠抗 鸭 Ｉ ｇ Ｇ ． Ｈ Ｒ Ｐ二 抗 由本实 验室 制备 。原 核表 达载 体 ｐ Ｅ Ｔ － ２ ８ ａ （＋） 为
Ｎ ｏ ｖ ａ ｇ ｅ ｎ公 司 产 品 ， 感 受态细胞 Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ １ ０ 、 Ｂ Ｉ ２１
（ Ｄ Ｅ ３ ） 购 自北京某 生 物技 术有 限公 司 。标准 阳性 血
示， 该 病造 成 的经 济损 失 已超 过 ５ ０亿元 。
行病 学调 查提 供 了技术 手段 。
１ 材料 与方 法
１ ． １ 病 毒、 载 体、 菌种 及血 清
Ｄ Ｔ ＭＵ Ｖ 病 毒 株
Ｄ Ｔ ＭＵ Ｖ病 毒粒 子直 径 约 ４ ５ ｎ ｍ， 有脂质囊膜。 病 毒基 因组 为 单 股正 链 Ｒ Ｎ Ａ， 大小 为 １ ０ ９ ９ ０ ｂ ｐ 。５ 端和 ３ 端各 有 一非 编码 区 （ Ｎ Ｃ Ｒ） ， 其 余 为一 个 大 开
Ⅲ蛋 白作为包被抗原 ， 初步建立 了检测 Ｄ Ｔ ＭＵ Ｖ血 清抗体 的间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方 法。采用梯度稀释法对 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ各种
反应条件进行优化 ， 确定最适工作条件 。重组抗原 最适包被 浓度为 ５ ｍＬ ， 血 清的最佳 稀释度为 １ ： １ ０ ０ ， 兔
抗鸭酶标抗体最适稀 释度为 １ ： １ ０ ０ ０； 抗体临界值 Ｓ ／ Ｐ≥０ ． ３ ３ ６判定为阳性 ， Ｓ ／ Ｐ ￣０ ． ２ ８ ７判定 为阴性 ， 介 于两者