从microarray时序表达数据识别周期表达基因

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microarray原理

microarray原理Microarray是一种广泛应用于生物学的先进技术，它可以在同一芯片上同时检测数千个DNA或RNA分子，从而实现快速分析微生物、血液样品、肿瘤组织等生物材料中的基因表达和变化，提供有用的分子生物学和临床诊断信息。

本文将对Microarray技术的原理及其应用进行详细介绍。

Microarray的原理是通过将不同的DNA或RNA序列固定在硅片、玻璃片等载体上，形成序列阵列，然后根据分子混杂（Hybridization）的原理，将待检测的DNA或RNA样品与阵列上的DNA或RNA序列杂合，从而实现对样品中不同基因表达量的检测。

以DNA Microarray为例，其制备方法如下：1.准备芯片：芯片上需要有数千个DNA探针序列，这些探针通常由典型基因组的重复区域或相应功能基因的特定区域共同组成。

2. DNA提取和标记：提取待检测样品中的DNA，将其上的杂合链条（single stranded）进行荧光标记，以便于检测。

3.杂交：将标记后的DNA样品与芯片上的DNA探针序列进行杂交，杂交机理是互补互为碱基对（A-T, G-C）的搭配。

4.芯片扫描：利用芯片扫描仪，分别测量荧光强度得到每个探针序列对应的探针寡核苷酸片段，进而分析DNA样品上的基因表达量。

除了DNA Microarray，还有RNA Microarray等其他形式的Microarray技术。

RNA Microarray的检测原理与DNA Microarray大致相同，只不过是通过同样的步骤，将RNA样品进行标记和杂交，实现对基因表达水平的监测。

Microarray技术具有高通量、多样性、高灵敏度和高重复性等特点，已经被广泛应用于许多研究领域。

例如，在肿瘤研究中，可以使用Microarray检测癌症患者样本中高表达基因和低表达基因，然后进行聚类分析，以便于发现不同肿瘤类型之间的差异；在微生物学中，可以使用Microarray技术快速检测食品中的致病微生物，以实现食品卫生监测；在临床诊断中，Microarray技术可以检测患者DNA样品中的基因突变，以帮助医生定制个性化的治疗方案。

生物信息学中的基因表达数据分析教程

生物信息学中的基因表达数据分析教程基因表达数据分析是生物信息学中的重要研究领域，它帮助我们理解基因在不同条件下的表达模式，揭示基因功能和调控机制。

本篇文章将为您介绍基因表达数据分析的基本流程和常用的方法。

一、基因表达数据基因表达数据是指基因在细胞或组织中的相对或绝对表达水平。

它可以通过不同的实验方法获得，如基因芯片（microarray）和高通量测序（high-throughput sequencing）技术。

这些技术产生的数据量庞大，需要通过生物信息学的方法进行分析和解释。

二、常用的基因表达数据分析方法1. 数据清洗和预处理基因表达数据分析的第一步是对原始数据进行清洗和预处理。

这包括数据质量控制、噪声去除、基因表达量的归一化和批次效应的去除等。

这些步骤有助于提高数据的准确性和可靠性。

2. 异常值检测在基因表达数据中，可能存在异常值或离群点。

这些异常值可能是实验误差、生物学变异或技术偏差导致的。

通过统计学和可视化方法，我们可以检测和处理这些异常值，以避免其对后续分析结果的影响。

3. 差异表达分析差异表达分析是基因表达数据分析的核心内容之一。

它可以帮助我们发现在不同生物条件下表达差异显著的基因。

常用的差异表达分析方法有t检验、方差分析、贝叶斯方法等。

这些方法可以对基因的差异表达进行统计检验，并筛选出差异表达显著的基因。

4. 功能富集分析功能富集分析可以帮助我们理解差异表达基因的功能和参与的生物过程。

通过将差异表达基因与公共数据库中的功能注释进行比较，我们可以发现这些基因所参与的通路、功能和生物过程。

常用的功能富集分析工具包括DAVID、GOstats、KEGG等。

5. 聚类和可视化聚类分析可以帮助我们将基因表达数据划分为不同的表达模式，从而揭示基因之间的关联和功能聚类。

常用的聚类方法包括层次聚类、k均值聚类、PCA等。

可视化还可以通过图表、热图和网络图等方式直观地展示基因表达模式和差异表达基因。

6. 基因网络分析基因网络分析可以帮助我们理解基因之间的相互作用和调控关系。

转录组高通量测序转录组数据分析差异表达基因分析

Genei Sum(genei)
sampleA a c
sampleB b d
• ᵡ2=[(ad-bc)2(a+b+c+d)]/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)] • df=1
Illumina Genome Analyzer
3.转录组数据分析
4.差异表达基因分析
• 统计学分析： • 1. Fold change, 一般2-fold increase or decrease (平行实验的样本较
少) • 2. p-value (平行实验的样本较多)
under-expressed
• 1.转录组 • 2.高通量测序 • 3.转录组数据分析 • 4.差异表达基因分析 • 5.趋势性上调和下调基因分析 • 6.基因集功能富集分析
1.1transcriptome
➢ 转录组（transcriptome）是指特定生物体在某种状态或某一生理条件下，细胞内所有基因转录产物的总和，包括信使RNA 、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。
illumina测序平台的特点
• 1）可控制的高通量：一次实验可读取量大于 15 亿个碱基/芯片 • 2）上样需求低：上样量只在pmol级（ng级） • 3）简单、快速、自动化 • 4）低错误测序比例
利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然的竞争减少了掺入的错配。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。（5）加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读

某科研项目拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

某科研项目拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1. 技术路线备注：蓝色背景填充部分为前期已完成工作。

2. 研究方法2.1 X、Y在结肠癌发生、发展中的作用和预后相关性1)回顾性收集肠癌临床标本500例，取手术切除的肠癌组织、匹配的肝脏转移灶手术和穿刺标本，新鲜组织液氮保存标本200例，石蜡块300例，全部病例均通过临床、影像学、病理诊断，术前未进行辅助治疗，来自某某医院2008-2013年临床收治病例，随访资料齐全。

2)免疫组化检测组织切片中X、Y蛋白的表达及定位，分别设立阴性对照、肿瘤对照、肝转移对照。

3)SPSS16.0统计软件对X、Y表达及定位与临床标本进行病理关联性分析和预后统计分析，了解X、Y表达情况与相关临床资料之间的关系，单因素生存分析对临床各项指标与结肠癌生存期进行相关性分析，建立Cox比例风险回归模型，综合探讨临床各因素和X、Y表达与结肠癌肝转移、转移灶形成及预后的相关性。

2.2 体外、体内水平研究X、Y基因在肠癌肝转移中的调节功能1)制备X-shRNA慢病毒，建立X稳定沉默的细胞株，以无义序列作为阴性对照，利用MTT实验观察X沉默后细胞的生长曲线；克隆形成实验检测X沉默后细胞的克隆形成能力；流式细胞术结合PI单染、Annexin-V双染检测细胞周期和凋亡情况；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。

与此同时，制备过表达X的慢病毒载体。

2)在稳定沉默X的结肠癌细胞中，导入过表达Y的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察X沉默且Y过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。

同样地，在稳定沉默Y的结肠癌细胞中，导入过表达X的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察Y沉默&X过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。

3)制备结肠裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，建立生长曲线，统计分析Y和X对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响，明确Y和X在结肠癌恶性增殖的作用。

基因表达谱的构建和分析方法

基因表达谱的构建和分析方法基因表达谱是指某一时刻细胞内基因转录水平的全面反映。

它对了解不同细胞状态的差异性、疾病发生机制及药物治疗等具有重要的意义。

本文将对基因表达谱的构建和分析方法进行简要介绍。

一、基因表达谱的构建基因表达谱的构建方法包括microarray和RNA-Seq两种主要技术方法。

1. microarraymicroarray技术是将探针（probe）固定在芯片表面用于检测不同的核酸分子。

其构建基因表达谱的流程如下：（1）提取全基因组mRNA，反转录为cDNA。

（2）将cDNA打标记并杂交到微阵列中。

（3）信号扫描与数据分析。

microarray技术具有高通量、快速、灵敏、重复性好等特点，被广泛应用于药物筛选、肿瘤检测和疾病诊断等领域。

但是，其局限在于存在信号的非特异性、探针设计的错误等问题。

2. RNA-SeqRNA-Seq技术是基于高通量测序技术，通过定量并分析RNA 样本中所有的转录本、可变剪切事件和基因表达状况。

其构建基因表达谱的流程如下：（1）提取RNA，并用RNA脱除重复序列技术去除rRNA。

（2）转录为cDNA。

（3）建立文库并测序。

（4）数据处理和分析。

RNA-Seq技术具有更高的分辨率和准确度，能够检测到新转录本和SNP，且不受局限于预先设定的探针。

但其存在成本、数据处理和分析的复杂度等问题。

二、基因表达谱的分析方法基因表达谱的分析方法包括聚类分析、差异表达基因分析、通路富集分析等多种方法，这里仅简要介绍其中的两种。

1. 聚类分析聚类分析可以将一组基因根据其表达特征分成不同的簇，并确定它们之间的相似度。

聚类分析是基于特征基因进行的，特征基因的数量对结果有重要影响。

聚类分析主要分为两种：层次聚类和k-means聚类。

层次聚类根据相似度建立基因树，然后根据阈值将基因分为不同的簇。

k-means聚类将基因分成固定数量的簇，通过相似度计算和簇内距离最小化来划分簇。

2. 差异表达基因分析差异表达基因分析用于比较两个或多个条件下基因表达水平的差异。

生物大数据技术在转录组表达水平差异分析中的使用技巧

生物大数据技术在转录组表达水平差异分析中的使用技巧随着生物学研究的不断深入，基因组学领域的技术和数据量也在迅速增加。

其中，转录组学作为研究基因表达的重要分支，已经成为了生物学研究中的重要工具。

转录组表达水平差异分析是一种常用的方法，用于发现不同条件下基因表达的差异。

随着大规模转录组数据的产生，生物大数据技术在转录组表达水平差异分析中的使用技巧变得越来越重要。

在转录组表达水平差异分析中，首先需要进行表达水平的量化。

常用的方法有RNA-seq和microarray。

RNA-seq技术通过对RNA样品进行测序，可以获得到全转录组的信息，包括差异表达基因和不同转录异构体。

而microarray技术则是通过探针的杂交实现对基因表达的测定。

接下来，在数据预处理阶段，需要对原始数据进行质量控制和去除噪声。

在质量控制方面，可以使用FastQC等工具对测序数据进行质量评估。

在去除噪声方面，可以使用一些常见的算法，如trimming，去除低质量碱基和去除接头序列等。

转录组表达水平差异分析的关键步骤之一是基因表达水平的计算。

常用的方法是对转录本的定量进行计算，如RPKM（Reads per kilobase per million reads）和TPM（Transcripts per million）等。

这些计算方法不仅可以考虑到基因和转录本长度，还可以进行跨样品的比较。

在表达水平计算完成后，需要进行差异表达基因的筛选和统计分析。

常用的方法包括Limma、DESeq2和edgeR等。

这些方法可以通过对样本之间的差异进行建模，找出在不同条件下显著差异表达的基因。

在差异表达基因的分析中，还需要进行富集分析，以了解差异表达基因的功能和通路。

常用的富集分析工具包括GO（Gene Ontology）和KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）等。

这些分析可以帮助研究人员进一步理解差异表达基因在功能和调控通路方面的特点。

基因功能研究方法

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3.2 反义RNA技术反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶基因的表达。
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3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构，单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
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芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
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• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。
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原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。

Microarray入门

Microarray 入门导言MICROARRAY，是固定在固体基片上的大量DAN序列的微阵列，是许多复杂核酸样本中特定DNA序列定性和定量研究的有效工具。

日益引起人们兴趣的MICROARRAY，已经用于基因作图、变异分析和基因表达的检测，并且，有希望成为科学研究和临床应用的标准工具。

从原理上和实践上，基因芯片都是已用于核酸定性、定量研究数十年的杂交方法（Southern blot[12]、Northern blot[13]、克隆杂交和点杂交[14]）的发展：标记样本，再与阵列杂交；杂交足够的时间后，适当地洗膜数次；然后，探针与固定在特定位置上的样本DNA互补杂交而显现杂交印迹。

用MICROARRAY做平行杂交研究的思想本身并不新鲜，排列在滤膜上的阵列已经被用了很多年[15-17]。

然而，不同领域的技术进步已把那些相当笨拙的膜变成了今天更加实用、有效的平行基因分析的方法：首先，大规模的测序工程产生的信息使得DNA集合聚集在一起成为可能，而这些DNA相当于许多组织（从细菌到人）中的全部基因或大部分基因；其次，技术进步已经使得生产高密度DNA阵列成为可能，从而使成千上万个基因展现在比标准的载玻片还小的面积上；最后，核酸荧光标记和荧光检测的进步使得这些芯片的应用更加简便、安全和准确。

本综述旨在描述一种微阵列技术的最新用法，通常被称作“点片”或“印片”。

之所以这样称呼是因为该方法是将通常的大于寡核苷酸（100bp以上）的DNA通过物理分配方法点在固体基片上，这与最近其它主流的微阵列技术（短的寡核苷酸被直接合成在固体支持物上[18，19]）方法不同。

在标准的点片操作中，把DNA样本（PCR产物、质粒等）装在96或384孔板中，用一个配有一束特殊设计点样针的机械手伸入板中相邻的样本孔中，吸上大约１µl的DNA样液，分别点在处理过的载玻片上。

通过交叉的方式，用适合96孔板的４根一束针头或384孔板的16根一束针头成功地将数千个DNA样本点在一个玻片面上。

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生物信息学
ＣｉａｏｒｌｆｉｎｏａｃｈｎｕａｏＢｏｆｍｔｓＪｎｉｒｉ
技术与方法
从ｍｃｏｒｙ时序表达数据识别周期表达基因ｉｒａｒａ
周到，东，艳红何周
Ｍｃｏｒｙｉａｒ作为一种大规模检测基因表达的技术手段 … ｒａ已被广泛应用于细胞周期的研究中，ｈ等人用ｍｃａｒＣｏｉｏｒｙｒａ对ｃｃ８阻断／ｄ２释放后的酵母细胞进行检测，得到了一组细胞周期时序表达数据；ｐｌａＳｌｎ等人用Ａｐａ因子阻断／ｅｍｌｈ释放法、离心淘洗法和ｃｃ５阻断／ｄｌ释放法分别将酵母细胞同步后，得到了三组细胞周期的ｍｃａａｉｏｒｙ时序表达数据。这些ｒｒ数据反映了细胞周期中基因表达值的波动情况，能用于分析识别周期表达基因Ｈ。Ｊｈｎｓｎ等人用局部最小平方回ｏａｓＪｏ归模型分析了上述时序表达数据中的ｃｃ８Ａｐ和ｃｃ５ｄ２、ｈｌａｄｌ三组数据，选择了４５个显著性在０５５．％之下的基因作为周
表达数据和一组可靠的周期表达基因集合对该方法的效果进行了测试，并与三种典型的周期表达基因识别方法的效果进行了比较。该方法能有效地从各种ｍｃａａ时序表达数据中识别周期表达基因。ｉｏｒｙｒｒ关键词：周期表达基因；－ｇ达周期；ｉｏｒｙ时序表达；ｍｃａｒ；ｒａ峰值特性中图分类号：３４１；Ｐ９Ｑ４．３Ｔ３１文献标识码：Ａ文章编号：６２５５２０）２８３１７ —５６（０８一０ —６一北武汉４０７）３０４
摘要：据周期表达基因的周期性和峰值特点，出了一种将ｍｃｏｒｙ时序表达数据划分为若干个基因表达周期，根提ｉａａｒｒ并对周期
内的峰值特点进行评估以识别周期表达基因的方法，能有效减小ｍｃｏｒｙ实验时的噪声干扰。选取了三组广泛使用的时序ｉａａｒｒ
ｅｈｎｔｒｈｅｍｈｓｗｓａｅｂｐｌｇｔｅｄｒｔｅｌｅｐｅｉａｓｇｏｃｍｒ．ｈｓｔｄｍｎｔｔｍｔｄａｄｏｅｒｔｄａｍｄｙａｐｎｒｉｅｎｃｌｃｃｘｒｓｎｄｔｕｉｅｂｎｈａｋＴｅｅｌｅｏｓａｏｈｔｅｅｏｉｆｈｅｆｅｌｙｅｓｏａｎｎｅｒｕｓｒｅ
期表达基因。Ｚａ等人和Ｌａ等人分别使用统计模型ｈｏｕｎ
较，分析表明，该方法能有效避免转录滞后和实验末期的信号减弱，并有效减小同步时带来的噪声干扰，能用于从ｍ一ｉｃａａ时序表达数据中识别周期表达基因。ｍｒｙｒ
ｔｒａｃｃｏｒａｍｅｉｓｄｔｎｄｏｔｏｅａｃｒｔｄｎｉｃｔｎｏｒｄｃｌｘｒｓｅｅｅ．Ａｃｍｐｒｏｅｗｅ１＂ｕｂｎｅｉｍｉｒａｒｙｔｅｓｒａｎｉｅａ，ａｂｍｎｍｌｃｕａｅｉｅｔａｉｆｐｉｉａｙｅｐｅｓｄｇｎｉｆｏｅｏｌｓｏａｉｎｂｔｅｎＯ１ｓ／
Ａｂｓｒｃ：ｃｒｉｇｔｈｅｐｒｏｃｐｔａｔＡｃｏｄｎｏｔｅｄｉｉｔａｔｏｒｄｃｌｙｅｐｅｓｄｇｎｓ，ｗｅｈｖｅｅｏｅｏｅｔｏｉｈｃｎｄａｉｈｔｉ— ｒｉｆｐｉｉａｌｘｒｓｅｅｅｅｏａｅｄｖｌｐｄａｎｖｌｍｅｈｄｗｈｃａｅｌｗｔｈｅｄｓ
Ｉｅｔｆｉｇｐｅｉｄｔｌｘｒｓｅｅｓｆｏｉｒａｒｙｄｔｄｎｉｙｎｒｏｉａｌｅｐｅｓｄｇｎｅｒｍｍｃｏｒａａａｙ
ＺＨＯＵｏ，ＤａＨＥｎＺＤｏｇ，Ｈ０Ｕｈ—ｈＹａｏ
（ｕｅＢｏｆｒａｉｎＨｂｉｉｉｏｍｔｓｄＭｏｃｌｒｍｇｎｎｃａｌｕＩａｉｅａｇ嘶ＬｂｒｔｙｕｚｏｇＵｉｏｃ．＆Ｔｃ，Ｗｔｎ４０７，ｈｎａｏｏ，Ｈａｈｎｎ．ａｒｆＳｉｅｈ．ｔａ３０４Ｃｉｈａ）
１基因表达周期的划分
ｔａ１＂ｔｏｓｅｅｔｅｉｅａａｙｉｏｘｒｓｉｎｄｔｔｓｒａｃｓｈｔ１ｍｅｄｉｆｃｖｔｎｌｓｅｐｅｓａｗｈｄｔｂｅ．Ｏ／ｈｉｎｈｓｆｏａｉｉｕｎ
Ｋｅｏｄｓ：ｒｏｃｌｘｒｓｅｅｅ，ｃｌｃｃｅ，ｇｎｘｒｓｉｎｄｔｙＷｒｅｐｉｄｉａｌｅｐｅｓｄｇｎｓｅｌｙｌｙｅｅｅｐｅｓｏａ，ｐａｒｉａｅｋｔａｔ