隐孢子虫的诊断学和流行病学近况

隐孢子虫的诊断学和流行病学近况
唐娜201054442
隐孢子虫的诊断学和流行病学近况
唐娜齐齐哈尔医学院
【摘要】隐抱子虫病是一种在世界范围内流行的人兽共患寄生虫病,各种受感染的家畜是其主要传染源。

本文介绍了近年来用于检测隐孢子虫的方法,包括病原学检测方法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法。

根据不同方法的敏感性和特异性,本文对所述方法的优缺点进行了对比分析,在具体实践中选择比较适合的隐孢子虫检测方法。

以及对流行病学研究现状分析。

【关键词】隐孢子虫;检验方法;流行病学;临床研究进展;综述
隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种全球性的人兽共患寄生虫病,有着重要的公共卫生意义。

其病原隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)可广泛寄生于禽类、哺乳类、爬行类和两栖类等170种以上的人和动物,在家畜中主要引起腹泻和呼吸道症状,导致生产性能下降或死亡,在人类最常见的症状是腹泻,尤其是婴幼儿和免疫功能低下或缺陷者(如AIDS患者、癌症化疗患者、长期大量服用激素类药物的重症患者等)特别易感,感染后病情严重,甚至危及生命。

目前隐孢子虫病已被列为引起人类最常见的6种复泻疾病之一,1986年,WHO将人的隐孢子虫病列为艾滋病的怀疑指标之一[1]。

1、隐孢子虫的诊断学
1.1卵囊分离与纯化方法
目前,隐孢子虫卵囊分离纯化方法的原理大多是根据卵囊密度与纯化介质密度之间的差异,通过离心使卵囊与纯化介质、杂质分离。

以下论述的卵囊分离与纯化方法都是利用这个原理,但优缺点各有不同。

1.1.1甘油饱和盐水漂浮法
甘油饱和盐水漂浮法[3]是用甘油与饱和盐水的混合液作为介质分离隐孢子虫卵囊的。

用该法收集的隐孢子虫卵囊液涂片、镜检结果:常见的隐孢子虫卵囊呈发亮、折光的球形体，该法被广泛应用于隐孢子虫的初步检测中。

虽然该法从粪便样品中分离的卵囊含杂质少,但由于卵囊为无色透明的小球体,故需对隐孢子虫的形态非常了解或有熟练的显微镜镜检技术的人员才能准确找到隐孢子虫卵囊。

1.1.2不连续蔗糖密度梯度离心法
不连续蔗糖密度梯度离心法[3]是利用隐孢子虫卵囊的密度在1:4和1:2蔗糖液的密度之间,通过梯度的设定分离卵囊的方法。

该法虽然比较耗时和复杂,但对卵囊浓集和纯化效果很好,比较适合于计数前的卵囊处理。

1.1.3饱和糖水漂浮法
饱和糖水漂浮法[4]是以饱和蔗糖水为介质,使离心后的隐孢子虫卵囊浓集于糖水表层,而其他密度大的杂质沉淀于糖水底层,达到使卵囊与杂质分离的目的。

该法是目前比较常用的方法之一,用此法收集的卵囊不仅数量多,而且由于隐孢子虫卵囊的子孢子在饱和蔗糖溶液中呈淡粉色,卵囊壁为1层薄膜,卵囊液呈透明状,故在400倍显微镜下可清晰识别和计数。

1.2卵囊染色镜检方法
1.2.1金胺-酚改良抗酸复染法
韩范等[5]将金胺-酚染色法和改良抗酸染色法结合起来,即经过金胺-酚染色后的标本,再用改良抗酸染色法复染,使所染隐孢子虫卵囊与非特异性颗粒着色明显不同,卵囊染为玫瑰红色,其他非特异性颗粒则染成蓝黑色。

这2种方法的结合使不具
备荧光显微镜的实验室亦可用金胺-酚染色标本,接着用改良抗酸染色法复染,再用光学显微镜检查。

目前,该方法被广泛用于隐孢子虫病的流行病学调查和诊断中。

1.3免疫学检测方法
1.3.1直接和间接免疫荧光法
直接和间接免疫荧光法的原理都是在抗原与抗体特异性结合,发生免疫学反应后,在荧光素的作用下通过显色来鉴定隐孢子虫的存在。

ＴｈａｄｄｅｕｓＫ.等人用直接免疫荧光法和间接免疫荧光法测隐孢子虫的检出率,结果两种方法的敏感性均为100%,而且不同种的隐孢子虫用这两种方法检测具有相似的特异性。

此实验说明用直接免疫荧光法和间接免疫荧光法检测隐孢子虫在常规条件下都具有较高的可行性。

直接免疫荧光法操作简便,特异性高,非特异荧光染色因素少,只是敏感度偏低,每检查1种抗原需制备相应的特异荧光抗体;间接免疫荧光法灵敏度高,而且在不同抗原的检测中只需应用1种荧光抗体,较适于常规操作。

1.3.2酶免疫荧光法
酶免疫荧光法是采用检测试剂盒,将隐孢子虫抗原的特异性抗体连接到96孔酶标板表面,依次加入待测样品、特异性酶标记抗体、发色底物,根据颜色的变化检测粪便中是否有隐孢子虫。

ＲａｙｍｏｎｄＣｈａｎ等用此试剂盒检测隐孢子虫,结果敏感性为98.7%,特异性为100%。

还有其他人做过这方面的试验,结果均表明酶免疫荧光方法是1种快速且高效的隐孢子虫检测方法。

1.4分子生物学检测方法
1.4.1常规ＰＣＲ常规ＰＣＲ是以少量隐孢子虫ＤＮＡ为模板,通过1轮ＰＣＲ扩增获得预计扩增片段,可用于隐孢子虫的常规检测。

尽管逆转录ＰＣＲ的特异性和敏感性很高,但在常规隐孢子虫检测或大范围隐孢子虫病流行病学分析时很少应用,因为其操作繁琐,耗材耗时,只有在特殊检测要求下或卵囊含量特别少时才会采用该方法。

1.4.2巢式ＰＣＲ2003年,张龙现等[6]用该法检测隐孢子虫,结果不仅扩增出新鲜样品ＤＮＡ提取物中的目的片段,而且还扩增出放置了6年之久的ＤＮＡ提取物中的目的片段。

巢式ＰＣＲ是目前应用较广的1种方法,用该法检测隐孢子虫具有属特异性,而且敏感度很高,不仅能检出新鲜样品中的隐孢子虫卵囊,还能检测出存放很久的样品中的卵囊,可以减少由于存放或运输样品时间过长而导致的检出率下降问题。

1.4.3 荧光定量ＰＣＲ荧光定量ＰＣＲ[7]结合了实时ＰＣＲ与荧光ＴａｑＭａｎ技术的优点,是1种高精确性的隐孢子虫检测方法。

半定量方法与ＰＣＲ技术结合可用于检测动物模型小鼠中感染隐孢子虫卵囊情况和评定某种药物对隐孢子虫病的治疗效果。

2、隐孢子虫的流行病学
2.1 隐孢子虫最初于1907年被Ｔｙｚｚｅｒ[8]发现,直到1976年Ｎｉｅ[9]和Ｍｅｉｓｅｌ[10]分别在美国报道了人体隐孢子虫病(ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ)病例。

国内1987年在南京首次发现了两例人体病例[11],以后安徽、徐州、内蒙和福建等省、市相继有报道。

1993年美国暴发了因水源污染而导致40.30万人感染和至少69人死亡的严重后果。

隐孢子虫病日益受到重视。

隐孢子虫病呈全球性流行,六大洲74个国家有报道,至少300个地区发现隐孢子虫病流行。

在不同国家或地区的不同免疫人群中隐孢子虫病的流行情况不同,在发达国家或地区艾滋病病毒阳性且伴腹泻者中感染率为1
3.8%,在免疫功能正常人群腹泻者中为2.1%;在发展中国家或地区艾滋病病毒阳性且伴腹泻者中为23.9%,在免疫功能正常人群腹泻者中为6.1%。

本病在人体的发病率与当地的空肠弯曲菌、沙门菌、志贺菌、致病性大肠杆菌和蓝氏贾第鞭毛虫所致腹泻的发病率相近,但在寄生虫所致
的腹泻中占首位,是儿童和免疫缺陷者腹泻的重要的病原。

全世界每年约有5 000万5岁以下儿童感染,美国有3%～4%的ＡＩＤＳ患者感染本病,非洲和海地则高达50%。

我国14个省(市、区)的腹泻儿童隐孢子虫平均感染率为2.14%,各地感染率为0.9%～9.7%[12]。

隐孢子虫病是世界性的人畜共患病,对人类和动物的健康均有重要的影响,被视为全球腹泻病中最常见的病种之一,且又是艾滋病的常见并发症,因此,隐孢子虫感染是一个不容忽视的公共卫生问题。

2.2流行特征
2.2.1流行因素隐孢子虫卵囊排出的数量多,排出后即具有感染力,且对外界抵抗力较强,各种常规的消毒剂对之杀伤力低。

卵囊被吞食后,不易被消化液杀死,反而有促进子孢子自囊内脱出的作用。

即使吞食少量的卵囊,宿主也可被感染。

此外,国际间的交往、人口的流动、环境污染、家庭饲养宠物的风行等因素增加了人类与隐孢子虫的接触机会;艾滋病患者、同性恋和吸毒人群的增加以及长期使用免疫抑制剂和滥用抗生素而造成免疫功能下降的人群的上升均造成隐孢子虫病的增加。

因此,隐孢子虫病在人群中传播、流行以及造成的危害有增加的趋势。

2.1.2地理分布隐孢子虫病分布广泛,与其他肠道寄生虫病不同的是,它不但多见于不发达的国家,即使在欧美等许多发达的国家也常常出现流行或暴发。

据美国文献报道,1984-1994年期间报道了19起隐孢子虫病的水传疾病的暴发[13]。

在英国,1986-1995年报道了21起水源性隐孢子虫病,19起发生于公共供系统,其余发生于私人用水系统。

我国20世纪80年代中期首次在重庆暴发,后来陆续也有相关报道。

欧美等发达国家随着同性恋者和艾滋病患者的增多,合并隐孢子虫的感染者也明显增加,且症状较重。

已将本虫列为艾滋病检查必检项目,该病列为艾滋病的怀疑指标之一。

另外,隐孢子虫的分布一般农村比城市多,沿海港口城市比内地城市多,经济落后、卫生状况差的地区比发达的地区多,畜牧地区比非畜牧地区多。

调查发现青岛市郊的隐孢子虫感染率大于市区[14]。

有报道说乡村学生隐孢子虫检出率高于城市,这可能是由于农村地区经济和生活条件较差,幼儿和青少年常有饮用生水等不洁饮食习惯,易因误食含隐孢子虫卵囊的食物而被感染[15]。

也有的报道与上述调查情况相反,如墨西哥普埃拉州城市和农村腹泻儿童隐孢子虫感染率分别为29.6%和9.4%,城市明显大于农村。

2.1.3季节性隐孢子虫病在一年内四季均有发生,但仍具有较强的季节性,温暖、潮湿季节发病率高。

卢安良[16]报道说国内夏季和秋季为高峰期(2.14%)。

陈有贵等在对江苏省城乡7个居民点进行调查,39例隐孢子虫感染病例均在夏季发现,高峰期为6～11月。

崔巍等发现沂蒙山区在夏、秋季粪便中隐孢子虫卵囊检出率为最高,表明隐孢子虫病的流行有季节性消长,多发生于温暖、雨季和湿润月份[17]。

综上所述：通过综述,在卵囊浓集方法中,建议用饱和糖水漂浮法,因为该法较其他方法简单,并且比较容易观察和鉴别,可作为初步鉴定的首选方法;在卵囊检测方法中,免疫荧光抗体法(ＩＦＡ)是快速准确的方法之一,;应用分子生物学技术不仅可以准确地检测隐孢子虫,而且可对基因型进行分析,从而了解基因变化与表现型差异之间的关系,鉴定基因型或发现隐种,推测和监控传染源和传播途径。

因此,今后将分子生物学技术结合并应用到隐孢子虫的检测中是1个研究热点,同时对提高隐孢子虫监测水平和公共卫生水平将会起到很大的推动作用。

隐孢子虫作为一种近年发现引起腹泻的肠道寄生虫,所致疾病是世界性的人畜共患病,对人类和动物的健康均有重要的影响,受到国内外学者的重视。

随着国际交流的日越成为重要的公共卫生问题。

根据流行病学特征和规律,加强预防,控制感染,搞好环境卫生,对患有隐孢子虫病的患者和病畜要隔离治疗,严防其排泄物污染饮用水源,以切断传播途径。

进一步研究隐孢子虫的形态分类,致病机制,积极研制和寻找特效药,以期达到控制和消灭隐孢子虫病的目的。

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