单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程1.鼠标免疫：选择合适的抗原，并将其注射到小鼠或其他啮齿动物的体内。
这样可以激发小鼠体内的免疫系统产生特异性的抗原抗体。
2.细胞融合：在小鼠免疫周期结束后，收集其脾细胞，并将其与癌细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合。
这一步骤将产生一组称为杂交瘤细胞的细胞群体，具有免疫系统的特异性。
3.筛选和扩增：将融合细胞在含有抗生素的培养基中进行筛选，以去除非融合细胞和未融合的B细胞。
然后，将融合细胞转移到含有较低抗生素浓度的培养基中，以扩增单克隆细胞株。
4.克隆：通过稀释稀释法或限稀稀释法，将单个细胞分离成单个细胞，并将其分别培养在微孔板中。
培养一段时间后，进行测序和酶联免疫吸附试验（ELISA）等测试，以筛选出产生特异性抗体的克隆。
5.生产和纯化：确定产生特异性抗体的克隆后，可以进行大规模的生产和纯化。
将克隆细胞移植到大容量培养器中，进行大规模培养。
然后，通过收集和离心等步骤收集细胞上清液，获取抗体。
6.特性和稳定性测试：对生产的抗体进行特性和稳定性测试，以确定其特异性、亲和力、稳定性和纯度等参数。
这些测试通常包括ELISA、Western blot、免疫组织化学（IHC）等。
7.应用：将制备好的单克隆抗体用于特定的应用，如免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
根据需要，可能需要对抗体进行标记，如荧光标记或酶标记，以便在特定实验中进行检测。
总之，单克隆抗体制备流程是一个复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤来获得特异性和高亲和力的抗体。
这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等领域，对于科学研究和临床应用有着重要的意义。
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备单克隆抗体的制备是蛋白质工程技术的重要研究内容，有着重要的应用价值。
单克隆抗体的制备原理是：充分发挥宿主生物体（大肠杆菌、哺乳动物细胞等）免疫功能，运用宿主中细胞免疫反应产生浓缩单克隆抗体。
一、抗原介绍1、抗原的来源：单克隆抗体的抗原来源丰富，可以是完整的抗原蛋白、抗原酶、细胞因子、小分子物质以及抗原细胞等。
2、抗原的选择：在单克隆抗体制备的过程中，选择抗原是十分重要的，需要综合考察所选抗原的抗原性、可表达性、毒性及抗击物种的范围。
二、免疫动物1、种类：动物免疫是单克隆抗体制备中的重要步骤，常用的宿主有小鼠、大鼠、兔子、猪以及山羊等。
2、准备：在实验免疫之前，需要对动物体进行一定的准备，主要包括规范动物体衣服清洁、照明、温度调节以及饲养等。
三、免疫原剂的选择1、动力学考察：实验免疫之前，需要对实验免疫抗原和抗体的动力学机制进行考察，以确定细胞免疫强度和灌注次数。
2、选择：免疫原剂的选择要根据实验的需要以及实验动物的免疫能力，可以通过单克隆抗体表位等技术进行原剂优化。
四、免疫原剂的灌注1、灌注体积：灌注体积要根据实验动物的大小和重量以及抗体细胞水平调节，以保证药物的有效抗性。
2、体外灌注：为了提高抗体的产量，需要进行体外灌注，如采用实验室常用试管灌注等方式，将相应药物注入动物体内。
五、细胞免疫1、吞噬作用：属于免疫细胞，吞噬病原体是细胞免疫杀灭病毒的关键，充分发挥宿主生物免疫功能，进而形成抗体。
2、细胞免疫诱导：当病原体进入宿主体后，需要经过几个免疫过程，从而最终诱导细胞免疫，从而产生抗体。
六、浓缩抗体1、浓缩：通过单克隆抗体分离技术，将混杂在抗原的复合抗体进行浓缩，产生有针对性的单克隆抗体。
2、纯化：要获取单克隆抗体，必须对前期产生的抗体进行纯化处理，利用配体结合和抗原亲和纯化以及膜分离等技术，产生纯度较高的单克隆抗体。
单克隆抗体的主要制备步骤
单克隆抗体的主要制备步骤
1. 购买解抗原，根据所需克隆抗体设计免疫原；
2. 免疫动物（如家兔），使免疫动物产生抗体抗原反应；
3. 收集动物血清，并从血清中抽取单克隆抗体；
4. 把抽取到的单克隆抗体配制成适合应用的格式（液体、粉末、悬浮液等）；
5. 对单克隆抗体进行纯化并测定其纯度；
6. 用ELISA等多种方法进行交叉反应性测定；
7. 进行稳定性、非特异性结合和抗原竞争的测定；
8. 制备单克隆抗体的回收量检测及吸附实验；
9. 最后进行细胞实验，确保单克隆抗体与细胞结合稳定和特异。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单抗制备
杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。
下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
单克隆抗体的制备
⑷离心，800rpm,6min；⑸弃上清，用含 20％小牛血清HAT选择培养液重悬；⑹ 将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培 养板内，每孔100ul ，放入37℃ 5％CO2 培养箱培养
（三）选择杂交瘤细胞及抗体 的检测
HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、 胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。 胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种 酶则可启动补救途径。 在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或 HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能 长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两 种酶故能生长。 抗体的检测：RIA、ELISA等。
项目
McAb和常规免疫血清抗体的比较
常规免疫血清抗 体 多克隆性 特异性识别多种 抗原决定簇 不均一性，质地 混杂 批与批之间不同 低 McAb 单克隆性 特异性识别单一 抗原决定簇 同一类属，质地 纯一 特异性高，抗体 均一 高
抗体产生细胞 抗体的结合力 免疫球蛋白类别 及亚类 特异性与亲和力 有效抗体含量
原理
酵母菌可通过旁路途径激活补体，产生 C3b，酵母菌与C3b结合形成了Y- C3b复 合物。若将此复合物与巨噬细胞共育， 因巨噬细胞表面有C3b受体，则此复合 物可结合到巨噬细胞表面形成Y-C花环。
操作方法
取小白鼠一只，于腹腔内注射1640培养基10ml， 5—10分钟内处死小白鼠抽取腹腔液。 吸0.5ml腹腔液滴于洁净玻片上，然后置于湿 盒内，放置37℃水浴箱半小时。 半小时后取出，用清水冲去玻片上多余的腹腔 液（巨噬细胞黏附于玻片上），然后加0.5ml Y-C复合物，置于4℃冰箱20分钟（这个温度 巨噬细胞的吞噬作用最弱，而不影响其结合能 力）。20分钟后取出染色（瑞姬氏染色），油 镜下观察Y-C花环。
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所
需
试
剂
：
培养液：RPM1640培养Fra bibliotek，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液
细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同
单克隆抗体的制备步骤
2:配制方案度：过D高M而EM死亡:血清：DMSO=7：2：1
“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 保存数年至数十年.
“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复
苏.
单克隆抗体的制备步骤 八：如何得到大量的单克隆抗体？
动物体内诱生法：使用的 动物当然首选BALB/c小 鼠 ,将杂交瘤细胞接种于 小鼠腹腔内，在小鼠腹腔 内生长杂交瘤，并产生腹 水，因而可得到大量的腹 水单抗且抗体浓度很高。
每次亚克隆后要进行细胞的冻存保种
单克隆抗体的制备步骤
七：杂交瘤细胞的冻存与复苏
细胞冷冻的意义
1，：来在不建及防立染非对止杂色分所污体泌交有染丢细瘤的失胞细、杂、的胞交防过避的止度瘤免过细程胞中作，进有一时步一的次工融作合，产需生要很把多其“中阳一性部”分孔细 胞冻存生起长来、；防另止一细方胞面密，为了防止实验室可能发生的意外事故。
胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗 体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失
单克隆抗体的制备步骤
六：亚克隆
筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细胞 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔 按上述方法进行第二，第三次亚克隆 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养
取出腹水,立即离心,去除 上层的腹腔脂肪,下层有 时会出现细胞,除去。 离心后马上进行纯化。
单克隆抗体的制备步骤
九：单克隆抗体的纯化
饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。
利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经 固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上, 凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带 电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白 质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度 盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离 辛酸一饱和硫酸铵法 _在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋 白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫 酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。
体外培养法： a、悬浮培养法 b、微载体培养法
Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞培养系统
收集细胞培养瓶中的杂交瘤细胞以备注入小鼠腹腔诱生腹水时,一定要用 无血清培养液多离心几次,将细胞培养液含有的牛血清洗净,防止牛血清进入 了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的选择上一定要选择活力好、腹腔大的小鼠。当 小鼠腹腔开始发胀后,每天密切关注小鼠状态,
三.细胞融合 步骤
● ·1：饲养细胞为小鼠的 腹腔巨噬细胞。
单克隆抗体的制备步骤
三.细胞融合
1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液
单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
ELISA方法筛选阳性孔
单克隆抗体的制备步骤
四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
阳性孔 间接ELISA方法筛选阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆
是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细
单克隆抗体的制备步骤
一：免疫原的制备 ：
1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于 5000Da生物物质
2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质
3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产 生可应用的高效价的抗体
单克隆抗体的制备步骤
二.动物免疫
免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。
免疫程序： 免疫剂量、免疫途径、免疫次数、 间隔时间、佐剂的选择。
单克隆抗体的制备步骤 抗原接种
单克隆抗体的制备步骤
三：细胞融合
细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG 融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤 细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行 大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制 奠定了坚实的基础。
单克隆抗体的制备
什么是单克隆抗体？
1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细
胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单 克隆抗体。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量 供应。
单克隆抗体制备原理
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单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但 是还可以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。