胡萝卜素愈伤组织培养开题报告
胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究
山西师范大学学报(自然科学版)第18卷第2期Journal of Shanxi Teacher c s University Vol.18No.2 2004年6月Natural Science Edition June2004文章编号:1009-4490(2004)02-0071-06胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红(首都师范大学生物系,北京100037)摘要:分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125@104个/mL~2.325@104个/50mL时,7d~9d为对数生长期;继代培养4代~5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.关键词:胡萝卜;组织培养;细胞悬浮培养;松散型愈伤组织;生长曲线中图分类号:S631.2文献标识码:A胡萝卜(Daucus carota L.),属于十字花科植物,是一种十分重要的蔬菜作物,由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培.中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要[1].近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,作为生物技术研究的理想材料,许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究.我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展,特别是在组织培养、原生质体融合[2]、遗传转化及再生等方面.但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多,因此继续深入研究还是很有必要的.本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物A-胡萝卜素、B-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础.1材料和方法1.1材料来源胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供.1.2方法收稿日期:2004-03-22作者简介:尹文兵(1979)),男,山西安泽人,首都师范大学在读硕士研究生,主要从事功能基因组学方面的研究.72山西师范大学学报(自然科学版)2004年1.2.1胡萝卜愈伤组织的诱导(1)以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导[2].将胡萝卜种子搓去种毛,然后在75%的酒精中消毒5min,无菌水冲洗一遍后,用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍,接种在无激素的MS培养基上.10d左右种子开始萌发,待两片子叶伸展,而心叶刚刚显露时,将幼苗的下胚轴和子叶切成0.3c m 左右的小段,接种在附加植物激素1.0mg/L2,4-D,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT,2.0mg/L 2,4-D,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT的MS培养基的三角瓶中,培养30天左右,即可诱导出愈伤组织.继代培养时,将老的和生长不良的愈伤组织去掉,将大的健康的愈伤组织切至0.5c m,再放于含0.1mg/L2,4-D的MS培养基(pH5.7)上继续培养.诱导和继代培养均在黑暗条件下进行,培养温度为25e,继代培养时间为3周~4周更换一次培养基.观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化.(2)以胡萝卜直根形成层为外植体诱导.用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒5min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/ 3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3mm,宽1.5mm,高1mm的小长块,接种在(1)中的诱导培养基上,获得愈伤后进行继代培养,培养环境条件与(1)相同.1.2.2胡萝卜细胞悬浮系的建立[3]用镊子夹取在固体继代培养基上继代20d左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤,接种在含0.3mg/L2,4-D的液体培养基(pH5.7)中,每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL,摇床转速为110r/min,温度为25e,黑暗培养.每隔7d继代一次,连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系.细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同,但不加琼脂.每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相,进行细胞计数,以建立细胞数生长曲线.1.2.3细胞悬浮生长曲线的测定取0.5g悬浮培养物,接入新鲜液体培养基中,进行振荡培养,每隔1d取样1次,共培养13d,连续做3次平行实验.1.2.4悬浮细胞数目的测定用血球计数板法[1]对胡萝卜悬浮细胞计数,全部操作在无菌环境下进行,每个结果为4次平行实验的平均值.细胞数按下面公式计算:1mL悬浮液中的总细胞数=A/5@25@ 104@B,A为5个中方格总细胞数,B为稀释倍数.2结果与讨论2.1外植体对愈伤组织状态的影响有文献报道,不同外植体的脱分化能力不同,诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也不同.在胡萝卜愈伤组织诱导时,本实验采用三种外植体:胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层.经过30d观察发现,三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织.结果如下:以子叶为外植体的大约有2/3诱导获得了愈伤组织,多数愈伤组织呈浅黄色,生长旺盛,质地松散,含水量大,分散性好,但也有一些状态不好,色泽发暗,选取好的可作为细胞悬浮培养的材料;以下胚轴为外植体几乎所有都获得了愈伤组织,并且愈伤组织生长旺盛,呈黄色,比较疏松,分散性好,适宜于细胞悬浮培养;而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织不多,色泽较暗,有些带褐色,愈伤组织生长缓慢,质地较硬,分散度差,不适宜于细胞悬浮培养.因此,可认为胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体.2.2 激素对愈伤组织状态的影响不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性,而这些因素又是松散愈伤组织的关键,也是进行细胞悬浮培养的必要前提.因此,本实验诱导胡萝卜愈伤组织及继代培养设计了4种激素组合[见1.2.1(1)],通过多次继代培养发现,1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 组合诱导出的胚性愈伤组织(见图1)生长旺盛、呈黄色米粒状分散性好、质地松软、含水量小,有利于细胞悬浮培养,而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培养.其他3种组合中,2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 诱导出的愈伤组织也比较疏松,而另两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实,有褐化现象.可见,2,4-D 与KT 的结合有利于疏松愈伤组织的诱导.图1 胡萝卜松散型愈伤组织 左图:胚性愈伤 右图:半胚性愈伤Fig.1 The imcompact calli.of Daucus carota L Left:embrogenic callus Ri ght:semiembrogenic callus2.3 继代次数与细胞状态之间的关系在细胞悬浮培养的过程中,需要不断地进行继代,来筛选出良好的、较稳定的细胞系.继代过程中,细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化.第1、2次继代时,细胞悬浮液为白色或浅黄色,混浊,有许多大颗粒,倒置显微镜下观察,细胞多数成团,保持较旺盛的分裂能力,单细胞大多呈长形、梭形、不规则形(见图2),细胞个体较大;3、4次继代时,细胞悬浮液变为黄色,比较粘稠,颗粒大小分布均匀,倒置显微镜下观察,分裂的细胞团增多,有的细胞团明显可见有20个~30个球形细胞组成,单细胞数目增多,而且大多呈球形;5次继代时,细胞悬浮液(见图3)呈透明的黄色,澄清,呈油状流动,颗粒分布很均匀,直径大多在0.5m m~1mm,倒置显微镜下观察,细胞团和单细胞很多,大多呈球形(见图4),大小均匀;6、7次继代以上时,悬浮液变得比较澄清,呈浅黄色,悬浮颗粒大小均匀,倒置显微镜下观察,细胞大多成团,可以清楚的看出细胞呈球形,比较均匀,73 第2期 尹文兵,等:胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究也有单细胞,但是不多,这可能与细胞聚集成团的特性有关.图2 不规则细胞(10@) 图3 黄色的细胞悬浮液Fig.2 Irregular cell (10@)Fig.3 Yellow cell suspension因此,继代培养过程中,随着继代次数的增多,细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色,由混浊变为澄清、透明,颗粒大小由不均匀到均匀,最终直径在0.5mm~1mm,倒置显微镜下观察,单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形,细胞系逐渐趋于稳定.随后,我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的MS 培养基上,7d 后长出新的愈伤组织,30d 后长出胡萝卜全苗并转入蛭石成活(图5),说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的.图4 球形细胞(40@) 图5 再生植株Fi g.4Global cell (40@) Fig.5Plant regeneration2.4 细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响在细胞悬浮培养时,细胞生长需要一个最低生长密度,低于此密度,细胞生长速率降低或根本不生长[4].适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间,起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立.同时,细胞的起始密度对细胞培74山西师范大学学报(自然科学版) 2004年养周期也有影响.为此,本实验设计了4个密度梯度:0.4@104个/50mL,1.125@104个/50mL,2.325@104个/50mL,8.875@104个/50mL.培养13d,细胞状态随天数的变化见表1。
胡萝卜愈伤组织诱导实验报告
南昌大学实验报告胡萝卜愈伤组织诱导姓名：学院：专业：班级：学号：胡萝卜愈伤组织诱导实验一母液的配制与保存一、实验目的1.学习母夜的配制方法和母液的保存方式。
2.熟悉掌握制备母液的操作。
二、实验原理培养基中提供植物生长所需的营养成分，才能满足植物正常的生长发育的需求。
主要包括水分、有机物质、盐类，而配制母液时将其分为大量、微量、钙盐、镁盐、铁盐、有机和肌醇分别配制。
配臵培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配臵，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液臵于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配臵即可。
三、实验材料、试剂和仪器设备1．试剂NH4NO3,KNO3,KH2PO4,CaCl2〃2H2O,MgSO4〃7H2O,FeSO4〃7H2O Na2-EDTA, MnSO4〃4H2O,ZnSO4〃7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4〃2H2OCuSO4〃5H2O,CoCl2〃6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水。
2.仪器设备电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。
四、实验步骤 1 、计算：计算各化学成分所需要的量。
大量、微量和盐类按扩大50倍，定容500ml的配制计算。
有机和肌醇按扩大100倍，定容200ml的配制计算。
计算后制成配方表。
2、制定标签：裁取7张适当大小的牛皮纸，用铅笔写上MS，种类，并标明此类母液所含物质，质量，定容体积，扩大倍数吸取量，制备人，制备日期。
3、大量元素母液的配制：先用量筒量取300ml蒸馏水放入500ml 烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，溶解过程用玻璃棒搅拌，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml 容量瓶中，并用蒸馏水将烧杯和玻璃棒洗涤3次，每次约50ml，而后用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，并臵于冰箱中低温保存备用。
实验2-4 胡萝卜愈伤组织的继代培养
4.药品和试剂
愈伤组织继代培养基、75％酒精、MS培养基 和常用试剂母液、蒸馏水。
5.实验材料
处于脱分化进程中的外植体
6.实验流程
（1）胡萝卜愈伤组织的继代培养 ①准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和 消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、 待用培养基等的准备；实验材料的准备（选 择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体 的三角瓶摆放于净工作台上）
②愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污 染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈 伤组织继代诱导培养基上，放置在25 ℃全黑 暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得 足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
（2）胡萝基本培养基 + 2.0mg/L NAA + 0.1mg/L6-BA + 200mg/L水解酪蛋白 + 3％ 蔗糖
配制流程： 配制 调节pH值
封口包扎
灭菌
实验2.4 胡萝卜愈伤组织的继代培养
1. 实验目的
通过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继 代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范 无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮 培养的培养基。
2.实验内容
（1）胡萝卜愈伤组织的继代培养 （2）胡萝卜细胞悬浮培养培养基的配制
3. 主要实验用具
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级09级生物科学B班实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
一．实验设计方案
二．实验报告
⑴胡萝卜愈伤组织的诱导结果：
经过诱导，4瓶都出现污染状况，做继代培养用小组的实验材料。
⑵继代培养的结果：
如上图所示，继代培养得到的三瓶均无污染，三瓶中的愈伤组织增殖情况均良好，其中3瓶特别好，愈伤组织呈现结构疏松的特点。
污染情况：无污染。
长势情况：长势良好。
颜色情况：部分颜色有点暗淡，少部分为金黄色，颜色发亮。
胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心细胞工程实验实验报告胡萝卜愈伤组织诱导培养实验摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。
关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。
同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。
本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。
1.材料和方法1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。
1.2方法：1.2.1愈伤组织的诱导培养（1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8（2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤）（3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次；（4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块；（5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶（6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况1.2.2继代培养从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。
胡萝卜实验报告数据
一、实验目的1. 掌握植物组织培养技术，特别是胡萝卜愈伤组织的诱导培养方法。
2. 了解胡萝卜愈伤组织诱导过程中各因素对愈伤组织生长的影响。
3. 熟悉无菌操作技术，提高实验操作的规范性和准确性。
二、实验材料1. 胡萝卜（品种：心里美）2. MS培养基母液3. 常用试剂：琼脂、蔗糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、氯化钙、氢氧化钠、盐酸、酒精等4. 实验器材：超净工作台、高压蒸汽灭菌器、移液器、剪刀、镊子、培养皿、培养瓶等三、实验方法1. 胡萝卜外植体的选取与消毒选取胡萝卜根尖部位作为外植体，用70%酒精消毒30秒，再用无菌水冲洗3次。
2. 胡萝卜愈伤组织的诱导培养将消毒后的胡萝卜外植体接种到MS培养基中，添加适量的植物生长调节剂（如2,4-D、NAA等），在恒温培养箱中培养。
3. 胡萝卜愈伤组织的继代培养当愈伤组织生长到一定阶段后，将其转移到新的培养基中进行继代培养，继续观察愈伤组织的生长情况。
4. 胡萝卜愈伤组织的诱导效果分析通过观察愈伤组织的生长速度、颜色、质地等特征，分析不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响。
四、实验结果1. 胡萝卜愈伤组织的诱导培养在MS培养基中添加2,4-D浓度为0.5mg/L时，胡萝卜愈伤组织诱导效果最佳，诱导率可达90%。
2. 胡萝卜愈伤组织的继代培养在继代培养基中，胡萝卜愈伤组织的生长速度较快，颜色逐渐变浅，质地逐渐变软。
3. 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响在实验中，我们发现2,4-D、NAA、IAA等植物生长调节剂对胡萝卜愈伤组织的诱导效果有一定影响。
其中，2,4-D浓度在0.5mg/L时，诱导效果最佳。
五、实验结论1. 胡萝卜愈伤组织诱导培养是一种有效的植物组织培养方法，可用于植物繁殖、基因转化等研究。
2. 在胡萝卜愈伤组织诱导过程中，植物生长调节剂2,4-D对愈伤组织的诱导效果最佳。
3. 通过实验，我们掌握了胡萝卜愈伤组织诱导培养的基本操作技术，为进一步研究植物组织培养提供了实验基础。
胡萝卜愈伤组织培养及继代培养要点
本科学生综合性实验报告
学号：104120265 姓名：段昌福
学院：生命科学学院专业、班级：10应用生物教育B班实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
教师：杨世忠
开课学期：2013 至2014 学年第二学期填报时间：2013 年 6 月日
云南师范大学教务处编印
）无菌操作流程：
二．实验报告
书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔
人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远——普希金
人离开了书，如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫
书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉——库法耶夫
书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯
书籍便是这种改造灵魂的工具。
人类所需要的，是富有启发性的养料。
而阅读，则正是这种养料———雨果。
实验：胡萝卜愈伤组织的培养
C1-愈伤组织 C2-形成层
四、实验结果
• 计算：
• 污染率=污染的材料数/总接种材料数 ×100% • 诱导率=形成愈伤组织的材料数/总接种材料 数×100%
3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化） 组织块失去色素
把脱分化后的愈伤组织转移到培养基上
7~8周左右开始再分化，长出幼苗
一、实验背景及目的
• 3.实验分组
• 2-3人一组，每组做4个样品
二、实验仪器、材料及试剂的配制
• 1.实验仪器
• 生化培养箱，高压灭菌锅，超净工作台，医 用解剖刀，镊子，三角瓶，烧杯，平皿，灭 菌滤纸
二、实验仪器、材料及试剂的配制
• 2.材料及试剂 • ⑴实验材料：胡萝卜
二、实验仪器、材料及试剂的配制
一、实验背景及目的
植 外植 物 体脱 组 分化 织 培 养 基 本 步 骤 愈 伤 组 织 芽 根 器官发生 愈 伤 组 织 胚 状 体 植 物 体 植 物 体
人参愈伤组织
胚状体发生
一、实验背景及目的
• 2.实验目的 ⑴ ⑵ ⑶
熟练掌握植物组织培养的方法及其要点 熟练掌握培养基的配制 学会将胡萝卜根培养成愈伤组织
细胞分裂素
三、实验内容
• 2.培养基灭菌
三、实验内容
• 3.取材与消毒 • ⑴取材
P-木质部 C-形成层 X-韧皮部
三、实验内容
• ⑵消毒
• 切片经70%乙醇浸泡
5min，用20%次氯酸钠液
消毒20min。移入无菌 室，用无菌水洗3~5次。
将灭菌材料放在灭菌的滤 纸上，吸干水分。
三、实验内容
大量元素
微量元素
铁盐 有机物质
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胡萝卜素愈伤组织培养开题报告 1011421130 徐亮
1、本论文课题国内外概况和文献综述：
应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。
国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型、外植体、培养基、激素等因素。
胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。
对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高
[1-3]。
同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。
近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根
[1,3,4]。
此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏
根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果
[5]。
在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为MS 培养基对体细胞胚的发生更为有利。
但也有认为B5基础培养基略优于MS 基础培养基
[1]。
不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。
已有的研究结果表明，在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。
2,4-D 的浓度从0.1～10.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从0.2～4.5mg/L 不等，BA 的浓度从0.5～1.0mg/L 不等，KT 的浓度从0.2～2.0mg/L 不等
[2,3,6]。
此外还
有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势[7]。
2、本论文课题的理论和实际应用意义：
胡萝卜（Daucus carrot），属于十字花科植物，是一种十分重要的蔬菜植物。
由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。
中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。
近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展，作为生物技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。
我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展，特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。
但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多。
因此继续深入研究还是很有必要的。
此外，由于市面上的胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。
3、实验基本内容与方法：
（1）材料及设备：
6个培养皿、培养瓶、吸水纸、镊子、解剖刀、无菌操作台、胡萝卜直根（长度至少200mm,直径不小于40mm）、大约20% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液1000ml、75%酒精、MS培养基、2,4-D、KT
（2）实验步骤：
A.培养基的配制:
①取无菌水200ml
②依次加入母液:大量元素25ml、微量元素2.5ml、铁盐2.5ml、有机元素
2.5ml、重复6次，在6个培养瓶中加入生长素2,4-D、KT（用量如下表）
实验号基本培养基2,4-D（mg/L）KT （mg/L）
1 MS 0 0
2 MS 0 0.5
3 MS 1 0
4 MS 1 0.5
5 MS 2 1.5
6 MS 4 2.5
诱导率=（形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数）×100%
③在个瓶中称取并加入琼脂2g，蔗糖7.5g
④放微波炉里融化
⑤每瓶定容500ml
⑥调PH(5.8~6.0)
⑦包扎后高温灭菌，待凝固后备用
B.外植体的清洗和消毒：用小刷在流动的自来水下洗刷胡萝卜,除去表面的屑粒。
用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。
先用75%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钙溶液消毒10min，放入无菌水中漂洗2～3次，用无菌吸水纸吸干待用。
C.接种：在无菌操作台上操作，把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm 左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm 、宽5mm 、高1mm 的小长块。
将凝固的培养基融化后适量倒入6个培养皿，用镊子将切好的胡萝卜外植体接种在固体培养基上，每个培养皿5块，按上表放入6个培养皿中，表上编号。
放于黑暗处25℃条件下进行暗培养。
D.培养：接种后的培养皿放在无菌箱里培养,培养期间定期更换培养基,避免营养不足影响效果。
并且要定期消毒,严格控制温度,定时光照,使实验免受无关变量影响。
注意观察记录外植体的变化，是否有污染或诱导出愈伤组织。
4、实验进程： 理论日程
约两周后，观察并计算胡萝卜的诱导率
期间作如下记录简表:
记录人: 温度: 湿度: 日光照时间:
实验事项
时 间 分离胡萝卜直根的新鲜外植体及接种进入培养基 第1天 愈伤组织的显著增殖
约14天
实验号 基本培养基
2,4-D
（mg/L ）
KT （mg/L ）
诱导率（%）
1 MS 0 0
2 MS 0 0.5
3 MS 1 0
4 MS 1 0.
5 5 MS 2 1.5
6 MS
4
2.5
记录项目日期培养物数目形态变化污染物数目所作处理
5、主要参考文献：
[1]张娅,曾君祉,周志勇,等.胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立[J].植物学通报,2005,22(增刊):7-42.
[2]郑回勇,郑金贵,等.胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立[J].广西农业科学,2002(5):237-241.
[3]尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红.胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究[J].山西师范大学学报，2004(2):72-76.
[4]高金秋,于丽杰.胡萝卜体细胞胚再生系统的建立[J].北方园艺,2009(8):73-77.
[5]杨宁,郭勇.胡萝卜细胞培养产生胡萝卜素的研究[J].广西植物,1999,19(1),84-88
[6]胡蓉.胡萝卜愈伤组织建立中的几个问题探讨[J].川北教育学院学报：自然科学版，1995(2):7,16.
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